新型飼用蛋白酶對肉雞生產(chǎn)性能和消化功能的影響

張運鋒，李丹蕾，占秀安,*

（1.海南浙江大學(xué)研究院，海南三亞 572000；2.浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310058）

近幾年來，蛋白和能量飼料資源短缺的形勢日趨加劇，導(dǎo)致大宗原料價格普遍大幅上漲，制約了養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。酶制劑作為一種綠色環(huán)保型飼料添加劑產(chǎn)品備受飼料企業(yè)的關(guān)注。蛋白酶作為催化水解各種蛋白質(zhì)和多肽的一類酶，能將飼料蛋白質(zhì)降解為蛋白胨、肽和氨基酸，該酶也廣泛存在于動物消化道及體細胞溶酶中，與動物生命活動密切相關(guān)[1]。飼用蛋白酶可補充動物內(nèi)源酶的不足，降解飼料抗營養(yǎng)因子，提高氮的利用率，減少氮的排放，有益于動物腸道發(fā)育、提高生產(chǎn)性能等[2-5]。目前，市場上飼用蛋白酶按其適宜的pH 主要分為酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶3 大類。由于不同種類蛋白酶理化性質(zhì)的差異，以及試驗動物、飼料加工溫度等條件不同，飼用蛋白酶在養(yǎng)殖動物上的作用效果也不盡相同。新型蛋白酶作為一種既耐高溫又耐酸的堿性蛋白酶（適宜pH=7～10），其在家禽方面的作用效果未知。本試驗旨在探討新型飼用蛋白酶制劑對肉雞生產(chǎn)性能和消化功能的影響，為其生產(chǎn)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 新型飼用蛋白酶（75 000 U/g 活性單位）由帝斯曼（上海）有限公司提供。1 U 定義為在pH 9.0和37℃條件下，每分鐘從1 mmol/L 底物（Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA）中釋放1 μmol 對硝基苯胺所需的酶量。

1.2 試驗設(shè)計和飼養(yǎng)管理 選取健康的1 d 嶺南黃商品代肉雛雞900 只，隨機分為對照組、蛋白酶組和低蛋白+酶組，每組6 個重復(fù)，每重復(fù)50 只，公母各半。對照組和蛋白酶組飼喂基礎(chǔ)日糧，對照組日糧不添加蛋白酶，蛋白酶組和低蛋白+酶組分別添加蛋白酶200 mg/kg?；A(chǔ)日糧參照《黃羽肉雞營養(yǎng)需要量》（NY/T 3645-2020）配制，低蛋白+酶組飼喂粗蛋白質(zhì)（CP）和能量水平偏低的日糧，根據(jù)帝斯曼公司實踐經(jīng)驗提供的蛋白酶對飼料營養(yǎng)的貢獻值適量降低日糧營養(yǎng)水平而設(shè)計，基礎(chǔ)日糧和低蛋白日糧的原料組成及營養(yǎng)成分見表1。試驗分為前期（1～21 d）和后期（22～52 d），共52 d。試驗肉雞地面平養(yǎng)，24 h 連續(xù)光照，自由飲食和飲水，常規(guī)飼養(yǎng)管理和免疫計劃。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)成分（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.3 樣品采集與指標測定

1.3.1 生產(chǎn)性能 試驗第1 天將肉雛雞隨機分配到各組各重復(fù)，以重復(fù)為單位進行全群稱重，計算平均重即為初始重，分別在第21、52 天禁食12 h 后進行空腹稱重，統(tǒng)計飼料消耗量，計算1～21、21～52、1～52 d 平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）和耗料增重比（F/G）。

1.3.2 飼料CP 表觀代謝率 飼養(yǎng)試驗后期，采用全收糞法進行代謝試驗。每重復(fù)選4 只體重中等的健康公雞于代謝籠，預(yù)試3 d，正試4 d，共7 d。正試期間，每日記錄采食量和全部糞量。取部分鮮糞，加入10% 鹽酸（以10 g 鮮糞加1 mL10%鹽酸計量），帶回實驗室置于-20℃冰箱保存。將糞便解凍、混勻、烘干、回潮、粉碎過40 目篩，制成風(fēng)干樣品。飼料樣和糞樣參照《飼料中粗蛋白的凱氏定氮法》（GB/T6432-2018）測定含氮量，并計算飼料CP 表觀代謝率。

1.3.3 血清游離氨基酸和氮代謝相關(guān)指標 52 d 禁食12 h后，從每個重復(fù)中隨機選取2 只體重中等的公雞，共60 只，翅靜脈采血于真空促凝管中，待血清析出后，3 500 r/min 離心10 min，分離血清于2 mL 離心管中，帶回實驗室置于-80℃冰箱保存。取血清1.0 mL，加入7.5%三氯乙酸2.5 mL，震蕩混勻，4℃12 000 r/min離心20 min，取上清，于全自動氨基酸分析儀（HitachiL-8900）上測定血清游離氨基酸濃度，進樣量為20 μL，脯氨酸檢測波長為440 min，其他氨基酸檢測波長為750 nm。血清氮代謝相關(guān)指標尿酸（UA）、尿素氮（UN）和血氨（BA）濃度采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定。

1.3.4 糞便和空腸食糜相對黏度 代謝試驗期間，每重復(fù)取鮮糞80 g，加入500 mL 蒸餾水溶解混勻，采用NDJ-5SE 數(shù)顯黏度計測定糞便黏度。肉雞采血后屠宰，取空腸中段食糜2.0 g，采用HCl-KCl（0.2 mol/L，pH=1.5）緩沖液18 mL 稀釋混勻，然后10 000 r/min離心15 min，取上清，采用毛細管黏度計測定食糜黏度。

1.3.5 十二指腸消化酶活性 1.3.3 采血后的肉雞進行屠宰，取十二指腸中段2 cm 左右，液氮凍存。在實驗室將十二指腸剖開后，用4℃生理鹽水沖洗干凈。然后，刮取腸黏膜0.1 g 于試管中，加入生理鹽水0.9 mL，冰浴中充分勻漿后，3 000 r/min 離心10 min，取上清液，采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定胰蛋白酶和淀粉酶活性。

1.3.6 十二指腸形態(tài)結(jié)構(gòu) 1.3.3 采血后的肉雞屠宰，取十二指腸近中段2 cm 左右，用生理鹽水沖洗食糜后，置于4%甲醛溶液中固定。采用乙醇梯度對甲醛固定的十二指腸進行脫水處理，石蠟包埋、連續(xù)橫斷切片（5～8 μm）和HE 染色處理后，使用Motic Images 圖像分析系統(tǒng)，觀察測定十二指腸上皮絨毛高度和隱窩深度，分別計算其平均值及絨隱比（V/C）。

1.4 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)先使用Excel 作初步處理，再利用SPSS 20.0 軟件進行One-Way ANOVA 方差分析，采用Duncan's 法進行數(shù)據(jù)顯著性檢驗分析，顯著性水平為P＜0.05，試驗數(shù)據(jù)使用平均值±標準差表示。

2 結(jié)果

2.1 日糧添加蛋白酶對肉雞生產(chǎn)性能的影響 由表2 可見，蛋白酶組全期和后期的F/G 低于對照組（P＜0.05），低蛋白+酶組前期ADFI 高于對照組、蛋白酶組（P＜0.05），而其他指標組間均無顯著性差異。

表2 日糧添加蛋白酶對肉雞生產(chǎn)性能的影響

2.2 日糧添加蛋白酶對CP 表觀代謝率的影響 如圖1 所示，低蛋白+酶組CP 表觀代謝率高于對照組（P＜0.05），蛋白酶組與對照組無顯著性差異，但一定程度上升高了CP 表觀代謝率（0.05＜P＜0.1)。

圖1 日糧添加蛋白酶對CP 表觀代謝率的影響

2.3 日糧添加蛋白酶對血清游離氨基酸濃度的影響 由表3 可知，蛋白酶組血清游離賴氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸和纈氨酸濃度高于對照組（P＜0.05），蛋氨酸和異亮氨酸濃度也高于低蛋白+酶組（P＜0.05），而低蛋白+酶組與對照組間各指標皆未有顯著性差異。

表3 日糧添加蛋白酶對血清游離氨基酸濃度的影響 μg/mL

2.4 日糧添加蛋白酶對血清氮代謝相關(guān)指標的影響 由表4 可見，2 個試驗組血清UA、UN 和BA 濃度均低于對照組（P＜0.05）。

表4 日糧添加蛋白酶對血清氮代謝相關(guān)指標的影響

2.5 日糧添加蛋白酶對空腸食糜和糞便黏度的影響 由表5 可知，2 個試驗組空腸食糜黏度和糞便黏度均低于對照組（P＜0.05）。

表5 日糧添加蛋白酶對空腸食糜和糞便黏度的影響

2.6 日糧添加蛋白酶對十二指腸消化酶活性的影響 由表6 可見，與對照組相比，低蛋白+酶組十二指腸黏膜的胰蛋白酶和淀粉酶活力、蛋白酶組淀粉酶活力均提高（P＜0.05），但蛋白酶組和低蛋白+酶組間各指標差異均不顯著。

表6 日糧添加蛋白酶對十二指腸消化酶活性的影響 U/mgprot

2.7 日糧添加蛋白酶對十二指腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 由表7 可知，與對照組比，2 個試驗組皆增高了十二指腸上皮的絨毛高度（P＜0.05）、降低了隱窩深度（P＜0.05），進而提高了V/C 值（P＜0.05）。

表7 日糧添加蛋白酶對十二指腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

3 討 論

3.1 日糧添加蛋白酶對肉雞生產(chǎn)性能的影響 日糧添加蛋白酶能提高靶向動物營養(yǎng)物質(zhì)（尤其是蛋白質(zhì)）的利用率，尤其是在日糧蛋白水平相對偏低時，外源添加蛋白酶可起到彌補作用，從而有效減輕低蛋白日糧對肉雞生長造成的負面影響[6]。本試驗發(fā)現(xiàn)，在基礎(chǔ)日糧中添加蛋白酶可顯著降低肉雞生長后期和全期的F/G，而對ADFI 和ADG 則無顯著影響。李東東等[7]研究也發(fā)現(xiàn)，300 mg/kg 蛋白酶顯著降低了肉雞的后期F/G，但ADG和ADFI 無顯著變化；但Walk 等[8]報道，添加從枯草桿菌中提取的蛋白酶對肉雞F/G 則無明顯影響。結(jié)果差異可能是因為所用的蛋白酶種類及其理化特性不同導(dǎo)致對內(nèi)源消化酶分泌刺激以及協(xié)同作用也有所不同。張靜靜等[9]報道，在CP 水平降低2% 的日糧中添加500 mg/kg 蛋白酶能有效改善肉仔雞的生長性能，并達到正常蛋白水平日糧的增重效果。周梁等[10]研究指出，低蛋白日糧中添加0.02%蛋白酶顯著提高了7～21 日齡肉仔雞的ADFI，但是F/G 沒有顯著變化。在本試驗中，低蛋白+酶組提高了肉雞生長前期ADFI，可能是由于前期幼雞體內(nèi)消化酶不足，但所需的蛋白水平高，因此幼雞傾向于消耗更多的低蛋白日糧來維持自身生長[11]；同時肉雞生長后期和全期ADG 和F/G 均達到了正常日糧對照組的水平，可能是因為蛋白酶提高了日糧蛋白質(zhì)的消化吸收及氨基酸利用率，從而有效彌補了低蛋白日糧對肉雞產(chǎn)生的負面影響。

3.2 日糧添加蛋白酶對蛋白質(zhì)消化吸收和利用的影響蛋白酶可提高飼料CP 的消化吸收及利用率，因此適度降低日糧CP 水平并添加蛋白酶在維護生產(chǎn)性能的前提下能有效降低成本，獲得更大的經(jīng)濟收益。本研究結(jié)果表明，在正常日糧或低蛋白日糧中添加蛋白酶均能有效提高飼料CP 的表觀代謝率。奚剛等[12]和Vieira 等[13]分別在正常日糧和低蛋白日糧中添加蛋白酶，結(jié)果表明蛋白酶均顯著提高了試驗組雞對CP 的表觀代謝率?？赡茉蚴峭庠吹鞍酌概c內(nèi)源蛋白酶的作用位點等方面可能存在差異，外源蛋白酶能將一些內(nèi)源蛋白酶難以消化的蛋白質(zhì)水解為肽和氨基酸，進而提高了肉雞對飼料蛋白的消化率[14]。

血清游離氨基酸主要來自于腸道對飼料蛋白質(zhì)的消化吸收，可在一定程度上反映動物機體氨基酸的代謝水平，血清中總游離氨基酸含量越高，表明氨基酸的代謝效果越好[15]。在本研究中，正常日糧添加蛋白酶顯著提高了血清賴氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸和纈氨酸濃度，低蛋白日糧添加蛋白酶使血清游離氨基酸濃度達到了正常日糧對照組的水平。由此說明，添加蛋白酶能有效提高肉雞日糧蛋白質(zhì)的消化吸收率。

血清UA、UN 等是反映畜禽體內(nèi)氮代謝的重要指標，其含量主要受飼料蛋白質(zhì)的消化吸收及機體蛋白質(zhì)的分解影響[16]。Hajati 等[17]和呂秋鳳等[18]研究發(fā)現(xiàn)，血清中UA、UN 含量與蛋白質(zhì)的利用率之間存在顯著負相關(guān)，因此通過血清中UA、UN 含量可以來判斷機體對蛋白質(zhì)的利用情況。在本試驗中，正常日糧或低蛋白日糧中添加蛋白酶皆降低了血清UA、UN 濃度，與呂毅等[16]的研究結(jié)果一致?？赡茉蚴堑鞍酌复龠M了肉雞對飼料蛋白的消化吸收和利用，從而降低了血清中UA、UN 含量。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)血清BA 含量也顯著降低。BA 除了一部分由UA 轉(zhuǎn)變而來，其主要來自于腸道未被消化的蛋白質(zhì)和氨基酸，在腸道細菌的作用下分解為氨氣，進入血液中形成BA[19]。因此，血清BA 水平越低，則表明日糧中的蛋白質(zhì)利用率更高。這也進一步佐證了添加蛋白酶能有效提高肉雞對日糧蛋白質(zhì)及其氨基酸的利用率。

3.3 日糧添加蛋白酶對小腸食糜黏度和消化酶活力的影響 機體的化學(xué)性消化過程的主要部位是小腸，因此小腸食糜理化特性的改變直接影響到消化酶的活性及其對日糧的消化和吸收效率[20]。家禽腸道內(nèi)消化物黏性加大，會引起食物蠕動性變慢，其排空速度也隨之減緩[21]。由于動物小腸食糜黏度與營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收有很強的關(guān)聯(lián)性，可以把食糜黏度的變化作為衡量所用酶制劑效果的重要指標之一[22]，但是目前關(guān)于蛋白酶對畜禽食糜和糞便黏度研究甚少。在本試驗中，正常日糧或低蛋白日糧中添加蛋白酶均降低了空腸食糜黏度和糞便相對黏度，可能原因是蛋白酶將小腸中的黏性蛋白大分子降解為多肽片段和氨基酸，消除了大分子蛋白多聚物特性，不再形成黏稠的膠狀物。

飼料蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物需要在消化酶的作用下被分解為小肽、氨基酸、脂肪酸、糖等小分子物質(zhì)才能被動物小腸吸收，因此提高營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收可通過添加外源酶制劑來實現(xiàn)[23]。李宗銳[24]報道，日糧添加蛋白酶顯著提高了肉雞十二指腸胰蛋白酶活力。劉偉等[25]研究表明，在玉米-豆粕型日糧中添加復(fù)合酶制劑（含8 000 U/kg 蛋白酶）顯著提高了黃羽肉雞十二指腸中胰蛋白酶和淀粉酶活力。張靜靜等[26]研究指出，在低蛋白日糧中添加蛋白酶也提高了肉仔雞十二指腸中胰蛋白酶和淀粉酶活力。在本試驗中，正常日糧或低能低蛋白日糧添加蛋白酶均提高了十二指腸胰蛋白酶和淀粉酶活力，說明添加外源蛋白酶有效促進了小腸內(nèi)源酶的分泌。這也是上述日糧蛋白消化吸收和氨基酸利用率升高的主要原因。

3.4 日糧添加蛋白酶對十二指腸腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響小腸是營養(yǎng)物質(zhì)的主要消化吸收部位，小腸結(jié)構(gòu)與功能的完整性影響著營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收與轉(zhuǎn)運，其中小腸絨毛高度和隱窩深度與其生理密切相關(guān)，也是衡量腸道功能的重要指標[27]。絨毛高度和隱窩深度直接反映腸道對營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收能力，而V/C 能綜合反映腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收效率，比值越高，吸收效率越高[28-29]。在本試驗中，正常日糧或低蛋白日糧中添加蛋白酶提高了肉雞十二指腸的絨毛高度，降低了隱窩深度，進而增加了V/C。其他相關(guān)研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)蛋白酶能顯著改善肉雞小腸腸絨毛形態(tài)結(jié)構(gòu)[30-33]，與本研究結(jié)論一致。由此可見，日糧添加蛋白酶有效改善了小腸的形態(tài)結(jié)構(gòu)，進而提高小腸對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力[34]。

4 結(jié) 論

在本試驗中，日糧添加200 mg/kg 蛋白酶能促進肉雞小腸發(fā)育和消化酶分泌，改善飼料蛋白的消化吸收及氨基酸利用，具有節(jié)約氨基酸營養(yǎng)需要和提高飼料轉(zhuǎn)化率的功效，且日糧CP 水平降低0.58%后添加蛋白酶其效果可達到正常日糧水平。