基于宏基因測(cè)序的微生物飼料添加劑菌群結(jié)構(gòu)及質(zhì)量分析

李 明，饒正華，梁洺源，張軍民

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所中心實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

隨著飼料端全面禁抗，養(yǎng)殖端進(jìn)入減抗、限抗時(shí)代，微生物飼料添加劑產(chǎn)業(yè)迎來(lái)了新的機(jī)遇。但是由于在生產(chǎn)過(guò)程中控制不嚴(yán)，其他微生物的污染問(wèn)題成為影響產(chǎn)品質(zhì)量的重要安全隱患。目前，對(duì)微生物飼料添加劑產(chǎn)品中污染菌，如沙門(mén)氏菌、大腸菌群、葡萄球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、蠟樣芽孢桿菌、志賀氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌等的檢測(cè)，主要用平板計(jì)數(shù)、最大或然計(jì)數(shù)法等常規(guī)方法，這些方法都是有明確的檢測(cè)目標(biāo)，而對(duì)于非目標(biāo)，卻往往無(wú)法檢出。如果要全面了解產(chǎn)品中菌的情況，需要對(duì)每種菌都進(jìn)行檢測(cè)；細(xì)菌總數(shù)、霉菌總數(shù)等也只是一個(gè)相對(duì)的概念并且不能進(jìn)行分類(lèi)。因此，常規(guī)分析方法不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且不能全面分析產(chǎn)品中的菌群和含量。

宏基因組學(xué)技術(shù)是基于生境中所有微生物總DNA序列，分析其菌群結(jié)構(gòu)的重要檢測(cè)方法，可全面分析樣品中含有的微生物種類(lèi)和其相對(duì)含量，被廣泛應(yīng)用于食品（Li等，2020；Huang等，2017；Coughlan等，2015）、環(huán)境（Zhou等，2021；Schages等，2021；Nagarkar等，2021）、 腸 道（Chaitra等，2021；Wang等，2020a；Wang等，2020b）等。本研究利用宏基因組學(xué)技術(shù)對(duì)4年采集的113個(gè)微生物飼料添加劑樣品進(jìn)行菌群結(jié)構(gòu)分析，旨在闡明微生物飼料添加劑產(chǎn)品目前存在的問(wèn)題、污染頻率較高的微生物、生產(chǎn)中引起微生物污染風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)及應(yīng)對(duì)策略，為微生物飼料添加劑產(chǎn)品的質(zhì)量控制和行業(yè)監(jiān)管提供數(shù)據(jù)和理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 研究對(duì)象 本試驗(yàn)的研究對(duì)象為2018年至2021年采集的市售微生物飼料添加劑，共113個(gè)樣品。

1.1.2 主要試劑及儀器DNA提取試劑：參照Yu等（2004）方法自行配制；文庫(kù)構(gòu)建試劑盒Tn5 DNA Library Prep Kit for Illumina，北京全式金生物技術(shù)有限公司。

Thermo微量移液器、5810R小型臺(tái)式冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；GR 60DA高壓滅菌鍋，致微（廈門(mén)）儀器有限公司；Qubit 3.0核酸熒光定量?jī)x，美國(guó)ThermoFisher Scientific公司；Illumina Hiseq 3000基因測(cè)序平臺(tái)，美國(guó)Illumina公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取 取0.05 g樣品于離心管中，加入5~20粒氧化鋯珠和1 mL的裂解液，振蕩研磨儀振蕩3 min。70℃水浴15 min。12000 r/min離心15 min，轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管，加入10 μL的RNA酶A溶液，37℃孵育15 min。加入20 μL的蛋白酶K溶液，70℃孵育10 min。加入200 μL的PEG溶液和100 μL的核酸吸附磁珠懸液，室溫靜置10 min，磁力架靜置吸附1 min，棄上清液。70%的乙醇漂洗2次。加入100 μL的純水洗脫DNA。Qubit 3.0核酸熒光定量?jī)x檢測(cè)DNA的濃度，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整度。

1.2.2 宏基因組文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序 利用全式金建庫(kù)試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行文庫(kù)制備。Illumina Hiseq 3000測(cè)序平臺(tái)（北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行宏基因組測(cè)序。

1.2.3 下機(jī)數(shù)據(jù)質(zhì)控 利用fastp v0.12.4（Chen等，2018）對(duì)宏基因組下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，刪除N堿基含量超過(guò)10%或Q值小于5的堿基超過(guò)50%的序列。

1.2.4 物種注釋和定量 利用Kraken2 v2.0.8（Wood等，2019）將質(zhì)控后的數(shù)據(jù)與Kraken數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)，完成種屬分類(lèi)。利用Bracken v2.5（Lu等，2017）對(duì)注釋結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算每種微生物的相對(duì)含量。

2 結(jié)果

2.1 菌群結(jié)構(gòu)分析 通過(guò)對(duì)113個(gè)微生物飼料添加劑樣品進(jìn)行菌群結(jié)構(gòu)分析，即分析樣品中包含的菌種及其相對(duì)含量，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品主要存在檢測(cè)菌種與標(biāo)識(shí)不符、使用《飼料添加劑品種目錄》（以下簡(jiǎn)稱(chēng)《目錄》）外功能菌、目標(biāo)菌含量偏低、部分產(chǎn)品存在雜菌甚至致病菌的問(wèn)題。

2.1.1 菌種與產(chǎn)品標(biāo)識(shí)不符 如圖1所示，編號(hào)23產(chǎn)品的菌群結(jié)構(gòu)主要為74.59%的副地衣芽孢桿菌、17.22%的卷曲乳桿菌和3.14%的地衣芽孢桿菌。其產(chǎn)品標(biāo)識(shí)的菌種為地衣芽孢桿菌，說(shuō)明該產(chǎn)品使用的菌種與標(biāo)識(shí)不符。

圖1 編號(hào)23產(chǎn)品的菌群結(jié)構(gòu)

2.1.2 使用《目錄》外功能菌 如圖2所示，編號(hào)95產(chǎn)品的菌群結(jié)構(gòu)主要為35.39%的貝萊斯芽孢桿菌、30.59%的解淀粉芽孢桿菌、15.89%的枯草芽孢桿菌、6.13%的萎縮芽孢桿菌、2.86%的芽孢桿菌Lzh-5和2.4%的芽孢桿菌病毒Φ29。值得注意的是，貝萊斯芽孢桿菌具有生物降解功能（Deng等，2022；Liu等，2022；Ullah等，2021）和 抑 菌 作 用（Zhang等，2021a；Yan等，2021a；Wang等，2021a），解淀粉芽孢桿菌更多的報(bào)道為產(chǎn)生抗菌成分（Yan等，2021b；Yan等，2021c；Wang等，2021b）與治療致病菌引起的動(dòng)植物疾病（Zhang等，2021b；Wang等，2021c；Wang等，2021d），屬于藥用范疇，而這兩種菌是否具有提高動(dòng)物生產(chǎn)性能的作用，卻鮮有報(bào)道，因此，這兩種菌并未納入《目錄》中。如認(rèn)為添加屬于利用菌種的抗菌作用，則等同于直接向樣品中添加抗生素。

圖2 編號(hào)95產(chǎn)品的菌群結(jié)構(gòu)

2.1.3 非致病菌污染 如圖3所示，編號(hào)71產(chǎn)品的菌群結(jié)構(gòu)主要為戊糖片球菌、Y-01芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、IHB B 7164芽孢桿菌和屎腸球菌。其產(chǎn)品標(biāo)識(shí)的菌種為戊糖片球菌，僅占34.26%，說(shuō)明該產(chǎn)品標(biāo)識(shí)菌的含量偏低。

圖3 編號(hào)71產(chǎn)品的菌群結(jié)構(gòu)

2.1.4 致病菌污染 如圖4所示，編號(hào)43產(chǎn)品的菌群結(jié)構(gòu)主要為地衣芽孢桿菌、卷曲乳桿菌、屎腸球菌、肺炎克雷伯菌、戊糖片球菌和棒狀乳桿菌。其中，肺炎克雷伯菌是一種常見(jiàn)的致病菌，說(shuō)明該產(chǎn)品含有致病菌，存在致病性風(fēng)險(xiǎn)。

圖4 編號(hào)43產(chǎn)品的菌群結(jié)構(gòu)

2.2 污染菌的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)對(duì)113個(gè)微生物飼料添加劑樣品進(jìn)行污染菌的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，如表1所示，目前市售微生物飼料添加劑出現(xiàn)頻率較高的污染菌分別為貝萊斯芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、副地衣芽孢桿菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、解淀粉芽孢桿菌和卷曲乳桿菌。其中，貝萊斯芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌的污染頻率最高，占比12.82%。

表1 樣品中高頻污染菌

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，利用宏基因?qū)W技術(shù)檢測(cè)微生物飼料添加劑的菌群結(jié)構(gòu)，可有效檢測(cè)微生物飼料添加劑中的非靶向污染菌，使污染菌甚至致病菌通過(guò)一次實(shí)驗(yàn)高通量檢出，克服了傳統(tǒng)靶向檢測(cè)方法只能檢測(cè)一種或一類(lèi)特定培養(yǎng)條件的微生物的缺點(diǎn)。對(duì)微生物飼料添加劑產(chǎn)品的質(zhì)量控制和行業(yè)監(jiān)管具有重要參考意義。

4年持續(xù)分析的結(jié)果表明，微生物飼料添加劑產(chǎn)品存在檢測(cè)菌種與標(biāo)識(shí)不符、目標(biāo)菌含量偏低、部分產(chǎn)品存在雜菌甚至致病菌的問(wèn)題。