抵抗素對雄性小鼠生殖功能的影響

劉小平， 張 庚， 劉 丹， 朱曉歡， 魯兆軒，位 蘭， 文鳳云，2

(1.河南科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，河南 洛陽 471023；2. 洛陽市優(yōu)質(zhì)畜禽種質(zhì)資源與遺傳繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 洛陽 471023)

0 引言

抵抗素是由白色脂肪細(xì)胞特異分泌的一種肽類激素，是具有激素樣活性的抵抗素樣分子的創(chuàng)始成員，在肥胖和代謝綜合征等生理病理中起主要作用[1]。在飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠體內(nèi)，將抵抗素敲除，發(fā)現(xiàn)小鼠肝脂肪變性，血清膽固醇和極低密度脂蛋白水平降低[2]。抵抗素與心血管疾病、動脈粥樣硬化、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、慢性腎臟病和高血壓相關(guān)[3-5]。文獻(xiàn)[6]研究表明：雄性小鼠肥胖組、動脈粥樣硬化組抵抗素表達(dá)與血脂譜及炎癥狀態(tài)顯著相關(guān)。其次，在肥胖個(gè)體的血清中觀察到抵抗素水平升高[7-8]，大量證據(jù)表明：抵抗素水平升高與肥胖相關(guān)的惡性腫瘤之間也存在聯(lián)系[9-10]。同時(shí)，抵抗素具有強(qiáng)有力的促炎特性，并直接或間接促進(jìn)癌癥進(jìn)展[11-15]，血清抵抗素與胃癌、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌癥等都有關(guān)[16]。

有研究表明：抵抗素存在于不同物種兩性的各個(gè)生殖組織中，可能與肥胖相關(guān)的不孕癥等相關(guān)[17]。同時(shí)，抵抗素在調(diào)節(jié)體重、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和生殖器官中也發(fā)揮著重要作用，它通過作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)參與青春期的復(fù)雜過程并維持正常的生殖功能。大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞抵抗素的基因表達(dá)高于生精小管內(nèi)的支持細(xì)胞，這種表達(dá)受促性腺激素、瘦素和營養(yǎng)狀況的調(diào)節(jié)[18]。人類精液中的抵抗素水平高于血清，并且精液抵抗素與精子質(zhì)量相關(guān)[19]。當(dāng)研究不育患者體內(nèi)抵抗素水平與脂質(zhì)過氧化、過氧化氫酶活性之間潛在關(guān)系時(shí)，發(fā)現(xiàn)患者抵抗素水平與脂質(zhì)過氧化、過氧化氫酶活性、精子凋亡和壞死呈正相關(guān)[20]。體外研究發(fā)現(xiàn)：抵抗素參與精子獲能、精子和卵子融合以及受精[21]。

近年來，對人進(jìn)行的抵抗素和肥胖相關(guān)的研究已經(jīng)表明：與正常對照組相比，肥胖個(gè)體的抵抗素水平較高[7-8，22]，并且與體質(zhì)量指數(shù)和內(nèi)臟脂肪含量呈正相關(guān)[23-24]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，抵抗素循環(huán)水平在體質(zhì)量下降時(shí)顯著降低[25]。體質(zhì)量超重也可能導(dǎo)致精子參數(shù)發(fā)生變化，其精子數(shù)量、流動性和活力不足可能導(dǎo)致生育率下降[26]，但這種體質(zhì)量超重所造成的生育率下降是否與肥胖狀態(tài)下高循環(huán)抵抗素水平相關(guān)目前還不清楚。本研究利用抵抗素重組蛋白，對雄性小鼠進(jìn)行尾靜脈注射模擬高循環(huán)水平抵抗素，通過小鼠血清生殖激素水平變化測定、精子活動能力檢查、睪丸組織結(jié)構(gòu)檢測以及形態(tài)觀察，以期闡明肥胖狀態(tài)下抵抗素與雄性小鼠生殖功能的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物

健康雄性8周齡無特定病原體(specific pathogen free，SPF) C57BL/6J小鼠(10只)，體質(zhì)量(20.0 ± 0.6) g，由南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場提供。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)動物分組及處理

將試驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對照組(n=5)，單籠單只飼養(yǎng)，隨機(jī)采食和飲水，自然光照。每日定時(shí)稱取體質(zhì)量后進(jìn)行尾靜脈注射，試驗(yàn)組小鼠注射終濃度為400 ng/(d·只)的抵抗素溶液(PeproTehc，美國)[27], 對照組小鼠注射等體積雙蒸水，連續(xù)注射6 d，注射完成當(dāng)天斷食斷水12 h，第7天摘除眼球收集血清，同時(shí)測量血糖，然后脫頸處死進(jìn)行樣品采集。

1.2.2 精子的采集與處理

將處死的小鼠仰臥，用乙醇棉球消毒其腹部被毛及皮膚，確定開口位置，然后剪開小鼠腹部，進(jìn)行睪丸附睪的處理，將一側(cè)睪丸和附睪以及輸精管用眼科剪分離，將睪丸橫切為若干段或組織塊，放入加有1 mL的5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))葡萄糖磷酸緩沖鹽溶液的表面皿中，用眼科剪輕輕擠壓睪丸組織塊，把精子擠入培養(yǎng)液中，于37 ℃、5 % CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)20 min，使精子自行散開。

1.2.3 小鼠血清生殖激素測定

通過摘眼球取血法采集血液于Eppendorf(EP)管內(nèi)，靜置后于離心機(jī)3 000～4 000 r/min離心10 min，取上層血清，在-20 ℃冰箱中保存。

1.2.4 精子活力檢查

用滴管吸取精液，將其滴入血球計(jì)數(shù)板與蓋玻片接觸處的計(jì)數(shù)室，使精液能夠自然流入計(jì)數(shù)室中。進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)時(shí)選取中間5個(gè)中方格(即對角的5個(gè)方格或者四角及中間這5個(gè)方格)內(nèi)80個(gè)小方格的精子數(shù)記為C。先計(jì)數(shù)死精子的數(shù)量，將其記為A，將計(jì)數(shù)板于50 ℃水浴鍋放置10 min以便殺死精子，第2次計(jì)數(shù)精子總數(shù)為B，(B-A)/C為精子活力。計(jì)數(shù)時(shí)每只小鼠的精子用3個(gè)計(jì)數(shù)板重復(fù)計(jì)數(shù)3次，取其平均值。

1.2.5 精子形態(tài)觀察

取適量精液滴在載玻片上，制成精子懸液涂片。用0.5%(體積分?jǐn)?shù))龍膽紫乙醇溶液染色3 min，自然干燥、水洗，在顯微鏡下觀察精子的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.2.6 睪丸組織結(jié)構(gòu)檢測

處死小鼠并分離睪丸，快速放入戊二醛固定液或電鏡固定液中，分別使用H & E染色和透射電鏡技術(shù)觀察組織結(jié)構(gòu)的變化并拍照保存。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

本試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理，采用單因素方差的分析方法分析處理數(shù)據(jù)，結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，組間數(shù)據(jù)的顯著性檢驗(yàn)采用Dunnet’t法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 抵抗素對小鼠血清生殖激素質(zhì)量濃度的影響

抵抗素對小鼠血清生殖激素質(zhì)量濃度的影響如表1所示。由表1可知：試驗(yàn)組小鼠血清內(nèi)雌二醇(estradiol，E2)質(zhì)量濃度和睪酮(testosterone，T)質(zhì)量濃度均顯著高于對照組小鼠的(P<0.05)；試驗(yàn)組小鼠血清促卵泡成熟素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)的質(zhì)量濃度有所降低，但差異不顯著(P>0.05)；試驗(yàn)組小鼠血清促黃體生成素(luteinizing hormone，LH)的質(zhì)量濃度與對照組相比，有所升高，但差異不顯著(P>0.05)。

表1 抵抗素對小鼠血清生殖激素質(zhì)量濃度的影響

2.2 抵抗素對小鼠精子質(zhì)量的影響

抵抗作用后小鼠精子活力及畸形率的檢測結(jié)果分別如表2和表3所示。表2表明：與對照組相比，試驗(yàn)組小鼠的精子活力顯著下降(P<0.05)。表3表明：與對照組相比，試驗(yàn)組小鼠精子畸形數(shù)量更多，畸形率略有升高，但差異不顯著(P>0.05)。

表2 抵抗素作用后小鼠精子活力的比較

表3 抵抗素作用后小鼠精子畸形率的比較

2.3 抵抗素對小鼠精子形態(tài)的影響

圖1顯示對照組與試驗(yàn)組小鼠龍膽紫染色精子的正常形態(tài)及畸形精子的形態(tài)。正常精子的形態(tài)像蝌蚪一樣，頭部呈橢圓形，頸部與尾部相連接，由一條軸絲相連，尾部有鞭毛狀形態(tài)(見圖1a)；畸形精子出現(xiàn)頭部膨大、瘦小、缺損、輪廓不明顯，頸部膨大、不全分叉，尾部曲折、卷曲、斷裂短小等現(xiàn)象。與對照組相比，試驗(yàn)組小鼠出現(xiàn)畸形精子數(shù)目顯著增加(見圖1b)。

(a) 對照組

2.4 抵抗素對小鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)的影響

在對小鼠睪丸組織樣本進(jìn)行H & E染色后，在光鏡下以不同放大倍數(shù)觀察對照組小鼠睪丸組織樣本(見圖2和圖3)，發(fā)現(xiàn)：對照組小鼠曲精小管直徑較大，管腔相對較小，含有大量排列規(guī)則的生精細(xì)胞，層次較分明，由基膜向內(nèi)依次是精原細(xì)胞、初級精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和精子，精原細(xì)胞與基膜最接近，精子主要聚集在曲精小管的管腔中央，且精子數(shù)目較多。除此之外，還能看到底部附著于基膜的支持細(xì)胞，其細(xì)胞核形狀不一(見圖2a和3a中箭頭所指)。試驗(yàn)組小鼠曲精小管直徑小于對照組，但統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示差異不顯著(P>0.05)，管腔相對較大，含有的生精細(xì)胞數(shù)目、層數(shù)相對較少，排列不規(guī)則，或出現(xiàn)排列斷裂等現(xiàn)象。在對照組與試驗(yàn)組小鼠的睪丸組織樣本中均未觀察到明顯的次級精母細(xì)胞，除此之外，試驗(yàn)組與對照組的基膜沒有觀察到明顯的差異對比(見圖2b和圖3b中箭頭所指)。

(a) 對照組(b) 試驗(yàn)組

(a) 對照組(b) 試驗(yàn)組

2.5 抵抗素處理后小鼠睪丸超微結(jié)構(gòu)變化

抵抗素處理后小鼠睪丸超微結(jié)構(gòu)變化如圖4所示。對照組小鼠的睪丸組織樣本中能夠看到形態(tài)結(jié)構(gòu)正常、與基膜連接緊密的支持細(xì)胞，核仁清晰可見，形態(tài)規(guī)則，結(jié)構(gòu)清楚，染色質(zhì)集中分布，相鄰支持細(xì)胞之間相互連接，精原細(xì)胞核膜光滑，未出現(xiàn)明顯的凹陷或變形，可以明顯觀察到核膜的雙層膜結(jié)構(gòu)，視野中有數(shù)目豐富、結(jié)構(gòu)正常的線粒體，多于試驗(yàn)組，且能觀察到清晰的線粒體脊(見圖4a)。試驗(yàn)組小鼠的核膜出現(xiàn)了不同程度的凹陷、變形，胞質(zhì)出現(xiàn)部分空泡狀結(jié)構(gòu)，核膜的雙層膜結(jié)構(gòu)不完整，出現(xiàn)部分缺損，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)目較多，線粒體數(shù)目較少，且線粒體出現(xiàn)了一定程度的變形，線粒體嵴發(fā)生溶解，很難觀察到結(jié)構(gòu)清晰的線粒體嵴，高爾基體清晰可見，但支持細(xì)胞與對照組相比沒有觀察到明顯的結(jié)構(gòu)變化，無顯著差異(見圖4b中箭頭所指)。

(a) 對照組

3 討論

抵抗素是在多種激素及營養(yǎng)調(diào)控下脂肪細(xì)胞分泌的一種肽類激素。文獻(xiàn)[28]發(fā)現(xiàn)：抵抗素信使核糖核酸的表達(dá)受年齡的影響，出生45 d的小鼠激素水平最高，此后下降；雄性大鼠的抵抗素信使核糖核酸比雌性大鼠的高，對切除不同年齡大鼠的卵巢和睪丸試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，性激素增加雄性大鼠脂肪組織中抵抗素信使核糖核酸的表達(dá)。這表明抵抗素可以解釋青春期胰島素敏感性下降，可能是由于性類固醇與胰島素敏感性之間的聯(lián)系[29]。也有研究表明： 血清抵抗素水平與促甲狀腺激素呈負(fù)相關(guān), 與游離T3 (FT3) 、FT4水平呈正相關(guān)[30-31]。本試驗(yàn)將抵抗素重組蛋白通過尾靜脈注射處理小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組小鼠的血清E2質(zhì)量濃度和T質(zhì)量濃度均顯著高于對照組小鼠的(P<0.05)，試驗(yàn)組小鼠血清FSH質(zhì)量濃度和LH質(zhì)量濃度差異不顯著(P>0.05)，這與文獻(xiàn)[28]的研究結(jié)果一致。

在肥胖小鼠體內(nèi)，血清抵抗素水平顯著上升，且血清抵抗素水平與機(jī)體胰島素抵抗程度呈正相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)：高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖能夠?qū)е翭0代和F1代小鼠精子形態(tài)畸形率顯著增加，小鼠精液參數(shù)異常，精子活力和密度降低，精子質(zhì)量下降，同時(shí)小鼠睪丸和精子超微結(jié)構(gòu)異常，造成雄性小鼠遺傳性的生殖功能的下降[32]。本試驗(yàn)中試驗(yàn)組雄性小鼠的精子活力顯著下降，小鼠精子畸形數(shù)量更多，畸形率相對略有升高，同時(shí)小鼠精子形態(tài)異常。睪丸組織樣本中試驗(yàn)組小鼠曲精小管直徑小于對照組，管腔相對較大，含有的生精細(xì)胞數(shù)目、層數(shù)相對較少，排列不規(guī)則。試驗(yàn)組小鼠睪丸出現(xiàn)超微結(jié)構(gòu)病變，與對照組相比出現(xiàn)了不同程度的凹陷、變形，胞質(zhì)出現(xiàn)部分空泡狀結(jié)構(gòu)，核膜的雙層膜結(jié)構(gòu)不完整，出現(xiàn)部分缺損，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)目較多，線粒體數(shù)目較少，且線粒體出現(xiàn)了一定程度的變形。結(jié)果表明：抵抗素對小鼠睪丸和精子的超微結(jié)構(gòu)以及精子相關(guān)參數(shù)產(chǎn)生了顯著影響。

4 結(jié)束語

本研究利用抵抗素重組蛋白進(jìn)行雄性小鼠尾靜脈注射，模擬高循環(huán)水平抵抗素狀態(tài)，觀察其對雄性小鼠生殖功能的影響，結(jié)果表明試驗(yàn)組小鼠血清E2質(zhì)量濃度和T質(zhì)量濃度均顯著高于對照組小鼠的，且精子活力顯著下降，精子形態(tài)異常，睪丸出現(xiàn)超微結(jié)構(gòu)變化，提示抵抗素能夠引起雄性小鼠血清生殖激素水平的變化，導(dǎo)致雄性小鼠生殖功能下降。