基于HPLC-MS的消巖湯在正常大鼠體內(nèi)藥動學(xué)研究

牛小玉，楊佩穎，孔凡銘，韓增風(fēng)，查春媛，李小江，賈英杰，孫彬栩*

基于HPLC-MS的消巖湯在正常大鼠體內(nèi)藥動學(xué)研究

牛小玉1, 2，楊佩穎1, 2，孔凡銘1, 2，韓增風(fēng)1, 2，查春媛1, 2，李小江1, 2，賈英杰1, 2，孫彬栩1, 2*

1. 天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300381 2. 國家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300381

研究消巖湯中的有效成分并分析其在正常大鼠體內(nèi)的代謝情況，從而初步探究消巖湯中抗腫瘤有效成分及其代謝規(guī)律。取12只雄性Wistar大鼠隨機分為實驗組及對照組，實驗組ig消巖湯濃縮液，對照組ig單藥黃芪（消巖湯中君藥）濃縮液；給藥后于不同時間點目內(nèi)眥取血0.5 mL，采用液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）技術(shù)測定大鼠體內(nèi)不同時間點黃芪甲苷、咖啡酸的濃度，得血藥濃度-時間數(shù)據(jù)，采用DSA 2.0軟件計算血漿藥動學(xué)參數(shù)。實驗組大鼠血漿中黃芪甲苷的消除速率常數(shù)（）、清除率（CL/F）均小于對照組（＜0.05、0.01），消除半衰期（l/2β）、表觀分布容積（V/F）、max、藥時曲線下面積（AUC）均大于對照組（＜0.05、0.01、0.001），兩組的達峰時間（max）相同。實驗組大鼠血漿中咖啡酸的CL/F小于對照組（＜0.01），l/2β、V/F、AUC、、max均大于對照組（＜0.05、0.01、0.001）。消巖湯能夠促進其抗腫瘤成分黃芪甲苷、咖啡酸的吸收代謝。

消巖湯；藥動學(xué)；黃芪甲苷；咖啡酸；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院賈英杰教授基于濁邪致病，提出癌濁理念及以“黜濁培本”為主的治癌法則[1]。認為正氣虧虛是癌瘤發(fā)生的核心，在此基礎(chǔ)上加之致癌因素的刺激，導(dǎo)致機體臟腑失調(diào)，三焦氣化失司，從而內(nèi)生濁邪。濁邪易阻礙氣機升降，影響氣血運行，運行不暢則生成瘀濁、濁毒等病理產(chǎn)物，邪濁膠結(jié)難化，久羈為患，變生“癌濁”，最終發(fā)為癌瘤[2]。賈英杰教授秉承“黜濁培本”治癌理念，創(chuàng)抑瘤驗方——消巖湯[3]。消巖湯以“扶正與祛邪相結(jié)合”為主[4]，方中以黃芪、太子參為君，治以益氣養(yǎng)陰，扶正抗癌；夏枯草、生牡蠣、白花蛇舌草清熱解毒抗癌；郁金、姜黃行氣散結(jié)祛瘀；蜂房祛風(fēng)、攻毒、止痛，以搜剔脈絡(luò)中之瘀毒[5]。全方配合使用，扶正祛邪兼具，充分體現(xiàn)了中醫(yī)整體觀念。臨床應(yīng)用消巖湯能夠起到穩(wěn)定原發(fā)病灶、阻止遠處轉(zhuǎn)移等作用，配合放化療應(yīng)用療效更佳，同時能夠改善機體免疫力、減輕放化療不良反應(yīng)，從而提高患者治療依從性，改善患者生存質(zhì)量[6-8]。

既往以“消巖湯臨床療效”為基礎(chǔ)，對其治療惡性腫瘤的藥效與機制從宏觀和微觀的角度進行了初步研究。研究結(jié)果顯示，消巖湯在臨床上治療肺癌、肝癌、惡性淋巴瘤、消化道及婦科惡性腫瘤等均具有較好的療效[9]。在配合放化療使用時有明顯的減毒增效作用，用藥安全，無不良反應(yīng)發(fā)生。同時，研究還顯示，實驗動物應(yīng)用消巖湯后，免疫功能得到明顯提升，保護了實驗動物的免疫器官。其中提前7 d運用消巖湯配合化療療效更好[10]。另外，與單純化療相比，在化療前治療性應(yīng)用消巖湯對Lewis肺癌小鼠有明顯的抗腫瘤作用，生長活動狀況也較好[11]。消巖湯與化療聯(lián)合應(yīng)用能夠減輕晚期非小細胞肺癌的臨床癥狀[12]，提高功能狀態(tài)評分，穩(wěn)定病灶，并可抑制患者血管生長因子的表達，減輕造血系統(tǒng)的不良反應(yīng)，提高患者生活質(zhì)量。消巖湯還可通過抑制腫瘤炎性微環(huán)境中轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）/Smad3信號通路來影響非小細胞肺癌的轉(zhuǎn)移，明顯降低臨床轉(zhuǎn)移風(fēng)險[13]。消巖湯聯(lián)合大株紅景天注射液能夠明顯改善患者血液高凝狀態(tài)[14]。消巖湯通過減少炎癥細胞因子產(chǎn)生，改善肺癌惡病質(zhì)患者肌肉蛋白質(zhì)降解，從而改善肺癌惡病質(zhì)狀態(tài)[15]。消巖湯可改變肺癌細胞對順鉑的敏感性，從而逆轉(zhuǎn)肺癌順鉑耐藥[16]。

為了研究消巖湯的基本藥動學(xué)性質(zhì)，并為消巖湯藥效學(xué)和臨床實驗提供基礎(chǔ)理論參數(shù)，本研究通過采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測定大鼠體內(nèi)黃芪甲苷、咖啡酸不同時間點的質(zhì)量濃度，研究消巖湯復(fù)方及單用君藥黃芪對黃芪甲苷、咖啡酸在大鼠體內(nèi)代謝的影響，從而初步探究消巖湯復(fù)方對其抗腫瘤有效成分代謝的影響。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，6～8周齡，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心提供。動物于天津中醫(yī)藥大學(xué)動物中心常規(guī)喂養(yǎng)，自由進食飲水，10 h光照/14 h黑暗，溫度21～25 ℃，濕度30%～70%。動物實驗遵循天津中醫(yī)藥大學(xué)有關(guān)實驗動物管理和使用的規(guī)定，均符合3R原則。

1.2 藥品與試劑

普萘洛爾（批號101181527）購自上海玉博生物科技有限公司；對照品黃芪甲苷（批號110781-200613）、咖啡酸（批號110885-200102）購自中國藥品食品鑒定研究所，質(zhì)量分數(shù)為98.0%；乙腈（批號113911）為色譜純，購自美國Thermo Fisher Scientific公司；去離子水由Milli-Q制備；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.3 藥材

實驗所用中藥藥材均由天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)竇志英教授鑒定，黃芪為豆科植物蒙古黃芪(Fisch.) Bge. var.(Bge.) Hsiao的干燥根、太子參為石竹科植物孩兒參(Miq.) Pax ex Pax et Hoffm.的干燥塊根、郁金為姜科植物溫郁金Y. H. Chen et C. Ling的干燥塊根、姜黃為姜科植物姜黃L.的干燥根莖、夏枯草為唇形科植物夏枯草L.的干燥果穗、白花蛇舌草為茜草科植物白花蛇舌草(Willd.) Roxb.的全草、生牡蠣為牡蠣科動物長牡蠣Thunberg的貝殼、蜂房為胡蜂科昆蟲果馬蜂(DeGeer)的干燥巢。

1.4 儀器

島津LC-2010A型高效液相色譜儀（日本島津公司），含LC-20AT泵、SPD-20A紫外檢測器、SIL-20A全自動進樣器、LC色譜工作站；Quattro質(zhì)譜儀（美國Waters公司）；TGL-16G型離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；XK96-B型渦旋混合器（姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司）；BP211D型分析天平（德國Sartorius公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 受試藥液的制備

2.1.1 實驗組ig溶液的制備 取消巖湯全方140 g，其中黃芪30 g、太子參15 g、郁金10 g、姜黃10 g、夏枯草15 g、白花蛇舌草15 g、生牡蠣30 g、蜂房15 g，混勻，浸泡1 h后煎煮2次，煎煮過程中每次加水量為藥材量的10倍，煎煮時間為1 h，濾出藥渣后合并煎液，濃縮至100 mL即質(zhì)量濃度為1.4 g/mL，隨后用95%乙醇醇沉，將藥液調(diào)至含乙醇75%，靜置24 h后濾過，藥液濃縮至35 mL，即質(zhì)量濃度達到黃芪生藥0.85 g/mL，備用。

2.1.2 對照組ig溶液的制備 取黃芪30 g，按“2.1.1”項下方法制備，將藥液濃縮至35 mL，即質(zhì)量濃度達到黃芪生藥0.85 g/mL，備用。

2.2 給藥及樣品收集

取12只Wistar大鼠，禁食不禁水12 h后隨機分為對照（14.40 g/kg）組及實驗（14.40 g/kg）組，每組6只。實驗組ig“2.1.1”項下溶液，對照組ig“2.1.2”項下溶液，并于給藥后0.17、0.33、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24 h，目內(nèi)眥取血0.5 mL，8000 r/min離心10 min，取上清液冷凍備用。

2.3 血漿樣品處理

取50 μL血漿樣品，加入150 μL 內(nèi)標(biāo)[普萘洛爾溶于甲醇-乙腈（1∶1），配制成質(zhì)量濃度為5 ng/mL的溶液]，渦旋30 s，15 000 r/min離心10 min，取上清液進樣。

2.4 對照品及內(nèi)標(biāo)溶液的制備

2.4.1 對照品儲備液的配制 分別稱取黃芪甲苷、咖啡酸對照品，制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對照品儲備液。

2.4.2 內(nèi)標(biāo)儲備液的配制 精密稱取普萘洛爾對照品100.00 mg，置于100 mL量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL的內(nèi)標(biāo)儲備液。

2.5 測定條件

2.5.1 色譜條件 XSelect HSS T3色譜柱（75 mm×2.1 mm，2.5 μm），流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～1.8 min，95% A；1.8～2.8 min，95%～20% A；2.8～4.0 min，20%～5% A；4.0～4.9 min，5% A；4.9～5.0 min，5%～95% A；5.0～8.0 min，95% A。體積流量0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量5 μL。

2.5.2 質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧離子源（ESI），采用多反應(yīng)監(jiān)測模式，在正、負離子模式下同時檢測。離子源溫度120 ℃；噴霧電壓3.2 kV、?2.8 kV；載氣為氮氣；脫溶劑溫度350 ℃；脫溶劑氣體積流量650 L/h；錐孔氣體積流量50 L/h。具體參數(shù)見表1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 專屬性考察 將處理后的黃芪甲苷血漿樣品、咖啡酸血漿樣品及普奈洛爾分別進樣，得到黃芪甲苷血漿樣品、咖啡酸血漿樣品及普奈洛爾（內(nèi)標(biāo)）的MRM譜圖（圖1），黃芪甲苷、咖啡酸和普萘洛爾的保留時間（R）分別為3.625、2.025、2.55 min。主峰與血漿中雜質(zhì)呈基線分離，且在內(nèi)標(biāo)和被測色譜峰周圍沒有雜質(zhì)峰干擾，表明專屬性良好。

圖1 黃芪甲苷血漿樣品 (A)、咖啡酸血漿樣品(B)及普奈洛爾(C)的MRM譜圖

2.6.2 線性關(guān)系考察 取16份空白血漿0.30 mL，其中8份加入黃芪甲苷對照品儲備液和內(nèi)標(biāo)儲備液100 μL，另8份加入咖啡酸對照品儲備液和內(nèi)標(biāo)儲備液100 μL，使黃芪甲苷終質(zhì)量濃度分別為1、2、5、10、20、50、80、100 ng/mL，咖啡酸終質(zhì)量濃度分別為5、10、20、50、80、120、160、200 ng/mL。按“2.3”項方法處理，根據(jù)各樣品MRM圖譜，以血漿樣品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值分別對黃芪甲苷及咖啡酸質(zhì)量濃度進行線性回歸。

黃芪甲苷質(zhì)量濃度在1～100 ng/mL，黃芪甲苷質(zhì)量濃度與黃芪甲苷峰面積和普萘洛爾峰面積的比值呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為＝0.073 439＋0.006 057，＝0.999 2?？Х人豳|(zhì)量濃度在5～200 ng/mL，咖啡酸質(zhì)量濃度與咖啡酸峰面積和普萘洛爾峰面積的比值呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為＝0.003 65＋0.015 86，＝0.999 6。表明黃芪甲苷及咖啡酸在相應(yīng)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6.3 精密度及回收率考察 分別取低、中、高3個質(zhì)量濃度的黃芪甲苷（2、10、80 ng/mL）及咖啡酸（10、50、160 ng/mL）進樣，每個質(zhì)量濃度樣品在1 d內(nèi)重復(fù)測定3次，連續(xù)測定3 d，計算日內(nèi)、日間精密度和回收率，結(jié)果見表2，日內(nèi)及日間RSD均在6%以內(nèi)，回收率為88.78%～107.50%，可滿足血漿樣品分析要求。

2.6.4 提取回收率考察 取空白血漿樣品9份，每份300 μL，高、中、低3個質(zhì)量濃度分別平行操作3份，黃芪甲苷質(zhì)量濃度分別為2、10、80 ng/mL，咖啡酸質(zhì)量濃度分別10、50、160 ng/mL，分別加入內(nèi)標(biāo)工作液100 μL和高、中、低3個質(zhì)量濃度的黃芪甲苷、咖啡酸對照品儲備液50 μL，按“2.3”項下方法處理，以萃取后的黃芪甲苷、咖啡酸的色譜峰面積與萃取前相應(yīng)質(zhì)量濃度的黃芪甲苷、咖啡酸對照品儲備液的色譜峰面積比值計算高、中、低3個質(zhì)量濃度黃芪甲苷、咖啡酸的提取回收率見表3，RSD均＜6%。

表2 大鼠血漿樣品黃芪甲苷及咖啡酸精密度和回收率(, n = 3)

2.6.5 穩(wěn)定性考察

（1）室溫放置穩(wěn)定性：取黃芪甲苷（2、10、80 ng/mL）及咖啡酸（10、50、160 ng/mL）血漿樣品，在室溫放置4 h后按“2.3”項處理，測定結(jié)果見表4，RSD在4.5%以內(nèi)，提示黃芪甲苷、咖啡酸血漿樣品在室溫放置4 h內(nèi)穩(wěn)定。

表3 大鼠血漿樣品黃芪甲苷及咖啡酸的提取回收率(, n = 3)

表4 黃芪甲苷及咖啡酸血漿樣品的穩(wěn)定性考察(, n = 3)

（2）凍融穩(wěn)定性：取黃芪甲苷（2、10、80 ng/mL）及咖啡酸（10、50、160 ng/mL）血漿樣品各3份，分別凍融1次、反復(fù)凍融3次，按“2.3”項下方法處理，結(jié)果顯示，RSD均在4.0%以內(nèi)，提示黃芪甲苷、咖啡酸血漿樣品反復(fù)凍融3次對測定結(jié)果無明顯影響。

（3）血漿樣品處理后低溫放置穩(wěn)定性：取黃芪甲苷（2、10、80 ng/mL）及咖啡酸（10、50、160 ng/mL）血漿樣品各3份，?4 ℃放置16 h后按“2.3”項下方法處理，結(jié)果顯示，RSD在4%以內(nèi)，提示經(jīng)處理后的血漿樣品在?4 ℃放置16 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 藥動學(xué)研究

2.7.1 黃芪甲苷房室模型及藥動學(xué)參數(shù) 如表5和圖2所示，實驗組血藥達峰濃度（max）為18.555 ng/mL，對照組max為6.169 ng/mL。實驗組黃芪甲苷的消除速率常數(shù)（）、清除率（CL/F）小于對照組（＜0.05、0.01），消除半衰期（l/2β）、表觀分布容積（V/F）、max、藥時曲線下面積（AUC）均大于對照組（＜0.05、0.01、0.001），兩組的達峰時間（max）相同。根據(jù)AIC最小、相關(guān)系數(shù)最大等指標(biāo)，應(yīng)用DAS 2.0程序軟件對藥時曲線進行分析，進行最佳房室模型擬合，實驗組芪甲苷的體內(nèi)過程符合二室模型，對照組黃芪甲苷的體內(nèi)過程符合一室模型。

表5 黃芪甲苷藥動學(xué)參數(shù)(, n = 6)

與對照組比較：*＜0.05**＜0.01***＜0.001，下表同

*< 0.05**< 0.01***< 0.001control group, same as below table

圖2 黃芪甲苷藥時曲線(, n = 6)

2.7.2 咖啡酸房室模型及藥動學(xué)參數(shù) 如表6和圖3所示，實驗組max為75.155 ng/mL，對照組max為18.783 ng/mL。實驗組咖啡酸的CL/F小于對照組（＜0.01），l/2β、V/F、AUC、、max、大于對照組（＜0.05、0.01、0.001）。根據(jù)AIC最小、相關(guān)系數(shù)最大等指標(biāo)進行最佳房室模型擬合，應(yīng)用DAS 2.0程序軟件對藥時曲線進行分析，實驗組咖啡酸的體內(nèi)過程符合二室模型，對照組咖啡酸的體內(nèi)過程符合一室模型。

3 討論

液相色譜儀分離能力強，分析速度高，且分析精確度好，適用樣品范圍廣，能回收，但難以得到物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息。質(zhì)譜儀能夠提供豐富的結(jié)構(gòu)信息，能提供樣品分子的相對分子質(zhì)量信息，靈敏高，但需要純化樣品。本研究采用液質(zhì)聯(lián)用法，能夠?qū)崿F(xiàn)優(yōu)勢互補，樣品處理簡單，經(jīng)濟，合理，同時使用內(nèi)標(biāo)（普萘洛爾）法定量，減輕樣品前處理的壓力，適用于測定生物樣品（大鼠血漿）中黃芪甲苷、咖啡酸的含量，靈敏度高，特異性突出，定性定量結(jié)果可靠，且快速簡便，高自動化，回收率高。

表6 咖啡酸藥動學(xué)參數(shù)(, n = 6)

圖3 咖啡酸藥時曲線(, n = 6)

藥動學(xué)結(jié)果顯示，給藥組黃芪甲苷及咖啡酸max均高于對照組，其中實驗組及對照組黃芪甲苷max同時達到，而實驗組咖啡酸max小于對照組。實驗組黃芪甲苷及咖啡酸血藥濃度下降的速度較對照組緩慢且平穩(wěn)。表明消巖湯中黃芪甲苷及咖啡酸質(zhì)量濃度均高于單用君藥黃芪，且ig消巖湯后黃芪甲苷及咖啡酸max均高于單藥黃芪，為消巖湯藥效學(xué)和臨床實驗提供基礎(chǔ)理論參數(shù)。既往研究表明消巖湯有明顯的抑瘤作用，本研究從宏觀與微觀的角度對消巖湯中有效成分黃芪甲苷、咖啡酸治療惡性腫瘤的藥效與機制進行初步研究，可見消巖湯復(fù)方配伍較單用君藥能夠影響其抗腫瘤成分的代謝，能夠促進黃芪甲苷、咖啡酸的吸收代謝，而消巖湯中有效成分復(fù)雜，其余成分的影響有待進一步研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Pharmacokinetic study of Xiaoyan Decoction on normal rats based on HPLC-MS

NIU Xiao-yu1, 2, YANG Pei-ying1, 2, KONG Fan-ming1, 2, HAN Zeng-feng1, 2, CHA Chun-yuan1, 2, LI Xiao-jiang1, 2, JIA Ying-jie1, 2, SUN Bin-xu1, 2

1. The First Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300381, China 2. National Clinical Research Center of Chinese Acupuncture and Moxibustion, Tianjin 300381, China

To study the effective components in Xiaoyan Decoction (消巖湯) and analyze its metabolism in normal rats, so as to preliminarily explore the anti-tumor effective components in Xiaoyan Decoction and its metabolism law.Twelve male Wistar rats were randomly divided into experimental group and control group. Rats in experimental group were ig Xiaoyan Decoction and control group was ig principal drug in Xiaoyan Decoction-Huangqi (). After administration, 0.5 mL of blood was collected from canthus at different time points. The concentrations of astragaloside IV and caffeic acid in rats at different time points were determined by LC-MS, and blood concentration-time data were obtained. The plasma pharmacokinetic parameters were calculated by DSA 2.0 software.The elimination rate constant () and clearance rate (CL/F) of astragaloside IV in experimental group were lower than those in control group (< 0.05, 0.01), and elimination half-life (l/2β), apparent distribution volume (V/F),maxand area under the drug-time curve (AUC) were higher than those in control group (< 0.05, 0.01, 0.001), peak time (max) of two groups was the same. CL/F of caffeic acid in plasma of rats in experimental group was lower than that of control group (< 0.01), whilel/2β, V/F, AUC,andmaxwere higher than those of control group (< 0.05, 0.01, 0.001).Xiaoyan Decoction can promote the absorption and metabolism of anti-tumor components astragaloside IV and caffeic acid.

Xiaoyan Decoction; pharmacokinetics; astragaloside IV; caffeic acid; liquid chromatography-mass spectrometry

R285.61

A

0253 - 2670(2022)22 - 7129 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.22.016

2022-05-11

國家自然科學(xué)基金資助項目（81904151）

牛小玉，碩士研究生，主要從事中西醫(yī)結(jié)合腫瘤臨床工作。E-mail: nxy18329700709@163.com

孫彬栩，副主任醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合腫瘤學(xué)研究。E-mail: sunbinxu@126.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]