海蒿子多糖提取、純化及其藥理活性研究進(jìn)展

孔麗，朱月霞，周冰雪，劉志，薛旺遷，石錦峰，鄭家勤，李姣姣，吉敬，秦昆明，3，董自波，3，沈金陽(yáng),3*

(1.江蘇海洋大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 連云港 222000；2.連云港貴科藥業(yè)有限公司，江蘇 連云港 222000；3. 江蘇省海洋藥用資源開(kāi)發(fā)工程研究中心，江蘇 連云港 222005)

海蒿子Sargassumpallidum隸屬于褐藻門(mén)Rhaeophyta馬尾藻科Sargassaceae馬尾藻屬Sargassum。海蒿子植物形態(tài)呈皺縮卷曲，長(zhǎng)度為30～60 cm；圓柱形主干，兩側(cè)發(fā)出主枝，主枝葉腋處生出側(cè)枝；單葉互生，初生葉和次生葉呈披針形或線形，固著器呈盤(pán)狀，黑褐色氣囊直徑為2～5 mm，呈球形或倒卵形(圖1)。海蒿子生長(zhǎng)于潮間帶的石沼中和大干潮線下1～4 m深處的巖石上，為多年生海藻[1]，主產(chǎn)于中國(guó)黃海、渤海沿岸海域，其他海域也有少量分布[2]。干燥海蒿子水浸后膨脹，具有黏滑、柔軟和味咸等特點(diǎn)[3]。海蒿子具有化痰軟堅(jiān)、消癭散結(jié)和利水消腫等功效，被用于治療痰飲水腫、癭瘤、腳氣和小便不利等疾病，1963年版《中國(guó)藥典》將海蒿子同羊棲菜作為中藥海藻的主流品種收入正品藥材[2，4]。海蒿子為褐藻的典型代表，系統(tǒng)地研究其多糖活性和結(jié)構(gòu)，對(duì)褐藻多糖的開(kāi)發(fā)利用具有積極意義[3]。

對(duì)海蒿子多糖(SPP)的研究較多，通過(guò)傳統(tǒng)的水提法、酸提法，以及新穎的超聲波、微波輔助、超臨界流體萃取技術(shù)等提取海蒿子多糖，采用沉淀法、柱色譜法等進(jìn)行純化，可分離出不同的多糖組分[4-5]。大量研究發(fā)現(xiàn)，海蒿子多糖提取物具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖、降血脂和調(diào)節(jié)免疫功能等藥理作用[4-7]。劉斌[5]在不同提取溫度和乙醇含量下，用醇沉法獲得性質(zhì)不同的褐藻糖膠，并通過(guò)噻唑藍(lán)(MTT)法分析發(fā)現(xiàn)，硫酸基含量最高的海蒿子多糖組分對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制活性最強(qiáng)；Cao等[6]研究表明，海蒿子多糖不僅具有良好的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除能力、羥基自由基清除能力、細(xì)胞抗氧化能力和活性氧抑制能力，還具有良好的α淀粉酶和α葡萄糖苷酶抑制活性，能顯著提高胰島素抵抗性肝癌細(xì)胞(HepG2)的糖消耗、糖原合成，以及丙酮酸激酶、己糖激酶活性，因此，海蒿子多糖可以作為一種潛在的抗氧化劑和降血糖候選物質(zhì)，應(yīng)用于功能性和營(yíng)養(yǎng)食品等方面；張華峰等[7]研究表明，海蒿子多糖能明顯降低高血脂小鼠血清中總膽固醇、甘油三酯的含量；Zhang等[8]發(fā)現(xiàn)，海蒿子多糖可以抵抗N-甲基-N-硝基-亞硝基胍(MNNG)引起的免疫損傷，降低腫瘤壞死因子-α的水平，增強(qiáng)胃癌大鼠的免疫力。本研究中，對(duì)海蒿子多糖的提取純化方法及藥理作用進(jìn)行綜述，并針對(duì)研究應(yīng)用中存在的問(wèn)題，提出了海蒿子多糖研究的未來(lái)發(fā)展建議，以期為海蒿子的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供參考，使其在醫(yī)藥健康領(lǐng)域發(fā)揮更為積極的作用。

圖1 海蒿子(2020年4月18采摘于山東威海)Fig.1 Sea weed Sargassum pallidum (collected on April 18, 2020, from Weihai, Shandong Province)

1 海蒿子多糖組成與結(jié)構(gòu)

對(duì)海蒿子多糖的研究最早可追溯至1970年Ovodov等[9]對(duì)褐藻多糖的研究，褐藻多糖主要包括褐藻糖膠、褐藻膠和褐藻淀粉[5]，是中藥海藻水提取物的主要部分。李溢真等[1]采用傳統(tǒng)水提法測(cè)得海蒿子總多糖含量為24.32%；劉斌[5]通過(guò)改變提取溫度和乙醇含量，用醇沉法獲得性質(zhì)不同的褐藻糖膠，純化分離后獲得的褐藻糖膠分子量均單一。多位學(xué)者對(duì)海蒿子多糖的單糖組成進(jìn)行了研究，證實(shí)了純化的海蒿子多糖主要由巖藻糖、半乳糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、鼠李糖和阿拉伯糖組成[5-6]，也有研究表明，海蒿子單糖組成中還有一定量的糖醛酸[5,10-12]。海蒿子多糖分離組分具體組成見(jiàn)表1。

海蒿子多糖結(jié)構(gòu)具有如下特點(diǎn)：主要以巖藻糖、甘露糖和半乳糖的多糖骨架組成，硫酸基和糖鏈分支連接于該骨架上，其相對(duì)分子質(zhì)量約為280 000，不被高碘酸氧化；多糖鏈主要由1→4連接的巖藻糖，1→2，3，4和1→3，4，6連接的甘露糖，以及1→3，6連接的半乳糖構(gòu)成；多糖的分支點(diǎn)主要位于己糖(甘露糖和半乳糖)上；側(cè)鏈主要為葡萄糖；糖鏈末端為木糖；硫酸基主要連接于巖藻糖的2位或3位；多糖鏈不存在三股螺旋[5]。王培培等[13]采用稀酸水解和柱色譜分離獲得一系列不同聚合度的雜合硫酸寡糖片段，并確定了其硫酸根位置及結(jié)構(gòu)序列。

表1 海蒿子多糖不同分離組分的組成Tab.1 Different components of polysaccharides from sea weed Sargassum pallidum

2 海蒿子多糖提取方法

常見(jiàn)的海蒿子多糖提取方法有水提法、酸提法、超聲輔助提取法和超聲波-微波協(xié)同提取法(表2)。在提取之前，通常將海蒿子按照以下方法進(jìn)行脫脂和脫色處理：將海蒿子干粉與體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇在 70 ℃下回流2次，每次回流3 h；過(guò)濾后，將殘?jiān)?0 ℃烘箱中干燥48 h，干燥后的殘?jiān)黐17]備用；或使用氯仿進(jìn)行預(yù)處理操作[18-19]。

海蒿子粗多糖含量和提取率的差異與提取方法密切相關(guān)，不同提取方法提取得到的多糖含量及提取率見(jiàn)表3。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，海蒿子粗多糖提取物中多糖含量最高為38.00%，為海蒿子干粉經(jīng)熱水抽提、乙醇沉淀所得粗多糖含量[28]。如方飛等[21]將海蒿子水提多糖后，用三氯乙酸去除蛋白質(zhì)，得到海蒿子粗多糖提取率最高(7.2%)；扶雄等[23]比較了水提法、酸提法和超聲輔助提取法，發(fā)現(xiàn)采用檸檬酸提取法多糖得率最高，得率為5.31%±0.21%，原因是檸檬酸是一種弱酸，在該弱酸中，細(xì)胞、細(xì)胞壁充分溶脹而破裂，使胞間和胞內(nèi)的多糖溶出，提高了得率，而超聲輔助提取法并未增加多糖得率，可能是超聲浸提僅20 min，多糖未完全溶出所致。

表2 海蒿子多糖不同提取方法的比較Tab.2 Comparison of different extraction method of polysaccharide from sea weed Sargassum pallidum

海蒿子多糖提取方法不同，多糖提取物的生物活性也不同。不同方式提取的海蒿子多糖均可有效清除DPPH自由基，表現(xiàn)出抗氧化作用[23]。對(duì)自由基的清除呈顯著的量效關(guān)系，清除率隨多糖含量的升高而升高。酸提法和超聲處理可引起多糖鏈結(jié)構(gòu)斷裂，破壞多糖結(jié)構(gòu)的完整性，造成多糖硫酸基的損失，而多糖硫酸基含量與抗氧化活性顯著相關(guān)，因此，傳統(tǒng)水提取法具有更好的抗氧化活性[23]。水提法提取的海蒿子多糖對(duì)胃癌大鼠有顯著的免疫功能和抗氧化活性[8]；經(jīng)抗癌活性篩選鑒定，水提海蒿子多糖均具有抗白血病活性[28]。

表3 不同提取方法所得粗多糖中多糖含量及提取率比較

3 海蒿子多糖的純化方法

采用上述各種提取方法得到的粗多糖除含有褐藻糖膠外，還含有水溶性褐藻膠、褐藻淀粉、蛋白質(zhì)、色素及其他雜質(zhì)，需要進(jìn)一步純化[29]，通過(guò)一種或數(shù)種分離純化方法，可得到均一多糖組分，而均一多糖組分的獲得是結(jié)構(gòu)解析的前提。因此，要對(duì)多糖結(jié)構(gòu)有清晰認(rèn)識(shí)，還要借助于分離純化方法的發(fā)展及應(yīng)用[30]。目前，海蒿子多糖純化的常用方法主要有沉淀法、柱色譜法和雙水相萃取法等，以及幾種方法聯(lián)用。海蒿子多糖去除蛋白質(zhì)、去除小分子及分級(jí)純化的方法見(jiàn)表4。

表4 海蒿子多糖的純化方法實(shí)例操作Tab.4 Purification method of polysaccharide from sea weed Sargassum pallidum

不同分離純化方法可單獨(dú)使用，也可聯(lián)合使用。如三氯乙酸-Sevage結(jié)合法[14]，先用三氯乙酸法去除提取液中的蛋白質(zhì)，經(jīng)透析后再用Sevage法繼續(xù)去除蛋白質(zhì)。Sevage-酶-三氯乙酸-透析結(jié)合法，將樣品先重復(fù)多次Sevage法去除蛋白質(zhì)，接著用中性蛋白酶水解，再用三氯乙酸法去除蛋白質(zhì)，經(jīng)濃縮、透析和凍干得純化多糖[8]。 三氯乙酸-膜分離技術(shù)結(jié)合法，通過(guò)添加三氯乙酸去除提取液中的蛋白質(zhì)，并以5 000 r/min離心15 min，將上清液的pH調(diào)節(jié)至7，并置于冰箱中進(jìn)行膜分離[27]?？梢?jiàn)，多種純化方法合理使用，可實(shí)現(xiàn)海蒿子粗多糖的進(jìn)一步分離純化。

趙宇[18]通過(guò)硅膠柱和凝膠柱純化海蒿子多糖得到的BⅠ、BⅡ、DE-Ⅰ組分，總糖含量顯著增加，最大值可從粗提取物總糖含量38.0%增加至52.4%。利用DEAE-Sepharose Fast Flow層析柱對(duì)海蒿子多糖進(jìn)行分離純化，用濃度為0～0.5 mol/L的NaCl溶液梯度洗脫，純化后總糖組分中最高含量達(dá)80.19%[3]。對(duì)酸提法提取的粗多糖宜采用乙醇沉淀法進(jìn)行純化，對(duì)水提法提取的粗多糖宜采用CaCl2沉淀法進(jìn)行純化[14]。魏曉蕾[14]比較了三氯乙酸法、Sevage法和三氯乙酸-Sevage結(jié)合法，發(fā)現(xiàn)3種方法去除蛋白質(zhì)效果依次增加?？梢?jiàn)，多糖的提取率與純度可通過(guò)選擇適宜的純化方法來(lái)提高。

4 海蒿子多糖藥理活性

大多數(shù)海藻多糖為硫酸化多糖，結(jié)構(gòu)影響其功能。巖藻多糖具有較強(qiáng)的藥理活性，其活性與分子量、硫酸根含量和位置等結(jié)構(gòu)因素密切相關(guān)[37]；低濃度的硫酸化多糖提取物具有較好的自由基清除活性[38]。海蒿子多糖的抗氧化、降血糖、抗腫瘤、降血脂和調(diào)節(jié)免疫等方面的生物學(xué)活性被大量報(bào)道，海蒿子多糖的藥理活性與硫酸基含量有顯著關(guān)聯(lián)[5,17]。因此，確定多糖的完整結(jié)構(gòu)，包括糖苷鍵的構(gòu)型、糖苷鍵的位置、單糖的序列、分支點(diǎn)的位置及結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系，在相關(guān)研究中具有重要的意義[27]。

4.1 抗氧化作用

海蒿子多糖對(duì)卵黃脂蛋白(LPO)、羥基自由基(·OH)及超氧陰離子自由基(O2-·)均有一定的清除作用，且清除率隨多糖質(zhì)量濃度的增加而增加，只是增加的幅度不同，當(dāng)海蒿子多糖質(zhì)量濃度達(dá)到200 μg/mL時(shí)，對(duì)LPO的抑制率為40%，對(duì)·OH的清除率為26%，對(duì)O2-·的清除率為80%[21]。硫酸酯化程度越高，多糖的抗氧化功能就越好[3,5,21]。硫酸化修飾導(dǎo)致海蒿子多糖的化學(xué)成分、分子量和單糖組成發(fā)生了一些變化，表現(xiàn)出最好的DPPH和2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)自由基清除活性[39]。王雪等[40]發(fā)現(xiàn)，相同濃度不同品種的海藻多糖對(duì)·OH清除率效果依次為昆布多糖(91.52%)>海蒿子多糖(83.85%)>羊棲菜多糖(67.52%)，對(duì)O2-·清除效果依次為海蒿子多糖(15.66%)>昆布多糖(15.26%)>羊棲菜多糖(2.81%)。對(duì)抗氧化作用測(cè)定表明，海蒿子多糖提取物PSP-1具有良好的DPPH自由基清除、·OH自由基清除、細(xì)胞抗氧化和活性氧抑制活性[6]。通過(guò)對(duì)胃癌大鼠的抗氧化作用研究發(fā)現(xiàn)，海蒿子水提物通過(guò)抑制黏膜中的脂質(zhì)過(guò)氧化作用，保持正常的抗氧化酶活性[8]。

4.2 降血糖作用

海蒿子多糖提取物具有良好的α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性，可以顯著增強(qiáng)胰島素抵抗性HepG2細(xì)胞的葡萄糖消耗、糖原合成，以及丙酮酸激酶和己糖激酶的活性[6]。此外，海蒿子多糖還可以通過(guò)上調(diào)胰島素受體底物1(IRS-1)、糖原合酶、磷酸肌醇-3-激酶(PI-3-K)和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-4的表達(dá)水平，從而改善胰島素抵抗。因此，海蒿子多糖可能是預(yù)防和治療2型糖尿病的潛在候選藥物[10]。海蒿子多糖提取物SPP-1和SPP-2表現(xiàn)出良好的α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性，顯著提高胰島素抵抗性細(xì)胞的葡萄糖消耗。值得注意的是，SPP-1表現(xiàn)出比SPP-2更強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制活性，甚至與阿卡波糖相當(dāng)[11]。所有硫酸化的衍生物均具有比天然海蒿子多糖更好的降血糖能力，硫酸化海蒿子多糖表現(xiàn)出較好的抑制α-葡萄糖苷酶活性和促進(jìn)胰島素抵抗性細(xì)胞葡萄糖消耗作用。硫酸化海蒿子多糖可作為降血糖劑的替代衍生物[39]。

4.3 抗腫瘤作用

海篙子是中藥海藻的一種，為復(fù)方海藻抗癌制劑的君藥?！锻饪普凇酚涊d道:“治癭瘤初起，或腫或硬，或赤或不赤，但未破者”[41]。軟煎散結(jié)湯由4種草藥組成，包括半夏、夏枯草、山慈菇和海蒿子，傳統(tǒng)上用于軟化硬塊并解決硬組織腫塊。多糖的抗腫瘤機(jī)制有兩種方式，即對(duì)癌細(xì)胞的毒性[28]和免疫系統(tǒng)的增強(qiáng)[8]。研究表明，軟煎散結(jié)湯對(duì)瑞士白化病小鼠中的艾氏腹水癌和裸鼠中的乳腺癌異種移植物具有抗腫瘤活性[42]。郭立民等[43]利用小鼠乳腺癌細(xì)胞，以細(xì)胞周期抑制和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)及壞死性細(xì)胞毒活性為指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)海蒿子粗提物有較強(qiáng)的壞死性細(xì)胞毒活性，其抑制濃度IC50為0.50 μmol/L，亦顯示細(xì)胞周期(G0/G1期)抑制活性。劉斌[5]采用MTT法研究發(fā)現(xiàn)，硫酸基含量最高的海蒿子多糖組分對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制活性最強(qiáng)；而海蒿子多糖組分SP-3-1和SP-3-2對(duì)HepG2細(xì)胞、A549細(xì)胞和MGC-803細(xì)胞具有顯著的體外抗腫瘤活性，這可能與其低分子量和高硫酸根含量(22.6%)有關(guān)[27]。

4.4 降血脂作用

中藥多糖通過(guò)抑制三酰甘油與總膽固醇合成通路、提高膽汁酸合成、調(diào)控與脂代謝相關(guān)因子表達(dá)和改善胰島素抵抗作用等途徑發(fā)揮降血脂作用[44]。研究表明，海蒿子多糖具有明顯降低高血脂、限制高血脂小鼠體質(zhì)量快速增加及降低高脂乳劑毒性的作用[7]。

4.5 免疫功能調(diào)節(jié)作用

通過(guò)評(píng)估海蒿子多糖對(duì)雞模型免疫反應(yīng)的影響及檢查雞免疫后的抗體效價(jià)和淋巴細(xì)胞增殖，發(fā)現(xiàn)海蒿子多糖在新城疫(ND)、傳染性支氣管炎(IB)和禽流感(AI)中有佐劑作用。使用油佐劑疫苗作為對(duì)照，給雞施用含有10、30、50 mg/mL海蒿子多糖的ND、IB和AI滅活疫苗，結(jié)果表明，在30 mg/mL海蒿子多糖下，ND、IB和AI抗體滴度和淋巴細(xì)胞增殖得到增強(qiáng)?？梢?jiàn)，適當(dāng)劑量的海蒿子多糖可能是安全有效的免疫刺激候選物，適用于制成疫苗進(jìn)行早期和持續(xù)的預(yù)防[45]。通過(guò)研究海蒿子水提物對(duì)胃癌大鼠免疫功能的影響，發(fā)現(xiàn)口服海蒿子水提取物，治療劑量為400、600、800 mg/kg體質(zhì)量時(shí)，可提供劑量依賴(lài)性保護(hù)作用，以抵抗N-甲基-N-硝基-亞硝基胍(MNNG)引起的免疫損傷，降低腫瘤壞死因子-α的水平，增強(qiáng)胃癌大鼠的免疫力[8]。

4.6 其他作用

硒化作用對(duì)海蒿子多糖的理化和生物學(xué)特性有明顯的影響。采用亞硒酸鈉/稀硝酸法合成了硒含量為2 419 μg/g的海蒿子多糖硒化衍生物(Se-SPP)。物化特性表明，硒化修飾導(dǎo)致多糖的化學(xué)組成、單糖組成、分子量和表面形態(tài)發(fā)生了一些變化。Se-SPP在非競(jìng)爭(zhēng)性抑制類(lèi)型中表現(xiàn)出對(duì)α-葡萄糖苷酶活性更明顯的抑制作用。Se-SPP可作為開(kāi)發(fā)功能性食品中的新型硒補(bǔ)充成分[46]。

5 存在問(wèn)題與展望

5.1 海蒿子多糖研究中存在的問(wèn)題

海蒿子作為褐藻的典型代表，是中國(guó)自古以來(lái)就使用的中藥材之一，在史書(shū)中也多有記載；海蒿子成分豐富，含有大量的蛋白質(zhì)、海藻多糖和無(wú)機(jī)元素等。海蒿子多糖是主要的活性成分，對(duì)海蒿子多糖提取純化和藥理作用的研究較多，但仍然存在以下問(wèn)題。

1)來(lái)源限制。對(duì)中藥海藻海蒿子的研究，與同類(lèi)海藻相比較少，其原因可能是大量海蒿子作為干燥藥材流入市場(chǎng)，導(dǎo)致新鮮海蒿子購(gòu)買(mǎi)困難。

2)海蒿子多糖提取率過(guò)低。對(duì)海蒿子多糖的提取、純化方法的考察不全面，已有的大量?jī)?yōu)化研究方法以傳統(tǒng)的溶劑提取法和沉淀純化為主，未見(jiàn)優(yōu)化新型提取純化方法的報(bào)道。

3)海蒿子多糖制劑有待研究。海蒿子多糖的藥理作用未得到臨床應(yīng)用，也無(wú)相應(yīng)制劑問(wèn)世。

4)對(duì)海蒿子多糖結(jié)構(gòu)研究不足。對(duì)于海蒿子多糖的結(jié)構(gòu)分析還較為粗淺，海蒿子多糖的精細(xì)結(jié)構(gòu)尚不清楚。

5)除多糖外對(duì)海蒿子其他成分研究不足。海蒿子中與其主治功能相吻合的有效成分還不完全清楚，現(xiàn)有的化學(xué)成分和藥理活性研究與其廣泛應(yīng)用的現(xiàn)狀也不相稱(chēng)。

5.2 未來(lái)重點(diǎn)研究方向

1)進(jìn)一步開(kāi)展海蒿子多糖提取純化方法的優(yōu)化研究。通過(guò)對(duì)海蒿子多糖提取純化方法的單因素與多因素考察，可優(yōu)化提取純化條件，以提高海蒿子多糖的提取率與純度。

2)加大海蒿子多糖制劑的研發(fā)力度。許多制劑新技術(shù)可以提高多糖藥物的穩(wěn)定性和生物利用度，且在疾病治療中具有靶向性好、生物相容性高等優(yōu)勢(shì)，可用于多糖制劑的研發(fā)，如微囊/微球、納米粒、脂質(zhì)體等。

3)深入開(kāi)展海蒿子多糖精細(xì)結(jié)構(gòu)的研究。借助多樣化的多糖結(jié)構(gòu)分析方法，如紅外光譜、質(zhì)譜等，能夠確定其精細(xì)結(jié)構(gòu)特征，為海蒿子多糖的精準(zhǔn)功能分析和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

4)廣泛開(kāi)展海蒿子其他成分的研究。海蒿子中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如無(wú)機(jī)元素、蛋白質(zhì)、脂類(lèi)、多酚類(lèi)等成分，在醫(yī)藥健康領(lǐng)域有望發(fā)揮積極作用。