體外誘導(dǎo)豬顆粒細(xì)胞黃體化方法的比較研究

呂嘉順，程佳瑞，張瑞門(mén)，鄒超霞，安 強(qiáng)，李鵬舉，韋 瑤，鄧彥飛，韋英明

（1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，亞熱帶生物資源保護(hù)利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530004；2.廣西大學(xué)農(nóng)牧產(chǎn)業(yè)發(fā)展研究院，廣西南寧 530004）

母豬黃體發(fā)育不全作為母豬繁殖障礙的關(guān)鍵障礙之一，是亟待解決的重要繁殖障礙。目前，母豬黃體發(fā)育不全的病因尚不清楚，可能與黃體發(fā)育過(guò)程中的顆粒細(xì)胞黃體化有關(guān)[1-3]。因此需要進(jìn)一步研究顆粒細(xì)胞黃體化的機(jī)制，為解決母豬黃體發(fā)育不全提供理論基礎(chǔ)。

在體外成功構(gòu)建一種豬顆粒細(xì)胞黃體化模型對(duì)研究豬的顆粒細(xì)胞黃體化尤為重要。Li 等[4]使用含10%胎牛血清（FBS）的培養(yǎng)基正常培養(yǎng)牛顆粒細(xì)胞48 h，牛顆粒細(xì)胞發(fā)生黃體化，未對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證；Zhang 等[5]也使用同樣的方法培養(yǎng)山羊顆粒細(xì)胞48 h 使其黃體化，并使用了油紅O 和ELISA-P4進(jìn)行驗(yàn)證；Bruce[6]提出P450scc和STAR是黃體化的重要標(biāo)志性基因；Richards等[7]提出顆粒細(xì)胞黃體化是一個(gè)很快速的過(guò)程，在LH峰作用下4 h 內(nèi)顆粒細(xì)胞就發(fā)生黃體化；Sugino[8]給小鼠注射人絨毛膜促性腺激素（HCG）來(lái)使小鼠排卵和產(chǎn)生黃體，發(fā)現(xiàn)顆粒細(xì)胞黃體化后，STAR和CYP19A1表達(dá)顯著降低，推測(cè)其與DNA 甲基化有關(guān)；譚淇蔓[9]、李南燕等[10]在體外使用1.0 IU/mL HCG 誘導(dǎo)24 h 可成功使小鼠顆粒細(xì)胞黃體化；Fadhillah 等[11]發(fā)現(xiàn)使用2 μg/mL 胰島素（Insulin）誘導(dǎo)24 h 可使牛顆粒細(xì)胞黃體化。武秀峰等[12]也發(fā)現(xiàn)胰島素可增加人顆粒細(xì)胞上LHR 的表達(dá)，使顆粒細(xì)胞黃體化。

綜上，體外誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞黃體化的方法有3 種，分別是用10% FBS 培養(yǎng)基培養(yǎng)顆粒細(xì)胞的自然培養(yǎng)法、HCG 法和胰島素法，但哪種方法可成功使豬顆粒細(xì)胞黃體化未見(jiàn)定論。本研究選擇這3 種方法對(duì)豬顆粒細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，并從孕酮（P4）含量、細(xì)胞活力和黃體化相關(guān)基因表達(dá)差異等方面進(jìn)行比較，為后續(xù)開(kāi)展顆粒細(xì)胞黃體化的機(jī)理的研究提供細(xì)胞模型。

1 材料與方法

1.1 卵泡顆粒細(xì)胞的培養(yǎng) 豬卵巢取自魯班路肉聯(lián)廠180 日齡左右的健康商品母豬。收集卵泡發(fā)育好的卵巢，置于37℃盛有含 2%青鏈霉素的生理鹽水的保溫杯中，于2 h 內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。用37℃無(wú)菌生理鹽水沖洗卵巢3～4 次后，用滅菌紗布拭干卵巢表面水分，選取直徑為3～6 mm 的卵泡，用10 mL 注射器配10 號(hào)針頭抽取卵泡液（注意避開(kāi)血管），用提前燒好的撿卵針將上述操作獲得的卵泡液中的卵母細(xì)胞挑出，收集已挑出卵母細(xì)胞的卵泡液，用細(xì)胞篩（40 μm）過(guò)濾掉多余雜質(zhì)，收集液體，低速離心（1 200 r/min）3 min，棄上清，用PBS 重懸清洗2～3 遍，用含10% FBS、2%青鏈霉素的DMEM 重懸細(xì)胞，置于37℃，5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)。

1.2 主要試劑 Trizol 試劑購(gòu)自Invitrogen 公司，HCG購(gòu)自寧波第二激素廠，DMEM 高糖基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基（GIBCO）、胎牛血清（FBS，GIBCO）、胰酶等均購(gòu)自Life 公司，1%青霉素/鏈霉素，胰島素均購(gòu)自北京索萊寶公司，F(xiàn)SHR 抗體購(gòu)自萬(wàn)類生物科技公司，豬孕酮ELISA 試劑盒購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司，CCK-8 試劑購(gòu)自諾唯贊生物科技有限公司。BD pharmingen FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit1購(gòu)自BD 生物科技公司。

1.3 引物設(shè)計(jì) 應(yīng)用Oligo 7.0 軟件設(shè)計(jì)引物，用于熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)，具體信息如表1 所示。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 黃體化處理

1.4.1 自然培養(yǎng)方法 將收集到的顆粒細(xì)胞按上述方法在37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0～3 d。

1.4.2 HCG法分別添加3、5、10 IU/mL 和20 IU/mL HCG 于豬顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液中，培養(yǎng)1 d 后，用豬孕酮ELISA 試劑盒檢測(cè)孕酮含量，選擇P4含量最高的那一組作為最佳濃度，繼續(xù)培養(yǎng)2 d，并檢測(cè)每天的孕酮含量，選擇P4含量最高的培養(yǎng)天數(shù)作為最佳培養(yǎng)時(shí)間。依據(jù)最佳濃度和最佳培養(yǎng)時(shí)間確定最終處理方法。用QRTPCR 檢測(cè)黃體化相關(guān)基因CYP11A1、STAR、HSD3B1的表達(dá)。

1.4.3 Insulin 法分別添加1、2、4 μg/mL 和8 μg/mL的Insulin 于豬顆粒細(xì)胞中，培養(yǎng)1 d 后，用豬孕酮ELISA 試劑盒檢測(cè)P4含量，選擇P4含量最高的那一組作為最佳濃度，分別培養(yǎng)1、2、3 d 并檢測(cè)每天的P4含量，選擇P4含量最高的培養(yǎng)天數(shù)作為最佳培養(yǎng)時(shí)間。依據(jù)最佳濃度和最佳培養(yǎng)時(shí)間確定最終處理方法。用QRTPCR 檢測(cè)黃體化相關(guān)基因CYP11A1、STAR、HSD3B1的表達(dá)。

1.5 細(xì)胞形態(tài)觀察 采用3 種不同的方法處理細(xì)胞后，去除DMEM/F12 培養(yǎng)基，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗去未貼壁細(xì)胞后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)差異并拍照記錄。

1.6 細(xì)胞活力測(cè)定 將細(xì)胞接種至96 孔板中，按3 種方法處理后，按說(shuō)明書(shū)向每孔中加入10 μL CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)2 h 后用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)吸光度，后根據(jù)說(shuō)明書(shū)計(jì)算其細(xì)胞活力。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 胰酶消化細(xì)胞后，室溫離心（1 200 r/min）3 min，棄上清，1×PBS 洗滌。每組收集大約1×106個(gè)細(xì)胞，加入500 μL binding buffer，反復(fù)吹打均勻，分別添加5 μL PI 和AnnexinV-FITC，混勻后避光靜置5 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（QRT-PCR）檢測(cè)黃體化相關(guān)基因STAR、CYP11A1和HSD3B1的表達(dá)，采用3 種不同的方法處理細(xì)胞后，棄去上清，用Trizol 法提取細(xì)胞RNA 后，進(jìn)一步用反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA。根據(jù)所得cDNA 進(jìn)行 QRT-PCR，反應(yīng)體系20 μL：SYBR qPCR MasterMix 10 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA模板1 μL，滅菌雙蒸水8.2 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性：60 ℃ 2 min，95 ℃ 3 min；變 性：95 ℃，15 s，退 火、延伸：60℃，1 min，循環(huán)36 個(gè)。根據(jù)獲得的CT 值用GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行作圖。所用引物序列見(jiàn)表1。

表1 熒光定量PCR 基因引物合成序列

1.9 免疫熒光法檢測(cè)FSHR 的表達(dá) 細(xì)胞在培養(yǎng)24 h 后，棄掉培養(yǎng)基，用PBS 徹底清洗后，加入4%多聚甲醛，在4 ℃冰箱中固定30 min，用PBS 清洗3 遍（每次10 min）后，加入0.1%Triton-X-100 透化20 min，PBS清洗3 遍（每次10 min），用5%牛血清蛋白（BSA）室溫封閉1 h，用抗FSHR 的抗體4℃孵育過(guò)夜。一抗孵育結(jié)束后，用PBS 清洗3 遍（每次10 min），室溫孵育羊抗兔二抗1 h，用PBS 清洗3 遍（每次10 min），滴加DAPI 避光孵育5 min，用PBS 洗一遍后，在熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果并拍照記錄。

1.10 統(tǒng)計(jì)分析 每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS17.0 軟件，所有數(shù)值均以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)誤表示。兩組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異采用T 檢驗(yàn)，超過(guò)兩組的采用方差分析（ANOVA）。P＜0.05 時(shí)記為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 顆粒細(xì)胞的鑒定 為驗(yàn)證收集的細(xì)胞是豬顆粒細(xì)胞，采用顆粒細(xì)胞的特異性抗原FSHR 作免疫熒光來(lái)驗(yàn)證，結(jié)果如圖1 所示，F(xiàn)SHR 染色為陽(yáng)性，表明所收集的細(xì)胞是顆粒細(xì)胞。

圖1 FSHR 免疫熒光

2.2 黃體化處理結(jié)果 自然培養(yǎng)法：在體外環(huán)境下，連續(xù)培養(yǎng)豬顆粒細(xì)胞3 d，每天檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中P4含量，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)液中P4含量持續(xù)下降（圖2），說(shuō)明細(xì)胞并未發(fā)生黃體化。HCG 法：在體外培養(yǎng)豬顆粒細(xì)胞中添加不同濃度的HCG，處理1 d 后檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中P4含量，結(jié)果顯示5 IU/mL HCG 處理的顆粒細(xì)胞中分泌的P4含量最高；接著分別使用5 IU/mL HCG 培養(yǎng)顆粒細(xì)胞1、2、3 d，結(jié)果顯示，處理2 d 組顆粒細(xì)胞中分泌的P4含量最高，因此，選擇5 IU/mL HCG 處理2d 的豬顆粒細(xì)胞作為黃體化細(xì)胞模型用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)（圖3）。胰島素法：在培養(yǎng)豬顆粒細(xì)胞過(guò)程中添加不同濃度的Insulin，處理1 d 后檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液P4含量，結(jié)果顯示2 μg/mL 胰島素處理的顆粒細(xì)胞中分泌的P4含量最高；接著分別使用2 μg/mL 胰島素培養(yǎng)顆粒細(xì)胞1、2、3 d，結(jié)果顯示，隨著天數(shù)增加，顆粒細(xì)胞中分泌的P4含量逐漸升高（圖4）。因此，選擇2 μg/mL 胰島素處理3 d 的豬顆粒細(xì)胞作為黃體化細(xì)胞模型用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 自然培養(yǎng)法誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞黃體化后P4 濃度

圖3 HCG 處理顆粒細(xì)胞后P4 濃度

圖4 胰島素處理豬顆粒細(xì)胞后P4 濃度

2.3 不同方法所獲細(xì)胞形態(tài)分析 采用自然培養(yǎng)法、HCG 法、胰島素法3 種方法對(duì)顆粒細(xì)胞進(jìn)行處理之后，細(xì)胞形態(tài)飽滿，呈星狀，放射狀，與正常顆粒細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯差異（圖5）。

圖5 3 種方法處理后的顆粒細(xì)胞

2.4 細(xì)胞活力檢測(cè) 如圖6 顯示，培養(yǎng)2 d 后，以正常細(xì)胞為對(duì)照組進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，HCG 組的細(xì)胞活力降低（P＜0.05），胰島素組沒(méi)有顯著差異。

圖6 Insulin 法與HCG 法對(duì)顆粒細(xì)胞活力的影響

2.5 黃體化相關(guān)基因的表達(dá)檢測(cè) 如圖7 所示，與對(duì)照組相比，HCG 組顆粒細(xì)胞中STAR顯著上升（P＜0.05），3β-HSD下降（P＜0.05），CYP11A1沒(méi)有顯著差異；胰島素誘導(dǎo)3 d 后的豬顆粒細(xì)胞中，3β-HSD和STAR下降（P＜0.05），CYP11A1上升（P＜0.05）。

圖7 QRT-PCR 技術(shù)檢測(cè)2 種方法處理顆粒細(xì)胞后的黃體化基因的相對(duì)表達(dá)量

2.6 流式凋亡檢測(cè) 如圖8 所示，與對(duì)照組相比，5 IU/mL HCG 組凋亡率增加（P＜0.05），2 μg/mL Insulin 組凋亡率降低（P＜0.05）。

圖8 流式細(xì)胞檢測(cè)顆粒細(xì)胞凋亡率

3 討 論

McRae 等[13]率先提出顆粒細(xì)胞黃體化的機(jī)制可能與顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞之間的物質(zhì)交換和信息交流有關(guān)，指出顆粒細(xì)胞分泌孕激素能力的增強(qiáng)和分泌雌激素能力的下降可被視為黃體化的標(biāo)志，并將STAR、CYP11A1和3β-HSD視為黃體化的標(biāo)志基因。Sugino[8]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)顆粒細(xì)胞中STAR表達(dá)量顯著上升和CYP19A1表達(dá)量顯著下降也可作為黃體化的標(biāo)志之一，并通過(guò)RNA-seq 技術(shù)預(yù)測(cè)了表觀修飾在顆粒細(xì)胞黃體化過(guò)程中也具有重要作用。本實(shí)驗(yàn)使用含有10% FBS的培養(yǎng)基培養(yǎng)豬顆粒細(xì)胞3 d，發(fā)現(xiàn)其分泌的P4含量持續(xù)下降，認(rèn)為豬顆粒細(xì)胞并未發(fā)生黃體化。而Zhang等[5]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明采取10% FBS 的培養(yǎng)基培養(yǎng)山羊顆粒細(xì)胞可使其分泌孕激素的能力顯著增強(qiáng)，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相悖，可能是由于物種特異性等原因。本實(shí)驗(yàn)中，使用5 IU/mL HCG 誘導(dǎo)2 d 也可使豬顆粒細(xì)胞分泌大量P4，P4含量可達(dá)50～60 ng/mL，并且黃體化相關(guān)基因STAR、CYP11A1顯著升高，3β-HSD顯著降低，認(rèn)為顆粒細(xì)胞也發(fā)生黃體化。與使用2 μg/mL 胰島素誘導(dǎo)3 d后的豬顆粒細(xì)胞而言，后者的P4含量達(dá)到了300 ng/mL，胰島素法處理后的豬顆粒細(xì)胞其細(xì)胞活力更高，凋亡率更低，更適合作為合適的細(xì)胞模型開(kāi)展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)中，2 種方法處理后的豬顆粒細(xì)胞的STAR基因相對(duì)表達(dá)量變化趨勢(shì)不一致，這與Fadhillah 等[11]使用胰島素誘導(dǎo)牛顆粒細(xì)胞黃體化結(jié)果有些許差異，可能是由于物種特異性所致。查閱NCBI 上的豬的STAR基因的表達(dá)圖譜可知，STAR在豬顆粒細(xì)胞上的表達(dá)本身就很低，不宜用作豬顆粒細(xì)胞黃體化的參考標(biāo)志之一[14]。具體原因還有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)僅比較了3 種體外誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞黃體化的方法，對(duì)于其他體外誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞黃體化方法未進(jìn)行比較，得到的結(jié)論具有一定的局限性。同時(shí)，對(duì)于顆粒細(xì)胞黃體化的驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)還略顯單薄，今后的研究可以利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)等新興技術(shù)篩選出更多顆粒細(xì)胞黃體化標(biāo)志物，進(jìn)一步豐富顆粒細(xì)胞黃體化的驗(yàn)證方法，深入研究顆粒細(xì)胞黃體化的機(jī)制，為解決母豬黃體發(fā)育不全提供理論基礎(chǔ)[15]。

4 結(jié) 論

本次實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了體外誘導(dǎo)豬顆粒細(xì)胞黃體化的模型，彌補(bǔ)了體外誘導(dǎo)豬顆粒細(xì)胞黃體化的空白，利用ELISA、QRT-PCR 進(jìn)行了黃體化驗(yàn)證，符合目前對(duì)于顆粒細(xì)胞黃體化的驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)利用CCK-8 和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡，最終確定了使用2 μg/mL 胰島素誘導(dǎo)3 d 作為體外誘導(dǎo)豬顆粒細(xì)胞黃體化的最適方法。