植物抗病毒基因及其介導(dǎo)的抗性機(jī)理

郭子坤，劉瀚錚，李繼平

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，甘肅 蘭州 730070)

目前，病毒病害在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上造成的危害和損失越來越嚴(yán)重。僅以馬鈴薯為例，PVX和PVY兩種病毒引起的產(chǎn)量損失分別達(dá)到10%和80%。由于病毒在植物細(xì)胞內(nèi)寄生，所以對其防治非常困難，尚未找到理想的防治藥劑，傳統(tǒng)的雜交育種對此問題亦無良策。然而隨著分子生物學(xué)研究的不斷深化和基因工程技術(shù)的進(jìn)一步完善，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在培育作物抗病毒新品種方面暫露頭角。該項(xiàng)技術(shù)能否取得成功并走向成熟的關(guān)鍵就是植物抗病毒基因的獲取及其作用機(jī)理的研究，經(jīng)過30余年的努力，這一領(lǐng)域成果頗豐，并將不斷取得新的進(jìn)展。

1源自病毒的抗病毒基因

1.1 外殼蛋白基因

對于病毒病而言，由外殼蛋白基因介導(dǎo)的植物抗性首次報(bào)道于1986年，當(dāng)年P(guān)owel等[1]在煙草中導(dǎo)入TMV基因，結(jié)果獲得抗TMV的轉(zhuǎn)基因植株。以后有學(xué)者把含有黑麥草花葉病毒(RGMV)外殼蛋白基因的CPTAG結(jié)構(gòu)導(dǎo)入黑麥草，試驗(yàn)證明，多數(shù)轉(zhuǎn)入外殼蛋白基因的植株對病毒產(chǎn)生抗性[2]。L3是番茄斑萎病毒(TSWV)的一個(gè)保加利亞隔離株系，Stoeva等[3]觀察了表達(dá)該株系核蛋白基因正義結(jié)構(gòu)的12種商用煙草(Nicotianatabacum)栽培品種對TSWV的長期抗性，結(jié)果顯示，不論轉(zhuǎn)基因表達(dá)翻譯的產(chǎn)物是否達(dá)到可檢測的水平，也不論是在溫室或大田條件下，抗性均能穩(wěn)定遺傳下去。Jacquet等[4]發(fā)現(xiàn)，含有經(jīng)修飾和酶切的李子皰疹病毒外殼蛋白基因片段的轉(zhuǎn)基因植株高抗李子皰疹病毒(PPV)；他們先對兩個(gè)PPV外殼蛋白基因進(jìn)行修飾和酶切，以減輕生物學(xué)上異源外殼化風(fēng)險(xiǎn)，再將這兩種結(jié)構(gòu)通過農(nóng)桿菌導(dǎo)入Nicotianabenthamiana植株；在第一個(gè)結(jié)構(gòu)中刪除了蚜傳PPV病毒所含有的編碼DAG三聯(lián)體氨基酸的9個(gè)核苷酸，在第二個(gè)結(jié)構(gòu)中，PPV外殼蛋白基因首位420個(gè)核苷酸被去掉。Sherman等[5]將3種番茄斑萎病毒外殼蛋白基因結(jié)構(gòu)通過土壤農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化作用導(dǎo)入菊花(Dendranthemagrandigqoracv. Polaris)，這3種結(jié)構(gòu)分別包含一個(gè)全長的外殼蛋白基因(PTSWVN+)；一個(gè)外殼蛋白基因，但編碼截去頂端的外殼蛋白(PTSWVNt)；一個(gè)反義翻譯的全長外殼蛋白基因(PTSWVN-)，所有這些均來自大麗花屬分離物TSWV(TSWV-D)。 對 152PTSWVN+、37PTSWVNt和47PTSWVN-轉(zhuǎn)導(dǎo)植株的插條進(jìn)行初步抗性篩選，所用的高毒、異源TSWV毒株(TSWV-GB)分離自菊花或由薊馬(Frankliniellaoccidentalis)接種。通過篩選剔除大多數(shù)TSWV感病轉(zhuǎn)基因株系。3輪機(jī)械接種抗性試驗(yàn)表明，一個(gè)PTSWVNt和兩個(gè)PTSWVN-轉(zhuǎn)導(dǎo)株系沒有表現(xiàn)系統(tǒng)癥狀，也沒有病毒量上的積累。6個(gè)其他株系(包括一些PTSWVN+株系)未表現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)TSWV毀滅性壞死癥狀(莖潰瘍和頂芽壞死)，而且在癥狀表現(xiàn)上出現(xiàn)延遲現(xiàn)象?？砂l(fā)現(xiàn)在菊花上不論正義和反義結(jié)構(gòu)均可增強(qiáng)其對TSWV的抗性。分子分析顯示，高抗TSWV的PTSWVNt株系沒有可檢測的外殼蛋白水平。所有3個(gè)抗性株系有低水平的外殼蛋白基因轉(zhuǎn)錄本，而且在它們的基因組中至少有3個(gè)轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)，盡管感病株系的插入位點(diǎn)與此相似。

近年來，國內(nèi)學(xué)者在外殼蛋白基因介導(dǎo)的植物抗病性研究方面也做了大量工作。劉佳等[6]將番茄不孕病毒(TAV)和菊花B病毒(CVB)的外殼蛋白TAV-CP與CVB-CP基因的部分片段，拼接成CBT基因，構(gòu)建植物表達(dá)載體，該項(xiàng)研究對今后培育抗病毒菊花品種意義重大。田莉莉等[7]為獲得抗病毒的轉(zhuǎn)基因植物新材料，采用PCR方法克隆獲得489 bp的ASPV外殼蛋白基因的保守片段，得到Phe-ASPV，將其轉(zhuǎn)入EHA105，得到植物遺傳轉(zhuǎn)化工程菌EH-ASPV。王建輝等[8]在pBI121 質(zhì)粒 35S 啟動子后插入具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的葡萄病毒A(GVA)外殼蛋白基因片段后轉(zhuǎn)化EHA105，農(nóng)桿菌瞬時(shí)浸潤本氏煙葉片 5 d 后發(fā)現(xiàn)，對照組植株表現(xiàn)黃化癥狀，而瞬時(shí)表達(dá)病毒外殼蛋白基因的處理組植株癥狀不明顯。2020年有報(bào)道[9]稱，得到表達(dá)CWMV CP基因的煙草Nicotianabenthamiana，導(dǎo)入的 CP 基因使煙草對CWMV 的抗性顯著增強(qiáng)。

CP介導(dǎo)的抗性作用機(jī)理比較復(fù)雜，尚未有統(tǒng)一的模型可加以解釋。目前主要有4種觀點(diǎn)：①CP的表達(dá)抑制了病毒的脫殼。②由于轉(zhuǎn)基因在細(xì)胞大量表達(dá)CP蛋白，病毒裸露核酸入侵后，被其迅速包裹，從而阻止了核酸的復(fù)制。③阻斷病毒粒子的擴(kuò)展與運(yùn)轉(zhuǎn)。④轉(zhuǎn)入的CP基因在植物細(xì)胞表達(dá)mRNA，它們與病毒RNA相互作用，以此產(chǎn)生抗性。

1.2 病毒復(fù)制酶基因

在關(guān)于病毒復(fù)制酶介導(dǎo)的抗性研究中，有學(xué)者將PEBV(豌豆早褐病毒)復(fù)制酶核酸片段導(dǎo)入煙草，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在100 u g/mL的接種量下，成功轉(zhuǎn)入復(fù)制酶基因的植株仍高度抵抗病毒[10]。目前，復(fù)制酶介導(dǎo)的保護(hù)作用已在10多個(gè)病毒屬中得到研究[11]，涉及13種病毒。

對于病毒復(fù)制酶基因介導(dǎo)的抗性，多數(shù)學(xué)者接受的解釋有兩種：①認(rèn)為轉(zhuǎn)入的復(fù)制酶基因在植株體內(nèi)的表達(dá)反向調(diào)控了病毒復(fù)制，使復(fù)制率明顯降低；②認(rèn)為象噬菌體Qβ那樣，轉(zhuǎn)入的復(fù)制酶基因在植株體內(nèi)表達(dá)突變的復(fù)制酶，可能與復(fù)制酶的野生型發(fā)生競爭，打亂了病毒復(fù)制，因此使植物產(chǎn)生抗病毒能力[12]。

1.3 病毒運(yùn)動蛋白基因

Tacke等[13]研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)黃矮病毒屬的17 ku MP突變體馬鈴薯，不僅抵抗黃矮病毒的侵染，而且抵抗PVX和PVY的侵染。Cooper等[14]獲得含有突變的TMV運(yùn)動蛋白基因的轉(zhuǎn)基因煙草植株，攻毒試驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)基因植株對煙草花葉病毒組等多個(gè)病毒組的病毒具有廣譜抗性。另有學(xué)者得到表達(dá)P24蛋白的轉(zhuǎn)基因煙草植株(NicotianatabacumXanti D8 NN)，P24蛋白是3個(gè)交結(jié)在一起的PVX局部運(yùn)動蛋白之一。體內(nèi)有最高水平P24蛋白積累的植株顯示矮化和輕微褪綠表現(xiàn)型。這些轉(zhuǎn)基因植株可使PVX突變體(該突變體在P24蛋白上產(chǎn)生一個(gè)移碼突變)在細(xì)胞之間的移動更加容易。用TMV接種后，P24+植株上的局部壞死病斑顯著小于未轉(zhuǎn)化的對照植株；當(dāng)用Ob病毒(Ob病毒能夠躲避N基因引起的過敏性反應(yīng))接種后，已轉(zhuǎn)化的植株在系統(tǒng)抗性方面表現(xiàn)明顯，未觀察到系統(tǒng)癥狀；而且Western免疫病斑分析和回接分析均表明，病毒的積累保持低水平或無法檢測到病毒[15]。Cui等[16]在中國7個(gè)地區(qū)隨機(jī)采集的166份(21.1 %)李樣品中，檢測到35份呈現(xiàn)PNRSV陽性，15個(gè)分離株的運(yùn)動蛋白基因(MP)具有82.9%～99.9 %的核苷酸序列同源性，對MP基因序列采用系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示分離物PV96、PV32和PE5為3個(gè)明確的系統(tǒng)發(fā)育群，該結(jié)果對MP基因介導(dǎo)抗性的研究有參考價(jià)值。劉曉玲等[17]采用PVX為研究對象，將其運(yùn)動蛋白基因(PVX-p25)轉(zhuǎn)化煙草NC89，經(jīng)篩選和PCR檢測，共獲得轉(zhuǎn)非翻譯PVX-p25的轉(zhuǎn)基因植株78株，結(jié)果表明，其中的31株對PVX具有高度抗病，比例達(dá)到39.7%。

由于轉(zhuǎn)入植物體內(nèi)的MP基因所表達(dá)的MP蛋白不具備病毒MP蛋白的功能，但它們與野生型病毒MP具有競爭關(guān)系，競相爭奪位于胞間連絲上的結(jié)合位點(diǎn)，從而阻礙病毒粒子在宿主體內(nèi)的轉(zhuǎn)移與擴(kuò)散。

2 與病毒基因相關(guān)的其他基因序列

2.1 病毒衛(wèi)星RNA

衛(wèi)星RNA是多核苷酸，它們往往存在于輔助病毒中，依據(jù)輔助病毒的復(fù)制與傳播機(jī)理，從一個(gè)植株傳到另一個(gè)植株，它們與作為其宿主的輔助病毒核苷酸異源，對病毒的復(fù)制也不起作用，但是衛(wèi)星RNA可以改變其輔助病毒致病力。

衛(wèi)星RNA最初由Kaper發(fā)現(xiàn)。Stommel等[18]把表達(dá)黃瓜花葉病毒的一個(gè)改良衛(wèi)星RNA導(dǎo)入兩種易感基因型，獲得3株轉(zhuǎn)基因番茄植株。對它們進(jìn)行兩個(gè)生長季節(jié)的觀察，以評估其病毒癥狀、效價(jià)、衛(wèi)星RNA的表達(dá)及果實(shí)產(chǎn)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)較輕或無CMV癥狀且效價(jià)較低(與未轉(zhuǎn)化植株相比)。轉(zhuǎn)基因植株上衛(wèi)星RNA水平與病害嚴(yán)重程度之間存在明顯負(fù)相關(guān)關(guān)系。CMV病毒感染的衛(wèi)星轉(zhuǎn)基因植株總的可銷售產(chǎn)量比CMV感染的父母本植株提高40%～84%。尤其是，轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)量與父母代植株無顯著性差異。風(fēng)險(xiǎn)評估證明，在試驗(yàn)場所范圍內(nèi)衛(wèi)星RNA傳播水平較低且無對周圍植物造成危害的證據(jù)。Taliansky等[19]選用花生叢病毒(GRV)弱毒衛(wèi)星RNA的全長序列，將其導(dǎo)入本生煙，獲得轉(zhuǎn)基因植株，當(dāng)GRV和強(qiáng)毒衛(wèi)星RNA接種時(shí)，轉(zhuǎn)基因植株未顯癥。顧沛雯等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，利用CMV的衛(wèi)星RNA生防制劑S52免疫辣椒，田間對比試驗(yàn)顯示，免疫接種50 d的防效達(dá)71.2%～84.2%，免疫接種80 d的防效達(dá)55.9%～70.2%，由此可見，CMV衛(wèi)星RNA作為抗病毒基因材料，在辣椒抗病毒轉(zhuǎn)基因育種方面亦將大有作為。

衛(wèi)星RNA介導(dǎo)的抗性機(jī)理尚未完全搞清。一般認(rèn)為，可能由于競爭病毒RNA復(fù)制酶而誘發(fā)抗性。

2.2 正義與反義RNA

反義RNA和正義RNA均可介導(dǎo)植物的抗病性。Tavert等[21]曾設(shè)計(jì)了兩種李樹水痘病毒(PPV)的Pl基因結(jié)構(gòu)，隨后將這兩種P1基因通過農(nóng)桿菌導(dǎo)入Nicotianabenthamiana植株，當(dāng)用PPV病毒接種時(shí)，轉(zhuǎn)基因植株或免疫或恢復(fù)感染。生化分析結(jié)果表明，抗性表現(xiàn)型與轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄的水平相關(guān)聯(lián)。Scharer等[22]把花椰菜花葉病毒(CaMV)35S RNA先導(dǎo)序列導(dǎo)入煙草而獲得抗病毒的轉(zhuǎn)基因植株；他們還研究了在轉(zhuǎn)基因煙草植株體內(nèi)35S RNA先導(dǎo)序列對下游 葡糖苷酸酶(GUS)報(bào)告基因表達(dá)的影響。Marano等[23]的研究發(fā)現(xiàn)，含有煙草花葉病毒Ul株系(TMV Ul)開放閱讀框(ORF)基因的轉(zhuǎn)基因植株可抵抗TMV-U1的入侵；但它們不抗十字花科植物的TMV病毒株系，然而這些轉(zhuǎn)基因植株對含有54 ku開放閱讀框(ORF)的PVX卻產(chǎn)生抗性，無論該ORF是正向或反問嵌入。蔡群芳等[24]構(gòu)建RNA正義、反義表達(dá)載體并導(dǎo)入農(nóng)桿菌，獲得相應(yīng)的農(nóng)桿菌工程菌株，對以后開展番木瓜抗PRSV育種工作奠定了基礎(chǔ)。

RNA介導(dǎo)的抗性存在復(fù)雜的相互作用過程，反義RNA表現(xiàn)的抗性可能是因轉(zhuǎn)基因RNA與病毒RNA直接相互作用所致，這種相互作用有不同的組織特異性RNA表達(dá)(Harnmond等，1995);正義RNA則通過交叉保護(hù)機(jī)制干擾病毒的復(fù)制，也有人認(rèn)為正義RNA具有與原編碼蛋白一致的ORF，但在植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄不能翻譯出有功能的蛋白，從而達(dá)到抗病毒的目的。

2.3 缺陷干擾顆粒

缺陷干擾顆粒(Defective interfering particles，DIP)是不能自身進(jìn)行復(fù)制的缺陷病毒，但具有干擾同種成熟病毒進(jìn)入細(xì)胞的能力。DIP最早是由Huang于1970年提出，它存在于多種動物病毒和植物病毒中，是病毒的一種分子寄生物。盡管衛(wèi)星RNA也屬于分子寄生物，但二者與其宿主的來源不同，DIP與其宿主病毒核酸同源，可它在病毒核酸中有不連續(xù)體。DIP本身不能增殖，也不能產(chǎn)生干擾性病毒，但當(dāng)DIP序列在轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)時(shí)，其與接種病毒競爭復(fù)制，從而干擾接種病毒的復(fù)制。Imad等[25]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)黃網(wǎng)病毒缺陷干擾顆粒轉(zhuǎn)化處理的Nicotianaedwardsonii，接種 SYNV(苦苣菜黃網(wǎng)病毒，SonchusYellow Net Virus)5個(gè)月后，用電鏡檢查煙株，在葉片和根細(xì)胞中均未觀察到病毒粒子。Marsh等發(fā)現(xiàn)，用BMV的RNA2構(gòu)建DIP，其在大麥原生質(zhì)體內(nèi)對病毒復(fù)制產(chǎn)生干擾。

DIP干擾病毒復(fù)制的機(jī)理為：①DIP對RNA聚合酶的親和力大于正常病毒的親和力，在核酸復(fù)制過程中，兩者競爭導(dǎo)致正常病毒不能有效結(jié)合RNA聚合酶而使子代病毒產(chǎn)量下降；②由于DIP缺損了一段核酸，因此，在復(fù)制過程中，它比正常病毒更快，占用了大量的RNA聚合酶而干擾了正常病毒的復(fù)制；③阻礙病毒的包裝、釋放和入侵[26]。

2.4 核酶基因

1981年Cech和Alfman在研究四膜蟲mRNA前體的剪接時(shí)，首次發(fā)現(xiàn)核酶。Kidmtop等[27]認(rèn)為，核酶可與相應(yīng)的特異序列RNA底物結(jié)合，具有切割功能。Natsoulis等于1991年提出可將CP和核酶連接構(gòu)成融合蛋白，組裝成病毒外殼，因它具有核酶活性，可在特定條件下特異降解病毒核酸，達(dá)到抗病毒的目的。Feyter等[28]則將核酶和反義基因相結(jié)合轉(zhuǎn)化煙草，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株對TMV抗性較高。Yang等[29]根據(jù)馬鈴薯紡錘塊莖類病毒(Potato spindle tuber viroid)基因組的特定區(qū)域序列設(shè)計(jì)核酶基因，并將之導(dǎo)入馬鈴薯植株，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株高抗馬鈴薯紡錘塊莖類病毒。

在國內(nèi)，劉力等[30]則設(shè)計(jì)合成了特異切割水稻條紋葉枯病毒RNA保守區(qū)及編碼病害特異性蛋白(Disease specific protein，DSP)基因的核酶，兩種核酶基因長度均為40個(gè)堿基，序列測定表明，克隆得到的核酶序列與設(shè)計(jì)的核酶序列完全一致，在體外均具有特異性切割活性，為培育在水稻體內(nèi)切割病毒RNA分子的轉(zhuǎn)基因抗病毒品種提供了思路。另外，還有孔衛(wèi)青等[31]、張劍峰等[32]分別克隆對?；ㄈ~萎縮類病毒及馬鈴薯卷葉病毒具切割能力的核酶基因，并獲得轉(zhuǎn)錄載體，為通過基因工程手段培育桑樹和馬鈴薯抗病毒品種做了有益的前瞻性探索。

3 源自植物的抗病毒基因

植物在長期與病毒相互斗爭的過程中形成一套對付病毒等病原物侵染的防御機(jī)制，也就是說植物本身存在抗性基因，通過這些基因的表達(dá)，可產(chǎn)生某些特定的蛋白質(zhì)以抗拒病毒入侵。雖然目前人們對植物抗病毒基因賦予植物抗性的機(jī)理了解較少，但將這些基因?qū)胫参镆垣@得抗病毒轉(zhuǎn)基因植株無疑具有廣闊前景。

3.1 潛在自殺基因

在植物潛在自殺基因方面，N基因的研究已有成效，有研究表明，含有N基因的煙草在接種TMV后能誘發(fā)過敏性壞死性反應(yīng)(Whitham等，1994)。其他植物潛在自殺基因的研究鮮見報(bào)道。

潛在自殺基因本來就屬于植物基因，只是它在正常情況下不引發(fā)植物細(xì)胞的死亡，比如在普通品種中表現(xiàn)隱形，在野生品種中表現(xiàn)顯性，只有顯性情況下一旦遭遇入侵病毒，發(fā)生互作時(shí)才引發(fā)宿主細(xì)胞凋亡，保護(hù)附近健康的植物細(xì)胞不被感染。

3.2 病程相關(guān)蛋白基因

當(dāng)植物遭受病毒及病原物侵染后，植株便會產(chǎn)生一類病程相關(guān)蛋白(PR)，PR蛋白由植物自身編碼。PR蛋白可分為5組，第1組與植物對病毒的抗性有關(guān)，如辣椒攜帶的ya(pr21)抗性基因?qū)VY和TEV具有有效的抗性，當(dāng)辣椒植株受到侵染時(shí)，病毒在侵染細(xì)胞內(nèi)增殖，不能產(chǎn)生系統(tǒng)性的擴(kuò)散(Hinrichs等，1997)。植物轉(zhuǎn)入病程相關(guān)蛋白基因后，其介導(dǎo)的抗性機(jī)理可能與轉(zhuǎn)基因表達(dá)的PR蛋白參與植物細(xì)胞壁抗侵染有關(guān)，也可能與它們協(xié)調(diào)作用有關(guān)。

3.3 核糖體失活蛋白基因

核糖體失活蛋白(RIP)廣泛存在于高等植物中，有兩種類型：I型為單鏈堿性蛋白質(zhì)，分子量約為30 ku，II型為由A、B兩條肽鏈通過二硫鍵組成的二聚體，分子量約為60 ku。RIP主要具有RNA N-糖苷酸酶活性，有些RIP則以其核酸酶(RNase)活性起作用。美洲商陸抗病毒蛋白(PAP)是一種RIP蛋白，從美洲商陸(Phytolaccaamericana)葉片中分離出得到，其分子量約30 ku，Lodge等[33]對轉(zhuǎn)PAP基因植株進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株對多種病毒表現(xiàn)抗性。Krishnan等[34]對另一種核糖體失活蛋白基因(天花粉蛋白基因)的研究顯示，表達(dá)天花粉蛋白前體基因的植株對CMV和TMV系統(tǒng)侵染癥狀具有遲滯作用，局部的枯斑數(shù)量亦減少。范琦等[35]克隆出新的玉米RIP基因，該基因序列長983 bp，其中編碼區(qū)長828 bp，共編碼275個(gè)氨基酸和一個(gè)終止密碼子，GC含量為58.3%。林毅等[36]從傳統(tǒng)中草藥絞股藍(lán)中分離出一種新型核糖體失活蛋白，該蛋白對煙草花葉病毒具有抗性；他們還得到13個(gè)核糖體失活蛋白基因序列，為培育抗病作物新品種提供了新的基因資源。

4 植物抗體基因

雖然植物缺乏動物那樣的免疫系統(tǒng)，對病毒不能產(chǎn)生抗體，然而可將源自動物的中和病毒之抗體基因?qū)胫参?，使植物也能表達(dá)中和抗體，以抵抗病毒侵染。植物抗體基困可分為3個(gè)基本類型，即嵌合抗體基因、改形抗體基因和小分子抗體基因[37]；Tavladoraki等[38]的研究發(fā)現(xiàn)，將scFv抗體基因?qū)霟煵莺螅?xì)胞質(zhì)表達(dá)scFv的轉(zhuǎn)基因植株可抵抗菊芋斑紋病毒(AMCV)的侵染。劉德虎等[39～42]的試驗(yàn)證實(shí)，3個(gè)雜交瘤細(xì)胞系(D73、D90和A69)產(chǎn)生的單克隆抗體均能與PVYO、PVYN及PVYC發(fā)生親和性反應(yīng)，以D73為最強(qiáng)。侵染抑制試驗(yàn)表明，經(jīng)D73單克隆抗體處理后的病毒接種物，其在Solanumdemissum×S．Tuberosum離體葉片引起枯斑的能力顯著受到抑制。他們在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了馬鈴薯Y病毒中和抗體基因文庫，從基因文庫中篩選輕鏈和重鏈基因陽性克隆，并分析了輕、重鏈基因的序列，構(gòu)建了其植物表達(dá)載體。

5 干擾素基因

脊椎動物細(xì)胞在受到病毒感染后能合成并分泌干擾素，干擾素(Interferon)是一種具有高度生物活性的調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的多功能蛋白，分子量較小，能結(jié)合在細(xì)胞質(zhì)膜上，并導(dǎo)致抗病毒態(tài)的形成。最初發(fā)現(xiàn)于流感病毒，后從煙草、番茄、番椒、丁香等植物中也分離出干擾素(Fantes，1975)。國外有學(xué)者將大鼠體內(nèi)編碼干擾素之一的2'，5'-寡腺苷酸合成酶基因?qū)腭R鈴薯植株，結(jié)果用PVX攻毒時(shí)，轉(zhuǎn)基因植株葉與塊莖中病毒濃度顯著低于對照植株(未轉(zhuǎn)化)[10]。中國學(xué)者已將人的-干擾素基因?qū)霟煵莺退局胁⒌玫奖磉_(dá)，表達(dá)的干擾素具有抗病毒活性。宋莉等[43]對轉(zhuǎn)干擾素基因ChIFN- 煙草植株進(jìn)行TMV接種試驗(yàn)，結(jié)果證明轉(zhuǎn)入的基因賦予陽性植株對TMV的抗性。

6 結(jié)語

植物抗病毒基因介導(dǎo)的抗病性為培育抗病品種并從根本上防治植物病毒病害開辟了一個(gè)全新的領(lǐng)域。自1986年P(guān)owell等獲得首株轉(zhuǎn)基因抗病毒植株以來，眾多研究人員在該領(lǐng)域不斷推進(jìn)，成績斐然，新的抗病毒基因資源不斷被發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化的植物種類越來越多，轉(zhuǎn)基因的遺傳穩(wěn)定性越來越高。然而，通過對這一領(lǐng)域研究工作的簡略概括，不難發(fā)現(xiàn)仍有不足之處，因此，今后的研究工作應(yīng)側(cè)重以下幾個(gè)方面：①植物抗病毒基因資源的分類與整理工作；②植物抗病毒基因介導(dǎo)的抗性分子基礎(chǔ)；③抗病毒轉(zhuǎn)基因在植物體內(nèi)表達(dá)的影響因子(如轉(zhuǎn)基因的重組、沉默等)；④新的抗病毒基因的發(fā)掘特別是源于植物自身的抗病毒基因的開發(fā)與利用；⑤在明確抗性機(jī)理后如何開展抗病毒基因的人工智能化設(shè)計(jì)與克隆；⑥抗病毒轉(zhuǎn)基因的生態(tài)安全性與遺傳穩(wěn)定性。