膽固醇負(fù)載的環(huán)糊精對(duì)凍融延邊黃牛精子魚精蛋白損失和凋亡的影響

呂艷秋，徐海峰，曲星霖，張雨陽，李春宇，顧偉玉，金 一*

（1.延邊大學(xué)東北寒區(qū)肉?？萍紕?chuàng)新教育部工程研究中心，吉林延吉 133002；2.長(zhǎng)春市第一中等專業(yè)學(xué)校，吉林長(zhǎng)春 130000）

延邊黃牛是國(guó)家資源保護(hù)品種，是中國(guó)五大地方精品牛之一，提高延邊黃牛的繁殖力對(duì)分子育種計(jì)劃十分重要。精液的冷凍和解凍會(huì)對(duì)精子質(zhì)膜的滲透性、頂體和DNA 的完整性有很大影響，這些變化導(dǎo)致mRNA 和蛋白質(zhì)的降解，從而影響生殖能力[1]。甘油是主要的滲透型冷凍保護(hù)劑，保護(hù)精子免受冰點(diǎn)以下的熱休克，提供 “鹽緩沖”的機(jī)制，可與金屬離子結(jié)合，使細(xì)胞脫水，降低冷凍壓力，并減少凝固過程中精子內(nèi)部的冰晶體積，從而防止精子損傷[2-4]。解凍后牛精子活力和受精能力受冷凍保護(hù)劑中甘油濃度的影響[5]。研究表明牛精子冷凍保存過程中甘油最佳濃度為6%[6]，但有報(bào)道稱甘油會(huì)破壞精子的核膜，且濃度高于4%時(shí)會(huì)影響精子質(zhì)膜流動(dòng)性[7]，進(jìn)而導(dǎo)致受精能力下降。

膽固醇是細(xì)胞膜的主要結(jié)構(gòu)成分[8]。Mocé 等[9]研究發(fā)現(xiàn)通過添加環(huán)糊精以提高膽固醇:磷脂的比例，和甘油有著相似的作用，即使精子細(xì)胞保護(hù)免受冰點(diǎn)以下的熱休克。膽固醇負(fù)載的環(huán)糊精（CLC）為非滲透型冷凍保護(hù)劑，已被廣泛用于公豬[10]、公牛[11]、種馬[12]等動(dòng)物精子保存，以提高精子活力。本研究在冷凍保護(hù)劑中用CLC 替代部分甘油，探究在降低甘油毒性后，不同濃度CLC 對(duì)凍融延邊黃牛精子質(zhì)量的影響，為進(jìn)一步完善牛精子凍融損傷機(jī)理和完善冷凍保護(hù)液配方提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要試劑 微量總RNA、cDNA 和熒光定量PCR提取試劑盒購(gòu)置美國(guó)Thermo Fisher 公司。膽固醇、甲基-β-環(huán)糊精、Tris、檸檬酸鈉、葡萄糖、青霉素、硫酸鏈霉素、甘油、CMA3、七水合磷酸氫二鈉、氯化鎂等試劑購(gòu)置美國(guó)Sigma 公司。

1.1.2 CLC的制備采用Purdy和Graham[13]法制備CLC。簡(jiǎn)單地說，將200mg 膽固醇溶解于1 mL 氯仿中，混合后，吸取0.45 mL 加入1 g 甲基-β-環(huán)糊精溶解的2 mL 甲醇溶液中，在電擊儀中完全融合。然后倒入干凈的無菌玻璃血中，放入干燥箱中，37℃烘干。干燥后，取出載有膽固醇的環(huán)糊精（CLC）晶體放入干凈的玻璃瓶中，22℃保存。使用前，將50 mg CLC 加入1 mL TALP[14]溶液中，混勻后使用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 精液的收集與冷凍解凍程序 選擇5 頭3～5 歲、健康無疾病的延邊黃?；旌暇?，以消除個(gè)體差異，使用假陰道法每周采集2 次，僅收集活力≥85%精液進(jìn)行試驗(yàn)。為評(píng)價(jià)不同濃度的CLC 對(duì)牛精子的影響，先配制不含甘油的Tris 稀釋液（Tris 2.42 g、檸檬酸鈉 1.35 g、葡萄糖 1.1 g、青霉素 0.08 g、硫酸鏈霉素 0.1 g 和卵黃20 mL，雙蒸水定容至100 mL），之后將含有甘油和不同濃度CLC 的Tris 稀釋液將精子稀釋至1.2×108個(gè)/mL，鮮精組使用PBS 進(jìn)行稀釋。具體試驗(yàn)分組為鮮精組、6%甘油對(duì)照組（無CLC，甘油6 mL，Tris 稀釋液94 mL）、3%甘油組（無CLC，甘油3mL，Tris稀釋液97mL）和3%甘油+不同濃度CLC組（0.75、1.5、3.0 mg/mL CLC，甘油3 mL，Tris 稀釋液97 mL）。為了使CLC最佳地?fù)饺氲骄幽ぶ?，用CLC 處理過的樣品在22℃孵育15 min，在精子冷凍前600 r/min 離心8 min 取出CLC，之后再用只含有3%甘油的Tris 稀釋液重懸（不含CLC），為了與處理組一致，對(duì)照組使用含有6%甘油的Tris 稀釋液進(jìn)行相同的處理，使各組精子最終濃度為 80×106個(gè)/mL（pH=7.0，300 mOsm）。然后，在室溫22～25℃，將精子樣本灌注到0.25 mL 法式細(xì)管，平衡在4℃，3.5 h。在液氮上方5 cm 靜液氮蒸汽中熏蒸8～10 min，然后放入液氮中保存。解凍時(shí)將冷凍的細(xì)管在37℃的水浴中解凍30 s，用于研究精液的不同參數(shù)。

1.2.2 精子活力的評(píng)估 將精子樣品置于已預(yù)熱（37℃）的載玻片上，通過計(jì)算機(jī)輔助精子運(yùn)動(dòng)分析技術(shù)（CASA，中國(guó)，同方）對(duì)精子進(jìn)行評(píng)估。簡(jiǎn)而言之，對(duì)于每個(gè)樣品，將5 μL 精液放在分析儀的腔室中，該腔室在分析過程中保持在37℃。隨機(jī)選擇5 個(gè)視野，至少計(jì)數(shù)200 個(gè)精子，檢測(cè)精子活力。

1.2.3 精子頂體完整性的評(píng)估 頂體完整性通過考馬斯亮藍(lán)染色進(jìn)行檢測(cè)，取100 μL 稀釋后的精液涂于載玻片上，再取1 mL 考馬斯亮藍(lán)染色液將精子鋪蓋，避光下染色30 min，隨后鏡檢（400×），至少計(jì)數(shù)200 個(gè)精子，檢測(cè)精子頂體完整率。其中精子頭部受損被認(rèn)為是頂體不完整的精子，精子頭部完整被認(rèn)為是頂體完整的精子。

1.2.4 魚精蛋白損失的評(píng)估 精液在不含Ca2+和Mg2+的磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中洗滌2 次，并在4℃條件下于固定液（甲醇: 冰醋酸=3:1）中固定5 min。涂片，將每張載玻片用100 μL CMA3 染色工作液（在McIlvaine 緩沖液中加入0.25 mg/mL（0.1 mol/L 檸檬酸7 mL +0.12 mol/L 七水合磷酸氫二鈉32.9 mL，pH 7.0，其中包含氯化鎂10 mmol/L）避光染色處理20 min。然后將載玻片在McIlvain 的緩沖液中沖洗并風(fēng)干。隨后鏡檢（400×），至少計(jì)數(shù)200 個(gè)精子，檢測(cè)精子魚精蛋白損失率。其中精子頭部亮綠色熒光染色質(zhì)結(jié)構(gòu)異常被認(rèn)為魚精蛋白損失，精子頭部暗綠色熒光染色質(zhì)結(jié)構(gòu)正常被認(rèn)為魚精蛋白未損失。

1.2.5 基因表達(dá)量的評(píng)估 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RTqPCR）用于使用寡核苷酸引物序列評(píng)估轉(zhuǎn)錄本豐度，所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，所有序列均列于表1。簡(jiǎn)而言之，根據(jù)制造商推薦方案使用DynabeadsTMmRNA DIRECT Kit 將用PBS 清洗3次后的精子細(xì)胞（1×107個(gè)/mL）提取總RNA，并用分光光度計(jì)測(cè)量其濃度；使用RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit 合成互補(bǔ)DNA，置于 PCR 儀中，設(shè)置程序?yàn)?0℃，30 min，85℃，5 min；最后使用Fast SYBRTMGreen Master Mix 制備反應(yīng)體系，每20μL反應(yīng)體系中含cDNA（1 500 ng/μL）2 μL，2×SYBR Green（1X）10 μL，上下游引物各1（10 pmol/L）μL，ddH2O 6 μL。采用PCRmax Eco 48 實(shí)時(shí)PCR 系統(tǒng)進(jìn)行RT-qPCR 分析，PCR 擴(kuò)增步驟為：95 ℃10 min,然后95℃變性15 s，54℃退火15 s，72℃20 s，40 個(gè)循環(huán)，每個(gè)反應(yīng)體系進(jìn)行3 次獨(dú)立生物學(xué)重復(fù)。并使用公式2-ΔΔCT法計(jì)算基因的表達(dá)量。

表1 RT-qPCR 引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 所有試驗(yàn)均重復(fù)五次，使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包SPSS 25.0 進(jìn)行單因素ANOVN 檢驗(yàn)。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，當(dāng)P＜0.05 時(shí)，差異為顯著。

2 結(jié)果

2.1 用CLC 替代部分甘油對(duì)凍融精子活力、頂體膜完整性和魚精蛋白損失率的影響 如圖1 所示，精子通過色霉素A3（CMA3）和考馬斯亮藍(lán)染色。由表2 可以看出，與對(duì)照組相比，3%甘油組精子活力和頂體完整性顯著下降，魚精蛋白損失率顯著升高，3%甘油+CLC（0.75、1.5、3 mg/mL）處理組精子活力顯著升高，魚精蛋白損失率顯著下降，且CLC 濃度為1.5 mg/mL 時(shí)效果最佳。因此后續(xù)試驗(yàn)將使用濃度為1.5 mg/mL 的CLC 進(jìn)行研究。

表2 CLC 替代部分甘油對(duì)凍融精子活力、頂體完整性和魚精蛋白損失率的影響

圖1 凍融前后精子魚精蛋白損失和頂體完整性的鏡檢

2.2 用CLC 替代部分甘油對(duì)凍融精子魚精蛋白基因的影響 由圖2 可以看出，經(jīng)過凍融處理的精子魚精蛋白基因PRM2和PRM3表達(dá)量顯著下降，同時(shí)，與對(duì)照組相比（1.04%），3% 甘油組PRM2（0.72%）和PRM3（0.56%）表達(dá)量顯著下降，3%甘油+1.5 mg/mL CLC組顯著升高（1.92%、1.89%）。

圖2 凍融前后精子PRM2、PRM3 相對(duì)表達(dá)量

2.3 用CLC 替代部分甘油對(duì)凍融精子頂體完整性和氧化應(yīng)激相關(guān)基因的影響 由圖3 可以看出，經(jīng)過凍融處理的精子頂體完整性相關(guān)基因SPACA3表達(dá)量顯著降低，氧化應(yīng)激相關(guān)基因ROMO1表達(dá)量顯著升高。與對(duì)照組相比（1.02%，1.07%），3%甘油組SPACA3（0.94%）表達(dá)量顯著下），ROMO1（1.32%）表達(dá)量顯著升高，3%甘油+1.5 mg/mL CLC 組SPACA3（1.26%）表達(dá)量顯著升高，ROMO1（0.92%）表達(dá)量顯著下降。

圖3 凍融前后精子ROMO1、SPACA3 相對(duì)表達(dá)量

2.4 用CLC 替代部分甘油對(duì)凍融精子凋亡相關(guān)基因的影響 由圖4 可以看出，經(jīng)過凍融處理的凋亡相關(guān)基因BCL2和BCL2/BAX表達(dá)量顯著降低，BAX表達(dá)量顯著升高。與對(duì)照組相比（1.06%，1.04%，1.02%），3%甘油組BCL2和BCL2/BAX（0.76%，0.62%）表達(dá)量顯著下降，BAX（1.22%）表達(dá)量顯著升高；3% 甘油+1.5 mg/mL CLC 組BCL2和BCL2/BAX（1.61%，3.07%）表達(dá)量顯著升高，BAX（0.51%）表達(dá)量顯著下降。

圖4 凍融前后精子BCL2、BAX、BCL2/BAX 相對(duì)表達(dá)量

3 討 論

3.1 用CLC 替代部分甘油對(duì)凍融精子活力、頂體膜完整性的影響 即使隨著冷凍保存技術(shù)的進(jìn)步，冷凍保存仍然會(huì)對(duì)精子造成損害，低溫保存通過對(duì)精子膜、細(xì)胞骨架、運(yùn)動(dòng)器官和細(xì)胞代謝等產(chǎn)生影響，降低精子的生育能力[15]。精子的活力、頂體完整性和抗氧化狀態(tài)等各種參數(shù)與生育能力有關(guān)，Shiva 等[16]研究表明所有這些精子屬性都受到凍融過程的影響。Lodhi 等[17]報(bào)道解凍后正常形態(tài)精子的活力和膜完整性之間有顯著相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)也得到相同結(jié)果，即經(jīng)過凍融處理的精子活力顯著下降，在3% 甘油中添加1.5 mg/mL 的CLC 后精子的活力和頂體完整性得到顯著改善，且精子活力和頂體完整性均優(yōu)于對(duì)照組，結(jié)果說明甘油濃度降低至3%后添加CLC 處理可改善精子活力和頂體功能，同時(shí)精子活力提高可能是由于在冷凍過程中精子受到CLC 對(duì)精子膜的保護(hù)作用。

3.2 用CLC 替代部分甘油對(duì)凍融精子魚精蛋白損失率的影響 魚精蛋白（PRM）是精子核中的主要蛋白質(zhì)，在其正常功能中起著重要作用，包括 DNA 的結(jié)合過程[18]。PRM 是在精子發(fā)生階段形成的[19]，在此期間，精子核中發(fā)生蛋白質(zhì)替代過程，在最初支配精子核的組蛋白，通過復(fù)雜的過程被 PRM 取代，例如甲基化、磷酸化和泛素化[18]。PRM 將優(yōu)化包裝精子 DNA 以增加染色質(zhì)凝聚，這將保護(hù)父本基因組的遺傳完整性，免受核酸酶、誘變劑和其他可能損害 DNA 的因素的影響。本實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，在3%甘油中添加1.5 mg/mL CLC 的精子魚精蛋白損失率顯著降低。Miikeda 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，牛精子中PRM1、PRM2和PRM3的魚精蛋白表達(dá)對(duì)精子的正常功能發(fā)揮重要作用，所以3%甘油+1.5 mg/mL CLC 處理組魚精蛋白水平的改善可能是由于魚精蛋白相關(guān)基因起到了絕對(duì)的作用，為證實(shí)這一研究假設(shè)，本實(shí)驗(yàn)又對(duì)魚精蛋白PRM2和PRM3基因進(jìn)行了檢測(cè)。

3.3 用CLC 替代部分甘油對(duì)凍融精子魚精蛋白、凋亡、頂體完整性和氧化應(yīng)激基因的影響 精子是一種特殊細(xì)胞，其功能取決于蛋白質(zhì)的激活[21]，受精前蛋白質(zhì)的翻譯后修飾在獲能受精過程中起關(guān)鍵作用[22]。多年來，人們一直認(rèn)為成熟的精子細(xì)胞中不會(huì)發(fā)生蛋白質(zhì)翻譯，第一，精子發(fā)生過程中組蛋白被魚精蛋白取代而導(dǎo)致的緊湊的精子核使轉(zhuǎn)錄機(jī)制無法進(jìn)入基因組；第二，大多數(shù)細(xì)胞器的損失，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體，限制或阻止了翻譯活動(dòng)。盡管有這些觀察結(jié)果，但在人類精子中已經(jīng)鑒定出幾種類型的編碼和非編碼 RNA[23]。研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物的精子不僅具有合成線粒體編碼RNA 的能力，而且還含有核編碼的mRNA 和蛋白質(zhì)，在獲能過程中，精子可以替代降解的蛋白質(zhì)或合成新的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)對(duì)受精至關(guān)重要[24]。在凍融犬精液中發(fā)現(xiàn)魚精蛋白PRM2和PRM3基因會(huì)發(fā)生變化[25-26]，同樣在本研究中發(fā)現(xiàn)牛精液PRM2和PRM3基因也發(fā)生了顯著變化，在3%甘油+1.5 mg/mL CLC 組PRM2和PRM3表達(dá)量顯著增加，驗(yàn)證了我們的假設(shè)，與CMA3 染色結(jié)果一致，說明添加CLC 替代部分甘油在冷凍保存期間減少精子魚精蛋白的損失，是由PRM2和PRM3大量聚集而阻止了精子魚精蛋白的損失。同時(shí)值得注意的是，在冷凍的種馬精子中PRM2基因表達(dá)量與對(duì)照組相比顯著下降[27]，這可能是不同物種的原因。細(xì)胞凋亡，也稱為選擇性細(xì)胞死亡，是一種影響細(xì)胞活力的現(xiàn)象，該過程已在人類精子中被記錄，并與輔助生殖技術(shù)后的受精失敗有關(guān)。如今，精子的冷凍和解凍通常與宮內(nèi)受精和體外受精等輔助生殖技術(shù)結(jié)合使用，但冷凍和解凍過程會(huì)增加凋亡精子的數(shù)量，從而降低輔助生殖技術(shù)的成功率。因此，應(yīng)仔細(xì)評(píng)估當(dāng)前精子的冷凍和解凍方法，以確保最大限度地減少細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的損傷，對(duì)判斷凍融后的精子能夠保持其受精能力是十分重要的[28]。據(jù)報(bào)道[29]，BCL2超家族的成員是線粒體凋亡的關(guān)鍵調(diào)控因子，該超家族可分為促凋亡成員和抗凋亡成員，促凋亡BCL2成員，如BAX和BAK 主要位于細(xì)胞質(zhì)中，可以根據(jù)需要而插入到線粒體外膜（OMM）中；抗凋亡成員，如BCL2本身和BCL-XL 位于 OMM 中，可通過阻止與促凋亡BCL2成員相關(guān)的電壓依賴性陰離子通道（VDAC）的開放，也可通過抑制促凋亡BCL2成員形成的超分子開口的組裝來抑制細(xì)胞凋亡[30]。精子尾中段大量的線粒體為細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞凋亡應(yīng)激提供可能性[31]。在本實(shí)驗(yàn)中，3% 甘油+1.5 mg/mL CLC 組與對(duì)照組相比，抗凋亡基因BCL2的轉(zhuǎn)錄表達(dá)增加和促凋亡基因BAX的轉(zhuǎn)錄表達(dá)降低，BCL2/BAX的值顯著升高，這與精子活力的檢測(cè)是一致的，說明冷凍保護(hù)液中添加CLC 替代部分甘油在冷凍保存期間減少了細(xì)胞凋亡，保護(hù)精子發(fā)生。ROMO1是產(chǎn)生線粒體ROS 的關(guān)鍵基因[32]，線粒體呼吸鏈中產(chǎn)生大量?jī)?nèi)源性ROS，可引起基因隨機(jī)突變并導(dǎo)致程序性細(xì)胞死亡[33]。在本實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，3% 甘油+1.5 mg/mL CLC 組ROMO1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)降低，說明冷凍保護(hù)液中添加CLC 替代部分甘油在凍融過程中可保護(hù)線粒體，并減少ROS 的產(chǎn)生。SPACA3基因存在于質(zhì)膜周圍細(xì)胞外基質(zhì)中的N-乙酰氨基葡糖寡糖的結(jié)合位點(diǎn)，可編碼SPRASA 蛋白進(jìn)而參與精卵細(xì)胞的識(shí)別和結(jié)合，并在生育力中起絕對(duì)作用[34-35]。研究結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，3%甘油+1.5mg/mL CLC 組的SPACA3基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)增加，說明冷凍保護(hù)液中添加CLC 替代部分甘油在冷凍保存期間可使精子保持其正常的生理機(jī)能。這也有可能是細(xì)胞凋亡減少和線粒體保護(hù)增加的原因。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果顯示，減少3%甘油濃度后添加1.5 mg/mL CLC 可顯著改善冷凍保存精子質(zhì)量。