鐵皮石斛葉干粉對蛋雞盲腸菌群、短鏈脂肪酸、免疫性能和腸道屏障功能的影響

張浩馨，汪 涵,2，金航峰,2，何 珂,2，顏菲菲,2*，趙阿勇,2*

（1.浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院·動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，浙江杭州 311300；2.浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物福利研究所，浙江杭州 311300）

動(dòng)物腸道中存在一個(gè)數(shù)量龐大的菌群生態(tài)系統(tǒng)，腸道里的菌群和宿主動(dòng)物相互作用，與宿主自身的營養(yǎng)物質(zhì)的消化、代謝以及免疫功能密切相關(guān)[1-2]。腸道菌群與宿主的動(dòng)態(tài)平衡對動(dòng)物機(jī)體生命活動(dòng)保持正常運(yùn)轉(zhuǎn)有著重要意義[3]，一旦這種平衡被打破，條件性腸道致病菌會(huì)趁虛而入，從而引起一系列腸道疾病。腸道微生物失調(diào)不僅會(huì)造成腸道疾病，還會(huì)造成免疫性和感染性疾病的發(fā)生[4]。鐵皮石斛葉是草本中藥鐵皮石斛的副產(chǎn)物，與鐵皮石斛莖類似，鐵皮石斛葉主要由多糖、黃酮、生物堿等成分構(gòu)成[5]，其多糖含量約為莖的三分之一[6]，黃酮含量高于莖[7]。研究表明，鐵皮石斛多糖可抑制豚鼠的腸管抑制，并可抑制小鼠的胃腸推進(jìn)作用[8]，對大腸桿菌有抑制作用[9]，還能調(diào)節(jié)免疫活性[10]，促進(jìn)腸道健康[11]。本團(tuán)隊(duì)前期研究表明，鐵皮石斛葉可以降低蛋雞采食量，降低蛋破損率并且可以提高雞蛋蛋黃顏色、蛋黃比例等蛋品質(zhì)指標(biāo)（未發(fā)表）。本試驗(yàn)旨在研究鐵皮石斛葉對蛋雞盲腸微生物多樣性、盲腸內(nèi)容物短鏈脂肪酸含量的影響以及對腸道健康的影響，為鐵皮石斛葉在蛋雞生產(chǎn)中的應(yīng)用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)動(dòng)物為“京紅1 號(hào)”商品蛋雞。鐵皮石斛葉采摘于杭州震亨生物科技有限公司，用60℃烘箱烘干，再由破壁機(jī)打成細(xì)粉。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇19 周齡，體重相近約為1 kg、采食量正常的京紅1 號(hào)蛋雞240 只，隨機(jī)分為3 組，每組10 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)8 只雞。對照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組在基礎(chǔ)日糧中分別添加鐵皮石斛葉干粉1 200、3 600 mg/kg。日糧中其他營養(yǎng)指標(biāo)均滿足《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（NY/T 33-2004）要求。粉料飼喂，自由飲水。試驗(yàn)中使用的基礎(chǔ)日糧由杭州市愛咯禽業(yè)有限公司提供，日糧組成和營養(yǎng)成分見表1。

表1 基礎(chǔ)日糧組成和營養(yǎng)成分

1.3 盲腸內(nèi)容物樣品采集 于蛋雞273 日齡，每組隨機(jī)選8 只蛋雞進(jìn)行頸椎脫臼處死，剖開腹腔取出十二指腸腸段和盲腸內(nèi)容物，腸組織用生理鹽水沖洗后置于2 mL凍存管中，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 揮發(fā)性脂肪酸的測定 用萬分之一天平準(zhǔn)確稱取0.5 g 盲腸內(nèi)容物樣品放入離心管，加入1.5 mL 超純水，漩渦振蕩3～5 min 使盲腸內(nèi)容物充分溶解，然后放入離心機(jī)中，10 000 r/min 離心10 min 使固液相分離，取上清液1 mL 于2 mL 離心管中，加入0.2 mL 25%偏磷酸溶液（上清液:偏磷酸=5:1），充分混勻后冰浴30 min，再以10 000 r/min 離心10 min，用0.22 μm 濾膜過濾到氣相小瓶待測。

分別取乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸和戊酸（購自Sigma 公司，色譜純）1 000、400、100、200、100、100 μL，用萬分之一天平稱重，記錄各組分重量，用超純水定容至100 mL，配成儲(chǔ)備溶液，于4℃避光保存待測。參照耿梅梅[12]的方法將標(biāo)樣儲(chǔ)備液梯度稀釋至相應(yīng)濃度。采用氣相色譜（島津新氣相色譜儀系統(tǒng)GC2010）測定乙酸、丙酸和丁酸濃度，進(jìn)樣量為2μL，色譜柱為HP-INNOWAX（19091N-133）毛細(xì)管柱（30m×0.25 mm×0.25 μm），注射器/ 檢測器的溫度為220℃，柱溫采用程序升溫，80℃持續(xù)1 min 后，以15℃/min 升溫至170℃后維持1.5 min，載氣為高純氮。

1.5 16S rRNA 基因測序 將采集到的盲腸內(nèi)容物樣本送到上海美吉生物生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行總DNA的提取。針對16SV3-V4 區(qū)進(jìn)行Miseq 擴(kuò)增子測序；測序數(shù)據(jù)經(jīng)拼接、質(zhì)控、去接頭之后獲得優(yōu)化序列，基于優(yōu)化序列進(jìn)行OTU 聚類，獲得OTU 豐度表，用于后續(xù)生信分析。選擇3 個(gè)組，使用Venn 圖分析它們在獨(dú)有和共有的OUT 數(shù)目；計(jì)算Alpha 多樣性指數(shù)Shannon、Ace、observedOTUs（Sobs）、Chao1 和Coverage，并進(jìn)行指數(shù)組間差異分析；對于Beta 多樣性分析使用PCoA 進(jìn)行結(jié)果可視化展示；用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分析各菌的占比，得出差異菌。

1.6 腸道炎癥和屏障基因表達(dá)量的測定 使用Trlzol 法提取十二指腸腸段的總RNA，通過ABM 反轉(zhuǎn)錄試劑盒中說明書的方法對十二指腸腸段RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上找到雞的部分炎癥基因和腸道屏障功能相關(guān)基因的序列，通過Primer Premier 5 設(shè)計(jì)出相對應(yīng)的引物，再通過TaKaRa 實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒（RR420-A）對相關(guān)基因的表達(dá)量進(jìn)行測定。引物序列見表2。

表2 引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)分析α多樣性和揮發(fā)性脂肪酸數(shù)據(jù)用Excel整理，用SPSS 25 軟件中ANOVA 進(jìn)行單因素方差分析，并用Duncan's 法進(jìn)行多重比較，P＜0.05 表示差異顯著，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

1.8 圖表制作 圖由美吉生物云平臺(tái)網(wǎng)站制作（http://www.majorbio.com/）圖中CON 為對照組，DO_H 為3 600 mg/kg 鐵皮石斛葉組，DO_L 為1 200 mg/kg 鐵皮石斛葉組。各基因表達(dá)量試通過GraphPad Prism 制作柱狀圖。

2 結(jié)果

2.1 鐵皮石斛葉對蛋雞免疫性能的而影響 由表3 可知，3 600 mg/kg 鐵皮石斛葉組脾臟指數(shù)、血清總蛋白、血清球蛋白和血清IgG 含量顯著高于對照組，3 組間血清白蛋白、血清IgA 含量和血清IgM 含量無顯著差異。

表3 鐵皮石斛葉對蛋雞免疫性能的影響

2.2 組內(nèi)特有及組間共有OUT 分析 由圖1 可知，3 個(gè)處理組共有的OUT 數(shù)目為934 個(gè)，對照組獨(dú)有的OUT數(shù)目為39 個(gè)，3 600 mg/kg 鐵皮石斛葉組獨(dú)有的OUT數(shù)目為30 個(gè)，1 200 mg/kg 鐵皮石斛葉組獨(dú)有的OUT數(shù)目為27 個(gè)。

圖1 Venn 圖

2.3α-多樣性分析 由表4 可知，鐵皮石斛葉對蛋雞盲腸菌群OTU、Shannon、Simpson、ACE 和Chao1 均無顯著數(shù)影響，1 200 mg/kg 和3 600 mg/kg 鐵皮石斛葉組的覆蓋率相較于對照組顯著提高。

表4 鐵皮石斛葉對蛋雞盲腸內(nèi)容物菌群α-多樣性的影響

2.4 盲腸微生物結(jié)構(gòu)分析

2.4.1β多樣性分析β多樣性分析主要是用來評判不同樣本間菌群菌落結(jié)構(gòu)的相似性，PCoA 分析能夠反映出各個(gè)樣本之間的差異大小，樣本間距離越小，代表了樣本間菌群結(jié)構(gòu)越相似。由圖2 可知，本試驗(yàn)中，對照組和3 600 mg/kg 鐵皮石斛葉組明顯分離，說明3 組間菌群結(jié)構(gòu)存在差異性。

圖2 PCoA 分析

2.4.2 盲腸菌群結(jié)構(gòu) 各組盲腸內(nèi)容物樣品中微生物的組成情況相近，但各種微生物所占比例有所差別，在門水平上占優(yōu)勢的分別為擬桿菌門（Bacteroidota）、厚壁菌門（Firmicutes）、脫硫菌門（Desulfobacterota）、放線菌門（Actinobacteriota），圖3 展示了豐度大于0.1%的門水平上的菌群。在屬水平上占優(yōu)的分別為擬桿菌屬（Bacteroides）、理研菌屬（Rikenellaceae）、考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium）、乳桿菌屬（Lactobacillus），圖4 展示了豐度大于1%的屬水平上的菌群。

圖3 盲腸菌群門水平組成和分布

圖4 盲腸菌群屬水平組成和分布

2.4.3 盲腸微生物門和屬水平的差異菌 由圖5 可知，3 600 mg/kg 和1 200 mg/kg 鐵皮石斛葉組脫硫菌門（Desulfobacterota）相對豐度極顯著低于對照組。由圖6 可知，3 600 mg/kg 和1 200 mg/kg 鐵皮石斛葉組的脫硫菌屬（Desulfovibrio）相對豐度極顯著低于對照組（圖6-A），3 600 mg/kg 鐵皮石斛葉組的梅爾海拉菌屬（Mailhella）相對豐度顯著低于對照組（圖6-B），3 600 mg/kg 和1 200 mg/kg鐵皮石斛葉組的α-變 形菌屬（Alphaproteobacteria）相對豐度極顯著低于對照組（圖6-C），3 600 mg/kg 鐵皮石斛葉組的擬桿菌屬（Bacteroidales）相對豐度顯著高于對照組（圖6-D）。

圖5 各組脫硫菌門（Desulfobacterota）相對豐度的差異

圖6 屬水平上部分差異菌的各組相對豐度

2.6 鐵皮石斛葉對盲腸內(nèi)容物中揮發(fā)性脂肪酸的影響由表5 可知，鐵皮石斛葉干粉對蛋雞盲腸內(nèi)容物中乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸含量沒有顯著影響。

表5 鐵皮石斛葉對蛋雞盲腸內(nèi)容物中揮發(fā)性脂肪酸含量的影響 ng/μL

2.7 鐵皮石斛葉對蛋雞腸道緊密連接蛋白及部分炎癥細(xì)胞因子mRNA 表達(dá)量的影響 由圖7 可知，3 600 mg/kg鐵皮石斛葉組十二指腸Occludin、Cadherin、Claudin-1、Claudin-3、Claudin-5、ZO-1、ZO-2、ZO-3基因的mRNA表達(dá)量較對照組顯著上調(diào)，1 200 mg/kg 鐵皮石斛葉組十二指腸Occludin、Claudin-3、ZO-3基因的mRNA 表達(dá)量較對照組顯著上調(diào)。

圖7 鐵皮石斛葉對蛋雞腸道緊密連接蛋白mRNA 表達(dá)量的影響

由圖8 可知，3 600 mg/kg 和1 200 mg/kg 鐵皮石斛葉組十二指腸IL-1β、IL-2α、TLR2、IFN-γ、TGF-β3、TNF-α基因的mRNA 表達(dá)量較對照組顯著下調(diào)。鐵皮石斛葉對蛋雞十二指腸IL-6和IL-10基因表達(dá)量無顯著影響。

圖8 鐵皮石斛葉對蛋雞腸道炎癥細(xì)胞因子mRNA 表達(dá)量的影響

3 討 論

3.1 鐵皮石斛葉對蛋雞免疫性能的影響 機(jī)體的免疫器官指數(shù)是判定機(jī)體免疫功能水平的初步指標(biāo)，免疫器官的發(fā)育狀況可以直接反映出機(jī)體的免疫應(yīng)答水平[13]。宋美芳[14]研究表明，鐵皮石斛提取物可以提高小鼠的脾臟指數(shù)。本試驗(yàn)中3 600 mg/kg 鐵皮石斛葉組脾臟指數(shù)也極顯著高于其他2 組。鐵皮石斛葉中起到免疫作用的主要成分是石斛多糖，它能夠刺激脾臟淋巴細(xì)胞增殖[15]，從而提高機(jī)體的脾臟指數(shù)。本試驗(yàn)中高劑量鐵皮石斛組臟器指數(shù)顯著升高說明鐵皮石斛葉可以在一定程度上改善蛋雞的免疫性能。血清總蛋白和球蛋白也能夠反映機(jī)體的免疫能力[16]；IgA、IgG 和IgM 由主要由B 淋巴細(xì)胞分泌，對機(jī)體體液免疫有十分重要的作用，因此免疫球蛋白水平也是判斷機(jī)體免疫功能的重要指標(biāo)。本試驗(yàn)中，3 600 mg/kg 鐵皮石斛葉組脾臟指數(shù)、血清總蛋白、血清球蛋白和血清IgG 含量顯著高于對照組，說明3 600 mg/kg 劑量的鐵皮石斛葉可以改善蛋雞的免疫功能。

3.2 鐵皮石斛葉對蛋雞腸道菌群多樣性的影響α多樣性中OTU、Chao1 和ACE 指數(shù)是計(jì)算菌群豐度，Shannon和Simpson 指數(shù)是用來計(jì)算菌群多樣性，Coverage 指數(shù)是指各樣品文庫的覆蓋率，其數(shù)值越高，則樣本中序列沒有被測出的概率越低[17]。本試驗(yàn)中，3 600 mg/kg和1 200 mg/kg 鐵皮石斛葉組的Coverage 指數(shù)顯著高于對照組，但3 組Coverage 指數(shù)都接近于1，說明本次測序代表了樣品中微生物的真實(shí)情況，而3 組間菌群豐度和多樣性無顯著差異。β多樣性結(jié)果顯示3 600 mg/kg鐵皮石斛葉組與對照組菌群組成相似度較低，說明蛋雞日糧中添加鐵皮石斛可以改善盲腸菌群結(jié)構(gòu)。

3.3 鐵皮石斛葉對蛋雞腸道菌群組成的影響 在門和屬水平上，3 600、1 200 mg/kg 鐵皮石斛葉組的脫硫菌相對豐度極顯著低于對照組。有研究表明，脫硫弧菌（Desulfovibrio）會(huì)分解腸道中的短鏈脂肪酸[18-19]，使機(jī)體炎性因子水平升高。另外，脫硫弧菌還原硫酸鹽產(chǎn)生的硫化氫[20]會(huì)破壞腸道上皮細(xì)胞從而破壞腸道屏障功能[21]。本研究中，3 600 mg/kg 鐵皮石斛葉組梅爾海拉菌屬（Mailhella）相對豐度顯著低于對照組。梅爾海拉菌屬在羅曼蛋雞腸道里會(huì)生產(chǎn)丁酸、硫化氫，從而破壞腸道屏障，導(dǎo)致多種疾病，對蛋雞造成損害[22]。3 600 mg/kg 和1 200 mg/kg鐵皮石斛葉組α-變形菌屬（Alphaproteobacteria）相對豐度極顯著低于對照組，α-變形菌是常見的條件致病菌[23]，說明鐵皮石斛葉能夠抑制蛋雞盲腸內(nèi)條件致病菌α-變形菌的生長。3 600 mg/kg 鐵皮石斛葉組擬桿菌屬（Bacteroidales）相對豐度顯著高于對照組，擬桿菌能抑制一些有害菌群的黏附與侵襲，能迅速恢復(fù)宿主失衡的內(nèi)部微生態(tài)系統(tǒng)，維持平衡并改善宿主免疫力[24]，其成分多糖A 可抑制人原代胎兒小腸細(xì)胞IL-1β誘導(dǎo)的炎癥，減少腸道炎癥[25]。

3.4 鐵皮石斛葉對蛋雞盲腸揮發(fā)性脂肪酸含量的影響 揮發(fā)性脂肪酸是腸道微生物代謝的主要產(chǎn)物，作為微生物與宿主之間的主要調(diào)節(jié)器，影響著腸道內(nèi)的穩(wěn)態(tài)和防護(hù)病原體入侵宿主[26]。但是揮發(fā)性脂肪酸具有刺激性氣味，在養(yǎng)殖舍內(nèi)濃度過高會(huì)引起動(dòng)物食欲減退、免疫力下降、引發(fā)呼吸道疾病，嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致肺水腫和充血[27]。本試驗(yàn)中各組的揮發(fā)性脂肪酸含量沒有差異，說明鐵皮石斛葉對蛋雞盲腸中揮發(fā)性脂肪酸含量沒有顯著影響。

3.5 鐵皮石斛葉對蛋雞腸道緊密連接蛋白及部分炎癥細(xì)胞因子mRNA 表達(dá)量的影響 腸道上皮細(xì)胞是構(gòu)成腸道屏障的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)，也是腸道與機(jī)體內(nèi)環(huán)境之間的物理屏障。腸上皮細(xì)胞之間不是密閉的，而是存在著間隙，間隙間被ZO、Claudins、Occludin、Tricellulin 4 類跨膜蛋白共同組成的緊密連接填充，構(gòu)成了防止腸道內(nèi)細(xì)菌和毒素發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要屏障[28]。Cadherin蛋白是一種CDH1基因編碼的跨膜糖蛋白，在維持細(xì)胞黏附中起著至關(guān)重要的作用。Cadherin缺失可導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞功能障礙[29]。本試驗(yàn)中，3 600 mg/kg 和1 200 mg/kg 鐵皮石斛葉組十二指腸部分緊密連接蛋白的mRNA 表達(dá)量較對照組顯著上調(diào)，說明日糧中添加鐵皮石斛葉對蛋雞腸道屏障功能起了一定保護(hù)作用。

腸道功能和通透性受到多種細(xì)胞因子影響，這些炎性介質(zhì)可能會(huì)通過腸道屏障進(jìn)入機(jī)體內(nèi)環(huán)境從而進(jìn)入血液，然后破壞腸道上皮細(xì)胞和腸道的完整性和功能[30]。本試驗(yàn)中3 600 mg/kg 和1 200 mg/kg 鐵皮石斛葉組十二指腸IL-1β、TGF-β3和IFN-γ基因的mRNA 表達(dá)量顯著下調(diào)。IL-1β是經(jīng)典炎癥因子，在腸道炎癥中，IL-1β能夠通過激活CD4+細(xì)胞增加促炎因子IFN-γ分泌，從而加重腸道炎癥[31]。本試驗(yàn)中，鐵皮石斛葉組十二指腸緊密連接蛋白mRNA 表達(dá)量較對照組上調(diào)，腸道通透性小，腸道內(nèi)IL-β和受其調(diào)控的促炎因子TGF-β3 進(jìn)入內(nèi)環(huán)境的可能性變小，機(jī)體患上心臟衰竭的可能性變大[32]。另外有研究表明，IFN-γ能與TNF-a發(fā)生協(xié)同作用，通過刺激基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)誘導(dǎo)一氧化氮的合成，從而對機(jī)體腸道黏膜產(chǎn)生損害[33]。TLR2作為TOLL 樣受體家族的重要成員，能夠識(shí)別病原體表面糖蛋白，誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)將其清除，同時(shí)一些病原體會(huì)帶有大量內(nèi)毒素，通過促進(jìn)TLR2 蛋白進(jìn)一步激活巨噬細(xì)胞，進(jìn)而分泌大量促炎因子，最終產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[34]。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)組上述提及的炎癥因子的mRNA 表達(dá)量較對照組顯著下調(diào)，證明日糧中添加鐵皮石斛葉可以降低蛋雞十二指腸腸道炎癥。

本試驗(yàn)中，日糧中添加鐵皮石斛葉的蛋雞十二指腸腸段腸道屏障相關(guān)基因表達(dá)量較對照組上調(diào)，腸道炎癥相關(guān)基因表達(dá)量下調(diào)，且以3 600 mg/kg 較好，主要原因是因?yàn)? 600 mg/kg 鐵皮石斛葉可以有效減少盲腸菌群中脫硫弧菌（Desulfovibrio）和梅爾海拉菌屬（Mailhella）這2 種產(chǎn)硫菌的豐度，減少腸道炎癥，保護(hù)腸道屏障功能。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)條件下，在日糧中添加鐵皮石斛葉干粉能提高蛋雞免疫功能，增加盲腸菌群β多樣性，降低產(chǎn)硫菌和條件致病菌α-變形菌的豐度，并促進(jìn)腸道屏障功能，降低腸道炎癥，以添加量為3 600 mg/kg 為宜。