豬戊型肝炎的診斷技術(shù)研究

謝春芳 周佳明 于瑞嵩 董世娟 陳冰清 李震*

（1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106；2上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物遺傳工程研究室，上海 201106；3上海市金山區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 201500）

戊型肝炎病毒（Hepatitis E Virus，HEV）是引起急性肝炎的病原之一，在全球范圍內(nèi)廣泛傳播流行，其宿主范圍眾多，可在人類、家畜、家禽、寵物和各種野生動(dòng)物中感染并跨種傳播、蔓延擴(kuò)散，易造成戊型肝炎的爆發(fā)和散發(fā)[1]。其中，人源和豬源的HEV的基因同源性較高，故HEV可在人群和豬群中自由傳播而不受物種屏障制約[2-5]。

我國是豬戊型肝炎和人戊型肝炎的高發(fā)流行區(qū)，例如，在新疆南部爆發(fā)的一次豬戊型肝炎，導(dǎo)致當(dāng)?shù)刎i戊型肝炎抗體陽性率高達(dá)80%以上，致使700多人死亡、12萬人感染[6-7]。因此，清除豬戊型肝炎，對(duì)于我國維持一個(gè)健康安全的養(yǎng)殖環(huán)境和人畜和諧相處的公共環(huán)境是非常關(guān)鍵和必要的。但是，如何建立一個(gè)兼具特異性、敏感性和穩(wěn)定性的豬HEV檢測(cè)診斷方法，目前還沒有一個(gè)比較統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，且如何區(qū)分豬戊型肝炎是急性還是慢性，對(duì)凈化豬場(chǎng)HEV有非常重要的意義。感染急性戊型肝炎的普通豬大概率可以自愈，并可清除自身體內(nèi)的HEV；而感染慢性戊型肝炎的病豬則不同，由于病豬的免疫能力受損，HEV會(huì)長期存在于病豬體內(nèi)，無法被完全清除，從而成為一個(gè)長期的傳染源。在此背景下，筆者通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，擬對(duì)豬戊型肝炎的臨床癥狀、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法、診斷及評(píng)估方法等進(jìn)行總結(jié)介紹，以期為建立一個(gè)準(zhǔn)確快速的豬戊型肝炎檢測(cè)診斷標(biāo)準(zhǔn)提供理論依據(jù)。

1 豬戊型肝炎的臨床癥狀

豬感染戊型肝炎的臨床癥狀與人感染戊型肝炎的臨床癥狀類似，但是，普通豬感染HEV后通常不表現(xiàn)出典型的臨床癥狀。其中，急性戊型肝炎病豬表現(xiàn)出發(fā)燒、腹瀉、黃疸、病毒血癥，肝組織表現(xiàn)出局灶性或散在性壞死，肝細(xì)胞變性，肝小葉中央靜脈淤血，肝小葉間或肝小葉內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤等；免疫功能低下或合并感染其他病毒的病豬，還會(huì)出現(xiàn)慢性HEV感染和肝外疾病，且肝組織會(huì)纖維化，最終發(fā)展為肝硬化和急性重度肝衰竭[8-10]。

值得注意的是，豬HEV與其他肝炎病毒共同感染引起的病豬臨床癥狀有的與豬急性戊型肝炎相似，故病豬的臨床癥狀只能作為參考，不能作為診斷依據(jù)，要準(zhǔn)確判斷豬戊型肝炎還需依靠實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

2 豬HEV的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

2.1 豬HEV抗體檢測(cè)

目前，酶聯(lián)免疫吸附分析（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）因檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、靈敏、特異性強(qiáng)，可檢測(cè)血清或體液分泌物中許多病毒的抗原抗體，而被廣泛應(yīng)用于血清學(xué)診斷研究。因此，ELISA是豬HEV抗體檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法，也是主要方法之一，可分別檢測(cè)豬HEV特異性的中和抗體（主要是HEV-IgM和HEV-IgG）。一般來說，豬HEV ELISA抗體檢測(cè)試劑盒一天可檢測(cè)幾百份樣品，可迅速判斷被檢樣品中豬HEV-Ig G或豬HEV-IgM的檢測(cè)結(jié)果[11]。

其他可以用于檢測(cè)豬HEV抗體的方法還有免疫熒光檢測(cè)法（immunofluorescence assay, IFA）、免疫色譜分析法（又稱免疫親和層析技術(shù)，immunoaffinity chromatography）和高通量中和分析（high-throughput neutralization assay）。其中，高通量中和分析具有檢測(cè)快捷和結(jié)果準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì)，但因其所需儀器價(jià)格比較昂貴，目前在國內(nèi)外并沒得到廣泛應(yīng)用，在未來若儀器改進(jìn)、價(jià)格下降，此方法將具有廣闊的發(fā)展前景[12]。

2.2 豬HEV病原檢測(cè)

既靈敏又準(zhǔn)確地檢測(cè)豬HEV病原的方法就是檢測(cè)其病毒核酸RNA，其中，RT-PCR是常用且可靠的病毒核酸RNA檢測(cè)方法，既可用以檢測(cè)豬血清或糞便樣品中有無豬HEV核酸RNA，又可定性和定量分析，更可檢測(cè)出較低的豬H E V核酸RNA濃度（低至7 IU/mL）。一般來說，擴(kuò)增引物通常選擇在豬HEV的ORF2基因保守區(qū)域，基因擴(kuò)增采用巢式PCR，設(shè)計(jì)內(nèi)外二對(duì)擴(kuò)增引物，以提高檢測(cè)靈敏度[13-16]。檢測(cè)到豬HEV核酸RNA后，對(duì)結(jié)果為陽性的樣品，還需對(duì)擴(kuò)增序列進(jìn)行測(cè)序比對(duì)，以進(jìn)一步驗(yàn)證確認(rèn)是否為豬HEV核酸RNA序列，且得到的基因序列還可進(jìn)行基因分析，以追溯基因的起源及遺傳分化（HEV分為8個(gè)基因型，至少有36個(gè)基因亞型，這些不同基因型之間的差異原由、相互之間的交叉感染機(jī)理等，均有待進(jìn)一步研究探索[17-18]）。

其他可用于檢測(cè)豬HEV病原的方法還有高通量分子測(cè)序技術(shù)、全自動(dòng)核酸檢測(cè)系統(tǒng)、豬HEV抗體片段包的ELISA法、免疫印跡分析（Western blotting）和電鏡分析。其中，高通量分子測(cè)序技術(shù)是一種深度測(cè)序方法，對(duì)全基因組的測(cè)序能保留最原始的特性，具有高準(zhǔn)確性、高靈敏度的優(yōu)勢(shì)；全自動(dòng)核酸檢測(cè)系統(tǒng)能自動(dòng)完成從樣本處理到擴(kuò)增、檢測(cè)的一系列操作步驟，可用于特定HEV核酸分子的檢測(cè)與分析[19]，但目前此方法還沒有被廣泛應(yīng)用。

2.3 豬ALT水平檢測(cè)

丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine transaminase，ALT）是檢測(cè)肝功能的重要指標(biāo)之一。健康豬的ALT水平在（33±3）U/L，豬感染HEV后血清中的ALT水平會(huì)略微升高，故ALT水平可作為豬HEV的輔助檢測(cè)項(xiàng)目，也可作為肝功能的相關(guān)指標(biāo)與流行病學(xué)史等一起用于綜合診斷[20-21]。

2.4 豬HEV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的注意事項(xiàng)

具體為：（1）避免豬HEV感染潛伏期的漏診。豬HEV感染潛伏期漏診是造成豬HEV檢測(cè)結(jié)果為假陰性的主要原因之一，故需開展周期性的重復(fù)檢測(cè)。（2）需對(duì)豬HEV核酸RNA進(jìn)行測(cè)序分型。HEV只有1個(gè)血清型，但有8個(gè)基因型和許多亞基因型，不同動(dòng)物對(duì)不同基因型HEV的易感性有所差別，故對(duì)豬H E V核酸R N A進(jìn)行測(cè)序分型，有利于進(jìn)行HEV的感染溯源追蹤和病毒演變分化研究。

3 豬戊型肝炎的診斷及評(píng)估

3.1 豬急性、慢性戊型肝炎的診斷

可通過RT-PCR檢測(cè)豬HEV核酸RNA，并結(jié)合豬HEVIgM和IgG抗體水平進(jìn)行綜合判定。

在實(shí)驗(yàn)室條件下，豬感染HEV后，最早于感染0.5周后在血液和糞便樣品中可檢測(cè)到豬HEV核酸RNA，于感染2周后在糞便中可檢測(cè)到豬HEV核酸RNA，于感染4周后在血清中可檢測(cè)到豬HEV核酸RNA，且感染3～6周后病原消失，故能檢測(cè)到豬HEV核酸RNA的主要為4月齡以下的豬，6月齡以上的豬在糞便和血清樣品中未見檢測(cè)到豬HEV核酸RNA的文獻(xiàn)報(bào)道，豬急性戊型肝炎轉(zhuǎn)為慢性戊型肝炎的病例也未見報(bào)道[22-23]。以上結(jié)果說明，豬急性戊型肝炎主要集中在4月齡以下的豬群中。同時(shí)，在實(shí)驗(yàn)室條件下，豬感染HEV后，HEV抗體從感染后第2周開始出現(xiàn)，并會(huì)一直持續(xù)到第5周（但1月齡以下的仔豬檢測(cè)不出HEV抗體）。其中，HEVIgM抗體會(huì)很快降低到無法檢出，而HEVIgG抗體則會(huì)一直存在于血清中。因此，區(qū)分豬急性戊型肝炎和豬慢性戊型肝炎，除豬HEV核酸RNA的檢測(cè)結(jié)果外，還要結(jié)合豬HEV抗體的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行綜合判定，單純的豬HEV核酸RNA檢測(cè)或單純的豬HEV抗體檢測(cè)，均可能導(dǎo)致誤判[24]。

具體來說，在同時(shí)檢測(cè)到豬HEV核酸RNA和HEVIgM抗體時(shí)，即可判定為豬急性戊型肝炎。而當(dāng)豬HEVIgM抗體已降低至無法檢出時(shí)，即豬HEVIgM抗體檢測(cè)結(jié)果為陰性，豬HEVIgG抗體檢測(cè)結(jié)果為陽性[可長期（約2年）檢測(cè)到豬HEVIgG抗體[25]]，豬HEV核酸RNA檢測(cè)結(jié)果為陽性時(shí)，表明病豬的免疫系統(tǒng)已無法清除豬HEV病毒，即可判定為豬慢性戊型肝炎。

考慮到病毒潛伏期造成的漏診、誤診，需要進(jìn)行多次重復(fù)檢測(cè)，以排除潛伏期的假陰性結(jié)果。

3.2 豬戊型肝炎診斷結(jié)果的評(píng)估

對(duì)豬戊型肝炎診斷結(jié)果的評(píng)估，可使用定量RT-PCR作為參考標(biāo)準(zhǔn)，通過計(jì)算總體一致性百分比、敏感性、特異性、陽性預(yù)測(cè)值（PPV）、陰性預(yù)測(cè)值（NPV）和Cohen’s kappa統(tǒng)計(jì)量，來評(píng)估每個(gè)分析的性能，并得出交叉表，從而進(jìn)行診斷結(jié)果的評(píng)估。

4 小 結(jié)

豬戊型肝炎與人戊型肝炎的基因同源性非常高，豬HEV可跨種傳播感染人類，且豬HEV傳播感染到人類后，其毒力會(huì)大大增強(qiáng)[26]，從而給公共衛(wèi)生安全帶來了極大隱患。另外，由于目前還沒有用于動(dòng)物的HEV疫苗。因此，準(zhǔn)確有效地診斷出豬戊型肝炎，盡快隔離、清除受豬HEV感染的病豬，避免其他健康豬受到豬HEV的感染就顯得尤為重要。這樣不僅可以保障養(yǎng)殖環(huán)境的健康安全，保證豬源性食物產(chǎn)品源頭的健康安全，也是切斷人感染戊型肝炎的關(guān)鍵措施之一。