鳶尾屬藥用植物總DNA提取方法的比較研究

肖婷婷，朱 艷，葉波平，金國虔，秦民堅*

(1.中國藥科大學中藥資源學研究室，江蘇南京211198;2.教育部現(xiàn)代中藥研究重點實驗室，江蘇南京，210009;3.中國藥科大學生命科學與技術(shù)學院，江蘇 南京，210009)

鳶尾屬藥用植物總DNA提取方法的比較研究

肖婷婷1，2，朱 艷1，2，葉波平3，金國虔1，2，秦民堅1，2*

(1.中國藥科大學中藥資源學研究室，江蘇南京211198;2.教育部現(xiàn)代中藥研究重點實驗室，江蘇南京，210009;3.中國藥科大學生命科學與技術(shù)學院，江蘇 南京，210009)

以鳶尾屬(Iris L.)藥用植物鳶尾Iris tectorum Maxim.葉片為材料，分別采用CTAB法、高鹽低pH法、SDS法和試劑盒法四種方法提取植物總DNA，并通過瓊脂糖凝膠電泳、紫外分光光度計、ISSR和RAPD四種方法對所提取的DNA樣品進行檢測。結(jié)果表明，用SDS－Ⅰ法提取的植物總DNA純度、濃度和完整性都很高，從經(jīng)濟角度考慮優(yōu)于用試劑盒提取，從提取效果考慮不亞于用CTAB法和高鹽低pH法提取，是比較適合鳶尾屬植物總DNA提取的方法。

鳶尾屬;鳶尾;DNA提取;方法

鳶尾屬(Iris L.)是鳶尾科(Iridaceae)中最大的一個屬，全世界約有250余種，我國約產(chǎn)60個種、13個變種及5個變型，主要分布于西北、西南及東北等地［1］。鳶尾屬植物因其大多具有既可觀花又可觀葉的價值而被廣泛用于切花、盆栽及園林綠化等。鳶尾屬植物還具有重要的藥用價值，如鳶尾和射干是常用的中藥，其內(nèi)所含的主要化學成分均為黃酮類化合物，具有良好的清熱解毒、利咽消痰、消積、瀉下等作用。中國有較豐富的鳶尾屬野生資源，而野生資源往往蘊藏著更為豐富優(yōu)良的基因，是品種改良及種質(zhì)創(chuàng)新等重要的基因來源。但由于品質(zhì)繁多且在形態(tài)上比較相似，極易混淆和誤用，從而影響了藥材的質(zhì)量和效果。因此建立一種科學、可靠、方便的鑒定方法成了當務(wù)之急。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，DNA分子標記技術(shù)不僅在農(nóng)業(yè)上對植物選種、育種和改良等方面的應(yīng)用穩(wěn)步增長，而且在中藥資源、鑒定、栽培等方面也有著很好的發(fā)展前景。其中，如何有效地提取高質(zhì)量的植物DNA已成為藥用植物種質(zhì)資源研究的一個重要方面。植物DNA的有效提取，它是進行任何分子生物學工作的前提和基礎(chǔ)，也是最關(guān)鍵的一步［2］。鳶尾屬藥用植物總DNA提取方法的比較研究在國內(nèi)外未有相關(guān)報道，本文就如何提取高質(zhì)量的植物總DNA為目的，主要探索鳶尾屬植物總DNA的提取方法，為進一步展開鳶尾屬藥用植物種質(zhì)資源方面的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料與試劑

試驗材料選用鳶尾屬植物鳶尾(Iris tectorum Maxim.)，采自中國藥科大學藥用植物園，經(jīng)作者鑒定，秦民堅教授復核。

DNA提取緩沖液的配制：提取緩沖液A：稱取NaCl 2.92 g，PVP 2 g，SDS 1.4 g，無水醋酸鈉 0.82 g，溶于 60 mL dd H2O 中，加 0.5 mol/L EDTA 10 mL，用冰醋酸調(diào)pH值至5.51，加 dd H2O定容至100 mL。

提取緩沖液 B：取1 mol/L Tris－HCl 2.5 mL，0.5 mol/L EDTA 10 mL，10%SDS 5mL，加 dd H2O定容至100 mL。

提取緩沖液 C：稱取 CTAB 2 g，PVP 1 g，NaCl 8.182 g，加入 70 mL dd H2O，加熱溶解，再加入1 mol/L Tris－HCl 10 mL，0.5 mol/L EDTA 4 mL，然后加dd H2O定容至100 mL。

提取緩沖液D：稱取NaCl 8.182 g，加入1 mol/L Tris－HCl 10 mL，0.5 mol/L EDTA 4 mL，然后加 dd H2O定容至100 mL。(用前加2%CTAB 2 g，2%PVP 2 g)

PCR分析用Taq DNA聚合酶，dNTPs和引物均購自上海生物技術(shù)有限公司，所用儀器為PE－9600 PCR擴增儀。

1.2 實驗方法

各提取緩沖液用前均加入0.2% β－巰基乙醇。

在裝有材料的每管離心管中加入65℃ 預熱的1～1.5 mL的提取緩沖液，于65℃水浴中保溫。用CTAB提取液提取的保溫1 h，用SDS或高鹽低pH提取液提取的保溫30～60 min，保溫期間不時搖動。然后，以下述方法分別進行提取。

1.2.1 高鹽低pH法［3］

采用提取緩沖液A進行提取。然后10000 r/min離心10 min，取上清液加入2/3體積2.5 mol/L KAc(pH 4.8)，－20℃放置30 min后，10000 r/min離心10 min，取上清液加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，10000 r/min 離心 10 min，反復抽提至中間層無白色沉淀。上清液加入等體積的異丙醇，置－20℃過夜。15000 r/min離心15 min，沉淀用75%乙醇洗兩次，吹干后加適量TE溶解，－20℃保存。

1.2.2 SDS法

采用提取緩沖液B進行提取。8000 r/min離心5 min。分別以下述兩種方法進行提取。

①上清液加入1/10體積的5 mol/L KAc，混勻后－20℃放置30 min，13000 r/min離心15 min，上清液加入2/3體積的異丙醇，置 －20℃過夜。12000 r/min離心10 min，沉淀用75%乙醇洗兩次，吹干后加適量TE溶解，－20℃保存。

②上清液加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，10000 r/min離心10 min，反復抽提至中間層無白色沉淀。上清液加入2/3體積的異丙醇，置－20℃過夜。12000 r/min離心10 min，沉淀用75%乙醇洗兩次，吹干后加適量TE溶解，－20℃保存。

1.2.3 CTAB法

分別采用提取緩沖液C，提取緩沖液D進行提取。

上清液加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，10000 r/min離心10 min，反復抽提至中間層無白色沉淀。上清液加入2/3體積的異丙醇，置－20℃過夜(或采用加入1/10體積3 mol/L NaAc和2倍體積無水乙醇沉淀DNA過夜)。12000 r/min離心10 min，沉淀用75%乙醇洗2次，吹干后加適量TE溶解，－20℃ 保存。

1.2.4 試劑盒法

采用AXYGEN AxyPrep基因組DNA小量制備試劑盒按說明書操作步驟進行提取DNA。

2 結(jié)果與分析

2.1 電泳檢測

以上各方法得到的DNA取3～5 μL于1%瓊脂糖凝膠電泳，電壓80V，電泳40 min左右，在凝膠成像系統(tǒng)下檢測DNA條帶情況。

圖1 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品M：λ －Hind Ⅲ Digest;1，2：試劑盒法

圖2 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品M：λ－HindⅢ Digest;1－4：CTAB法

圖3 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品M：λ －HindⅢ Digest;1，2：高鹽低 pH 法;3－5：SDS－Ⅰ法

圖4 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品M：λ－HindⅢ Digest;1－3：SDS－Ⅰ法;4－9：SDS－Ⅱ法

從提取所得到的DNA外觀上看，用高鹽低pH法和CTAB法所得到的DNA均為乳白色，吹干后呈透明狀，而用SDS法所得到的DNA少數(shù)略帶褐色，大多數(shù)也為乳白色。從DNA電泳檢測結(jié)果看，如圖1－4，由試劑盒法、高鹽低 pH法、SDS－Ⅰ法和CTAB法得到的DNA條帶清晰無拖尾，表明所提的DNA純度和完整性都很好，由SDS－Ⅱ法得到的DNA條帶顏色暗淡且略有拖尾，點樣孔處略有發(fā)亮，表明所提的DNA純度和完整性與其他幾種方法所提的DNA相比較差。

2.2 DNA純度檢測

取10 μL DNA溶液稀釋100倍后，用紫外分光光度計分別測定波長230 nm、260 nm及280 nm的光吸收值。計算A260/280、A260/230的比值。當2>A260/280≥1.8，A260/230≥2，表明 DNA 為純，此時DNA中蛋白質(zhì)、酚類及色素、RNA等雜質(zhì)含量較少，DNA質(zhì)量符合要求。部分結(jié)果見表1，可知，由試劑盒法、高鹽低pH法、SDS－Ⅰ法和CTAB法得到的DNA質(zhì)量都很好，其中，試劑盒法的A260/280約為1.80，說明DNA很純，幾乎沒有其他雜質(zhì)的污染，SDS－Ⅰ法和CTAB法(用提取緩沖液D)：1.9>A260/280≥1.8，說明DNA也較純，DNA中蛋白質(zhì)、酚類及色素、RNA等雜質(zhì)含量較少，高鹽低pH法和CTAB法(用提取緩沖液C)的A260/280>1.9，說明有少量RNA污染，SDS－Ⅱ法得到的DNA質(zhì)量較差，A260/280<1.6，說明有蛋白質(zhì)或酚污染，其A260/230<2，說明有殘存的鹽和小分子雜質(zhì)［4］。

表1 6種提取方法所得DNA樣品的純度

2.3 PCR擴增反應(yīng)檢測

將不同提取方法提取出來的DNA進行PCR擴增反應(yīng)。

2.3.1 ISSR反應(yīng)

ISSR反應(yīng)引物：(AG)8TT。ISSR擴增反應(yīng)總體積為 20 μL，其中包括 1U Taq DNA聚合酶，2.0 μL 10 × PCR buffer，1.6μL 25 mmol· L－1MgCl2，0.5 μL 10 mmol·L－1dNTPs，0.6μL 10mmol·L－1引物和40 ng DNA模板。PCR反應(yīng)程序為：94℃ 預變性3 min;然后進行40個循環(huán)反應(yīng)，反應(yīng)條件為94℃變性45 s，56℃ ～60℃退火30 s，72℃延伸1.5 min;最后于72℃延伸5 min。

2.3.2 RAPD反應(yīng)

RAPD反應(yīng)引物：GACCGCTTGT。RAPD擴增反應(yīng)總體積為20 μL，其中包括1U Taq DNA聚合酶，2.0 μL 10 × PCR buffer，1.6μL 25 mmol·L－1MgCl2，0.5 μL 10 mmol·L－1dNTPs，1 μL 4 mmol·L－1引物和20 ng DNA模板。PCR反應(yīng)程序為：94℃ 預變性5 min;然后進行40個循環(huán)反應(yīng)，反應(yīng)條件為94℃變性1 min，38℃退火1 min，72℃延伸2 min;最后于72℃延伸7 min。

ISSR和RAPD擴增產(chǎn)物均4℃保存?zhèn)溆?。RAPD和ISSR擴增產(chǎn)物分別在1%瓊脂糖電泳，結(jié)果如圖5，6。由圖可以看出，由試劑盒法、高鹽低pH法、SDS－Ⅰ法和CTAB法得到的DNA能很好的進行擴增反應(yīng)，擴增條帶清晰且沒有缺失，而由SDS－Ⅱ法得到的DNA進行擴增反應(yīng)時會出現(xiàn)條帶擴增不穩(wěn)定，會出現(xiàn)條帶的缺失，說明DNA本身的質(zhì)量不好，受其他雜質(zhì)的污染嚴重。

圖5 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測以樣品DNA為模板進行ISSR反應(yīng)的產(chǎn)物1，7，8，9：SDS － Ⅱ法;2：CTAB 法;3：高鹽低 pH 法;4，5：SDS － Ⅰ法;6：試劑盒法

圖6 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測以樣品DNA為模板進行RAPD反應(yīng)的產(chǎn)物1，6，7：SDS － Ⅱ法;2：試劑盒法;3：CTAB 法;4：高鹽低 pH 法;5：SDS－Ⅰ法

3 討論

CTAB是一種陽離子去污劑，既能有效裂解植物細胞壁，又能去除多糖類物質(zhì)，對于含糖較高的材料可優(yōu)先采用，改良后效果更佳。一般來說，CTAB緩沖液比較適合草本植物和不含酚類或含酚類較少的植物DNA提取。但對木本植物和酚類含量豐富的植物，適當提高CTAB的濃度也可以得到質(zhì)量較高的 DNA［5］。CTAB法對許多新鮮植物基因組DNA的提取是較為適用的，但對于干品中藥材的DNA的提取純度不高［6］。SDS緩沖液在植物基因組DNA的提取應(yīng)用中較少，主要應(yīng)用于對模板DNA質(zhì)量要求不太嚴的RAPD分析［7］，本身多糖含量不高的材料或其含量不致影響后續(xù)實驗分析的樣品［8］。但有時SDS緩沖液或經(jīng)過改進的SDS緩沖液的處理效果等同于或更甚于CTAB的處理效果［9－12］。高鹽低pH值法中的提取介質(zhì)能有效防止組織破碎及沉淀大量材料時電離化作用及酚化合物進一步氧化［13］，所得的DNA純度高，無須進一步純化，可直接進行后續(xù)反應(yīng)(如PCR擴增)。鳶尾屬葉片主要含黃酮類物質(zhì)，含較少的酚類及多糖類物質(zhì)，對比圖1可看出，由試劑盒法、高鹽低pH法、SDS－Ⅰ法和CTAB法得到的DNA純度和完整性都很好，SDS－Ⅱ法得到的DNA純度和完整性較差。

CTAB提取緩沖液中PVP的含量會影響DNA的提取效果。PVP是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，能有效的去除多酚，減少DNA中酚的污染，同時也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖。由圖5和表1可以看出，含2%PVP比1%PVP的提取緩沖液提取所得到的DNA更純，濃度更高。

圖7 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品M：λ－HindⅢ Digest;1，2：CTAB法(用提取緩沖液C);3－5：CTAB法(用提取緩沖液D)

用異丙醇沉淀DNA過夜與用加入1/10體積3 mol/L NaAc和2倍體積無水乙醇沉淀DNA過夜效果相當(如圖7中，1和2做比較，4和5做比較)，且所用試劑量少，種類少，減少試劑和操作步驟不必要的污染，減少損失DNA，有利于提高DNA的得率和DNA的純度。

本實驗沒有加入RNase去除RNA，也沒有進行DNA的濃縮和純化等步驟，但已經(jīng)取得了純度、完整性和濃度都較高的DNA，如果有需要更高質(zhì)量的DNA，建議可以用RNase消化RNA，使用有機溶劑抽提或氯化銫梯度離心等方法進一步純化DNA［14］。

DNA提取過程中，影響提取效果的因素很多，如葉片研磨的充分與否、吸取上清液時有無吸出蛋白層，DNA溶液暴露于空氣中被氧化的程度以及旋轉(zhuǎn)速度等。本實驗用液氮研磨葉片時，粉末研得越細越好，且轉(zhuǎn)移入離心管保存時應(yīng)迅速，以免造成DNA的降解。用氯仿∶異戊醇(24∶1)進行抽提離心后，在轉(zhuǎn)移含有DNA的上清液時均采用剪去端部的吸頭，減少吸頭吸取時的剪切力，能有效避免吸入中間層的白色沉淀及減少DNA受到的機械損傷，保證了DNA的純度及完整性。用氯仿∶異戊醇(24∶1)進行抽提時，在離心前增加氯仿∶異戊醇(24∶1)和提取緩沖液的接觸時間，能讓雜質(zhì)更好地被分離，減少用氯仿∶異戊醇(24∶1)的抽提次數(shù)，因為在抽提的操作中抽提次數(shù)的重復并不一定改善DNA的純度，有時負面作用反而增加［15］，從而能有效地避免操作過程中DNA的污染。本實驗的結(jié)果是在盡量使得各影響因素最下的情況下取得的，因此，要想獲得純度高、質(zhì)量好的DNA，除了提取方法上的選擇之外，還需要操作技術(shù)上的嚴格。

綜上所述，由高鹽低pH法和CTAB法得到的DNA純度高，含量多，適用于大多數(shù)材料DNA的提取，但比較費時，操作步驟繁瑣且使用有機溶劑，有損于操作者的健康。試劑盒法適用于多個樣品同時操作，快速、準確、方便，無需酚、氯仿或SDS抽提且不含PCR反應(yīng)抑制藥及其他酶反應(yīng)抑制藥，可被各種限制性內(nèi)切酶完全降解［2］，提取得到的DNA純度也高，但價格昂貴，適用于微量或珍貴稀有材料DNA的提取。醋酸鉀是有效的蛋白質(zhì)沉淀劑，比起用氯仿：異戊醇分層反復抽提去蛋白質(zhì)，操作方便、省時，從經(jīng)濟角度和提取效果考慮，SDS－Ⅰ法所需的試劑只是無機鹽和異丙醇，不需要使用氯仿∶異戊醇(24∶1)反復抽提，操作簡單、溫和，省時省力也避免了DNA不必要的污染或損失，相比較CTAB法試劑的昂貴和有毒性及高鹽低pH值法試劑的有毒性，SDS－Ⅰ法有明顯的優(yōu)勢，比較適用于鳶尾屬植物總DNA提取。

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Comparison of Methods of DNA Extraction from Iris L.

Xiao Tingting1，2，Zhu Yan1，2，Ye Boping3，Jin Guoqian1，2，Qin Minjian1，2
(1.Department of Resources Science of Traditional Chinese Medicines，China Pharmaceutical University，Nanjing 211198，China;2.Key Laboratory of Modern Traditional Chinese Medicines of Ministry of Education，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China;3.College of Life Science and Technology，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China)

Using the leaves of Iris L.as test material，the effects of DNA extraction were comparatively analyzed among the CTAB method，high salt method，SDS method and DNA Minprep kit method by means of agarose gel electrophoresis，UV，ISSR and RAPD.The experiment results showed that the SDS－Ⅰmethod was the best DNA extraction for Iris L..

Iris L.;Iris tectorum Maxim.;DNA extraction;Method

Q523

A

1006－9690(2010)03－0046－05

10.3969/j.issn.1006－ 9690.2010.03.011

2009－10－18

國家科技基礎(chǔ)條件平臺工作項目(2005DKA21004)

肖婷婷(1984－)，女，研究生，主要從事藥用植物種質(zhì)資源及其質(zhì)量評價的研究。

* 通訊作者。E－mail：minjianqin@163.com