低溫脅迫下非洲菊生理變化及相關(guān)基因表達(dá)分析

張佳凝, 何子涵, 楊雯婷, 殷 明, 張發(fā)庚, 高 日

(延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

非洲菊(GerberajamesoniiBolus)是菊科扶郎花屬多年生常綠草本花卉，花朵碩大，花色豐富，是禮品花束、花籃和藝術(shù)插花的理想材料[1]。非洲菊原產(chǎn)南非，適應(yīng)溫和氣候，屬半耐寒性花卉[2]。近年來，隨著氣候變化反常，我國華北、東北地區(qū)設(shè)施栽培非洲菊頻繁遭受凍害現(xiàn)象，導(dǎo)致切花產(chǎn)業(yè)發(fā)展受阻，經(jīng)濟(jì)受損。因此，開展非洲菊的耐寒性研究，評價非洲菊耐寒種質(zhì)資源具有重要意義。

溫度對植物的生長發(fā)育有重要影響，植物在受到低溫脅迫后，產(chǎn)生過量的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)造成植物傷害，植物受低溫脅迫會產(chǎn)生抗氧化酶來保護(hù)它們免受傷害。低溫可誘導(dǎo)SOD、CAT、POD等，來緩解ROS造成的傷害。SOD可以清除O2-，將其轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O2和O2，過多H2O2會還原SOD，導(dǎo)致SOD失活，而POD和CAT可以清除H2O2，保護(hù)SOD活性，這3者互相協(xié)作，維持植物體內(nèi)自由基穩(wěn)態(tài)水平[3-4]。許多抗氧化酶可作為評價植物耐寒性高低的生理生化指標(biāo)。張賀等[5]通過對低溫脅迫下蕓香抗氧化酶的研究發(fā)現(xiàn)，植物通過提高抗氧化酶來抵御低溫傷害。丙二醛(MDA)是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，它的產(chǎn)生能加劇膜的損傷，是植物衰老和抗性生理研究中的一個常用指標(biāo)，可以通過MDA了解膜脂過氧化的程度，以間接測定膜系統(tǒng)受損程度以及植物的抗逆性。杜鑫宇等[6]通過測定低溫脅迫下不同品種煙草苗期MDA含量來評價不同品種的煙草耐寒性。脯氨酸在植物體內(nèi)作為滲透物質(zhì)，起著滲透調(diào)節(jié)的作用[7]，在植物耐寒性研究中發(fā)揮重要作用。常珍惜等[8]通過對低溫脅迫下三色堇自交系幼MDA和脯氨酸含量測定發(fā)現(xiàn)，游離脯氨酸可能與抗寒性成正相關(guān)，MDA與抗寒性成負(fù)相關(guān)。植物在低溫脅迫過程中，耐寒相關(guān)基因表達(dá)量也會發(fā)生變化，產(chǎn)生一些抗凍蛋白，增加植物的耐寒性。CAT和SOD基因廣泛參與植物對冷害、鹽害、重金屬毒害、病原菌等脅迫的應(yīng)答以維持體內(nèi)ROS含量的動態(tài)平衡。高俊杰等[9]通過對低溫脅迫下黃瓜葉片SOD和CAT基因表達(dá)與活性變化研究發(fā)現(xiàn)，SOD、CAT基因的表達(dá)量隨著處理溫度的降低而升高。

該試驗(yàn)通過對非洲菊主栽品種“云南紅”和“大雪桔”進(jìn)行不同溫度處理，測定其葉片電導(dǎo)率，超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)活性，丙二醛(MDA)和脯氨酸(Pro)含量，并對耐寒性相關(guān)基因GjFSII、GjCHS、GjSOD、GjCAT2 進(jìn)行相對表達(dá)量分析，為評價非洲菊耐寒性提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

將非洲菊“云南紅”和“大雪桔”定植到花盆中，移植到延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院教學(xué)基地溫室培養(yǎng)，待到非洲菊長到5～6片葉后，進(jìn)行各試驗(yàn)測定。

1.2 方法

1.2.1 相對電導(dǎo)率的測定

參照陳煜[10]方法，并略作改動。用電子天平分別稱取非洲菊“云南紅”和“大雪桔”葉片1.5 g，在不同溫度下處理2 h，處理溫度分別為20 ℃、15 ℃、0 ℃、-5和-20 ℃(恒溫培養(yǎng)箱HZQ-F160)。將處理后的葉片放入裝有30 mL去離子水的試管中，靜置2 h后用電導(dǎo)率儀(DDS307型)測定初電導(dǎo)值C1，然后在沸水中煮沸15 min，冷卻靜置后測定終電導(dǎo)值C2，得到相對電導(dǎo)率，為C1/C2×100 %。

1.2.2 抗氧化酶POD、SOD、CAT活性及MDA、Pro含量測定

將非洲菊“云南紅”和“大雪桔”植株經(jīng)過5、10、15和20 ℃處理(恒溫培養(yǎng)箱HZQ-F160)2 h后，取非洲菊葉片2～3片，每個處理重復(fù)3次。分別測定POD和SOD、CAT酶活性和MDA和Pro含量。過氧化酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法測定；超氧化物歧化酶(SOD)活性采用NBT光還原法測定；過氧化氫酶(CAT)活性采用紫外分光光度計(jì)法測定；丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)顯色法測定[11]；脯氨酸(Pro)含量測定參照張殿衷[12]的方法。

1.2.3 低溫條件耐寒相關(guān)基因相對表達(dá)量

將非洲菊“云南紅”和“大雪桔”5 ℃處理2 h，分別在處理前后采集樣品，用液氮冷凍，用TRIZOL法提取總RNA。將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。設(shè)計(jì)引物，引物設(shè)計(jì)列于表1。

建立PCR 反應(yīng)體系：cDNA 模板1 μL;上下游引物各0.5 μL；2×SYBR qPCR Mix 5 μL；ddH2O補(bǔ)足至10 μL。

PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s預(yù)變性；95 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，40個循環(huán)；65 ℃ 5 s；95 ℃變性DNA產(chǎn)物。試驗(yàn)過程中每個基因均設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)。EF1ɑ作為內(nèi)參基因，qRT-PCR計(jì)算結(jié)果用2-ΔΔCt方法。

表1 qRT-PCR引物設(shè)計(jì)信息

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Microsoft Excel和SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用鄧肯氏新復(fù)極差法作顯著性差異分析，顯著水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對非洲菊相對電導(dǎo)率的影響

膜透性的測定可作為植物耐寒性研究中的一個生理指標(biāo)。隨著溫度的降低，“云南紅”和“大雪桔”的電導(dǎo)率均呈現(xiàn)上升的趨勢，當(dāng)溫度降到15 ℃時，電導(dǎo)率變化不明顯，當(dāng)溫度繼續(xù)降低，電導(dǎo)率迅速增加。溫度為0 ℃時，“云南紅”的相對電導(dǎo)率為49.4%；“大雪桔”的相對電導(dǎo)率為55.7%(圖1)。

圖1 低溫脅迫下非洲菊相對電導(dǎo)率變化

2.2 低溫脅迫對非洲菊SOD酶活性的影響

超氧化物歧化酶(SOD)在保護(hù)細(xì)胞免受氧自由基的毒害中發(fā)揮著重要作用。隨著溫度的降低，SOD酶活性逐漸升高，當(dāng)溫度從15 ℃降到5 ℃時“大雪桔”SOD酶活性變化幅度較大；溫度10 ℃和5 ℃時,“云南紅”SOD酶活性分別為290和431.59 U·g-1·min-1，都顯著高于“大雪桔”SOD酶活性，分別是“大雪桔”SOD酶活性的2.30和3.10倍(圖2)。

圖2 低溫脅迫下非洲菊SOD酶活性的變化

2.3 低溫脅迫對非洲菊POD酶活性的影響

過氧化物酶(POD)是植物細(xì)胞的保護(hù)性酶，它的變化能在一定程度上反映品種的耐寒性。隨著溫度的降低“云南紅”和“大雪桔”POD酶活性逐漸升高；溫度降到5 ℃時，“云南紅”和“大雪桔”POD酶活性達(dá)到最高值，為30.59 U·g-1·min-1，約是“大雪桔”(24.51 U·g-1·min-1)的1.24倍(圖3)。

圖3 低溫脅迫下非洲菊POD酶活性變化

2.4 低溫脅迫對非洲菊葉片CAT酶活性的影響

過氧化氫酶(CAT)是催化H2O2分解的酶，快速地將H2O2轉(zhuǎn)化為其他無害或毒性較小的物質(zhì)，減少對機(jī)體的損害。隨著溫度的降低，“云南紅”和“大雪桔”的CAT酶活性均升高；5 ℃時，“云南紅”和“大雪桔”的CAT酶活性達(dá)到最大值，為73.54和70.80 U·g-1·min-1，二者之間CAT活性無顯著性差異(圖4)。

圖4 低溫脅迫下非洲菊CAT酶活性變化

2.5 不同溫度對非洲菊MDA含量的影響

低溫脅迫下，植物膜脂過氧化的產(chǎn)物丙二醛(MDA)會大量積累，MDA的積累可能對細(xì)胞造成一定的傷害。隨著溫度的降低，“云南紅”和“大雪桔”MDA含量均上升(圖5)，“大雪桔”MDA含量變化明顯；溫度為15、10和5 ℃時，“大雪桔”MDA含量分別為0.014、0.023和0.024 μmol·g-1，均顯著高于“云南紅”，為“云南紅”的1.38倍、1.76倍和1.35倍(圖5)。

圖5 低溫脅迫下非洲菊MDA含量變化

2.6 低溫脅迫對非洲菊脯氨酸(Pro)含量的影響

脯氨酸(Pro)是植物蛋白質(zhì)的組分之一，可以以游離態(tài)廣泛存在于植物體中。在脅迫條件下，許多植物體內(nèi)常常伴有脯氨酸的積累。溫度為15 ℃以上時，脯氨酸含量沒有顯著差異；當(dāng)溫度降低到10和5 ℃時，“云南紅”脯氨酸含量分別為0.507和0.516 μg·g-1，顯著高于“大雪桔”，約是“大雪桔”的1.18倍和1.19倍(圖6)。

圖6 低溫脅迫下非洲菊脯氨酸含量變化

2.7 低溫對非洲菊耐寒性相關(guān)基因相對表達(dá)量的影響

低溫處理后，分析非洲菊“云南紅”和“大雪桔”耐寒相關(guān)基因GjFSII，GjCHS，GjSOD，GjCAT2相對表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)這些基因的表達(dá)量都明顯升高。5 ℃時非洲菊“云南紅”GjFSII，GjCHS，GjSOD，GjCAT2基因相對表達(dá)量分別為1.40、1.60、1.95和1.80，均顯著高于“大雪桔”，是“大雪桔”的1.10倍、1.14倍、1.13倍和1.14倍(圖7)。

3 討論與結(jié)論

當(dāng)植物受到脅迫后，細(xì)胞膜透性將會發(fā)生改變。電導(dǎo)率能夠有效的反映這一改變，因此，電導(dǎo)率法是目前研究植物抗寒性的重要手段。趙玉宏[13]對2種草坪草抗寒性的研究表明，低溫處理使葉片中的電導(dǎo)率增大；該試驗(yàn)中，通過對20 ℃、15 ℃、0 ℃、-5 ℃和-20 ℃下非洲菊葉片相對電導(dǎo)率測定發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的降低，非洲菊“云南紅”和“大雪桔”葉片的相對電導(dǎo)率均升高，且從15 ℃到-20 ℃，“云南紅”葉片電導(dǎo)率都低于“大雪桔”。由于電解質(zhì)滲透率的變化可直接反映出細(xì)胞膜透性的改變以及細(xì)胞被破壞情況，可看出非洲菊“云南紅”抗寒性優(yōu)于“大雪桔”，這與張自陽等[14]研究結(jié)果相似。

圖7 低溫對非洲菊耐寒性相關(guān)基因相對表達(dá)量的影響

正常條件下，植物體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧不會使植物受到傷害，植物體內(nèi)有一套抗氧化系統(tǒng)可以有效地清除產(chǎn)生的活性氧自由基。但逆境下植物產(chǎn)生更多的氧自由基，加劇了膜脂過氧化從而導(dǎo)致膜系統(tǒng)受損，最終使植物組織受到破壞。SOD、POD、CAT是植物防御系統(tǒng)中重要的保護(hù)酶，在保護(hù)酶系統(tǒng)中，SOD能清除超氧自由基O2-，同時產(chǎn)生歧化性產(chǎn)物H2O2。POD和CAT主要是起到酶促降解H2O2的作用，從而降低植物抵抗逆境脅迫下代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)對細(xì)胞的傷害，表現(xiàn)出一定的抗逆性。張繼寧等[15]通過對低溫脅迫下茄子幼苗生理指標(biāo)的測定發(fā)現(xiàn)，耐寒性較強(qiáng)的材料能保持較高的POD、SOD酶活性，而耐低溫性較弱的材料酶類活性較低；張學(xué)財(cái)?shù)萚16]人通過測定4個劍麻品種的SOD、POD、CAT酶活性，評價其耐寒性發(fā)現(xiàn)，抗氧化酶活性越高的品種，耐寒性越好。

該試驗(yàn)對非洲菊“云南紅”和“大雪桔”進(jìn)行低溫處理，測定SOD、POD、CAT酶活性，發(fā)現(xiàn)“云南紅”和“大雪桔”葉片的SOD、POD、CAT酶活性均隨著溫度的降低而升高，在5 ℃時達(dá)到最大活性，且“云南紅”葉片的SOD、POD酶活性顯著高于“大雪桔”。同時，GjSOD，GjCAT基因相對表達(dá)量也增加了，這與低溫脅迫下西藏大花紅景天RcCATs，RcSOD基因的表達(dá)量變化一致[17]。丙二醛(MDA)是膜脂過氧化作用的最終產(chǎn)物，對細(xì)胞膜有毒害作用。低溫傷害不僅破壞植物細(xì)胞代謝，還導(dǎo)致植物體內(nèi)生理功能發(fā)生變化，自由基的增加傷害膜系統(tǒng)，引發(fā)了膜脂過氧化作用。通過測定MDA含量的變化可反應(yīng)其對低溫條件反應(yīng)的強(qiáng)弱。閻世江等[18]對低溫下黃瓜若干生理指標(biāo)的測定發(fā)現(xiàn)，植株耐寒性與MDA含量呈負(fù)相關(guān)。該試驗(yàn)通過低溫處理“云南紅”和“大雪桔”，發(fā)現(xiàn)MDA含量均隨著溫度的降低而升高，5 ℃時，非洲菊“云南紅”MDA含量顯著低于“大雪桔”，說明非洲菊“云南紅”抗寒性高于“大雪桔”，與其結(jié)果一致。游離脯氨酸在細(xì)胞內(nèi)的含量與溫度變化有很大關(guān)聯(lián)，研究表明低溫可以明顯地增加脯氨酸含量，提高細(xì)胞的抗逆能力[19]。低溫處理“云南紅”和“大雪桔”，發(fā)現(xiàn)脯氨酸含量隨著溫度的下降而上升，5 ℃時“云南紅”和“大雪桔”脯氨酸含量達(dá)到最大值，且“大雪桔”脯氨酸含量顯著低于“云南紅”，表明“云南紅”抗寒性高于“大雪桔”,與張繼寧等[15]所得結(jié)果一致。黃酮是一大類重要的次生代謝產(chǎn)物，廣泛參與植物的非生物脅迫反應(yīng)，其中查爾酮合成酶基因(CHS)和黃酮合成酶基因(FS)為苯丙氨酸代謝途徑中的關(guān)鍵基因。王毅等[20]人通過低溫誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)，泡核桃在常溫及低溫(4 ℃)處理發(fā)現(xiàn)JsCHS1是典型的受冷害誘導(dǎo)的查爾酮合成酶基因。該研究發(fā)現(xiàn)與20 ℃相比，5 ℃處理后，非洲菊“云南紅”和“大雪桔”GhCHS和GhFSII基因相對表達(dá)量增加，且“云南紅”GhCHS基因相對表達(dá)量顯著高于“大雪桔”。這些結(jié)果表明“云南紅”耐寒性高于“大雪桔”。