KRAS基因突變對經(jīng)肝動脈化療栓塞術(shù)治療的中晚期原發(fā)性肝癌患者預后的預測價值

劉旭初，覃世運，陳麗君，陳 娟，尤曉光

1 海南省第三人民醫(yī)院(三亞中心醫(yī)院)a.腫瘤治療中心, b.藥學部，海南 三亞 572000；2 海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 放射科，?？?570102

原發(fā)性肝癌作為臨床最為常見的惡性腫瘤之一，具有較高的發(fā)病率和死亡率，是最為常見的癌癥相關性死亡原因之一[1-2]。由于原發(fā)性肝癌發(fā)病隱匿，患者缺乏早期典型的臨床癥狀，大部分患者在臨床確診時已經(jīng)處于疾病的中晚期階段，能夠進行根治性手術(shù)切除的患者比例甚至不足20%。經(jīng)肝動脈化療栓塞術(shù)(transcatheter arterial chemoembolization, TACE)是中晚期原發(fā)性肝癌患者治療的主要手段，可有效改善患者臨床預后[3-5]。然而，當前仍缺乏評價中晚期肝癌TACE術(shù)后預后的有效方式。研究[6-7]顯示，表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)信號通路是原發(fā)性肝癌發(fā)生發(fā)展的關鍵。KRAS基因?qū)儆赗as原癌基因家族中的一員，不僅是抗EGFR靶向治療選擇的重要依據(jù)，同時也可能成為患者預后的預測因子。本研究探討KRAS基因狀態(tài)對TACE治療中晚期肝癌患者預后的預測價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇2017年4月—2020年5月在海南省第三人民醫(yī)院接受TACE治療的中晚期肝癌患者為研究對象。納入標準：(1)患者均經(jīng)穿刺活檢，臨床病理診斷為原發(fā)性肝癌患者；(2)心、肺、腎等機體主要器官功能無明顯障礙患者；(3)巴塞羅那肝癌臨床分期(BCLC)B期或C期患者；(4)肝功能Child-Pugh分級為A級或B級患者；(5)無法接受外科手術(shù)治療切除患者；(6)卡氏(KPS)評分>60分；(7)術(shù)前未接受其他治療。排除標準：(1)合并嚴重凝血功能障礙患者；(2)大量腹水或頑固性腹水患者；(3)有TACE治療禁忌證患者；(4)合并遠處轉(zhuǎn)移患者。

1.2 TACE治療方法 使用Seldinger法穿刺患者股動脈，插管直至肝總動脈進行造影，以明確腫瘤大小、數(shù)目、位置。以微導管超選擇插管至支配肝癌病灶的主要供血動脈內(nèi)，將化療藥物(氟尿嘧啶750 mg/m2，奧沙利鉑60 mg/m2)稀釋液緩慢注入，然后使用15～25 mL 40%碘化油栓塞腫瘤末梢血管。若有必要可使用明膠海綿顆粒，以盡可能完全阻斷患者腫瘤血供。根據(jù)患者腫瘤大小、數(shù)量以及患者肝功能具體情況確定碘化油及栓塞劑的使用劑量。此外，根據(jù)患者情況決定TACE治療次數(shù)，本研究患者治療2～3次。

1.3 KRAS基因檢測 TACE手術(shù)前，在超聲引導下對肝癌組織進行穿刺取材，取5 g左右腫瘤組織，按照QIAamp DNAFFPF Kit試劑盒(Qiagen公司)步驟提取腫瘤組織DNA，使用紫外分光光度計檢測提取DNA濃度，然后調(diào)節(jié)濃度至100 μg/mL，-20 ℃保存待測。擴增KRAS基因12/13號密碼子特需特異性引物，根據(jù)文獻[8]報道，引物序列，正義：5′-CTGTATCAAAGAATGGTCCTGCAC-3′，反義：5′-CTGTATCAAAGAATGGTCCTGCAC-3′。引物及Premix PCR試劑盒購于寶生物工程(大連)有限公司，PCR反應體系50 μL。PCR反應條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、70 ℃ 40 s，共完成30個循環(huán)，使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，選取PCR陽性凝膠條帶作為目的片段，使用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen公司)對PCR產(chǎn)物回收，然后送至上?；蚣夹g(shù)有限公司進行測序分析。

1.4 隨訪 所有患者在接受TACE術(shù)后，每月復查肝功能、AFP、肝臟增強CT或MRI，以評估患者腫瘤控制情況以及術(shù)后復發(fā)情況，記錄患者無進展生存期(PFS)以及總體生存期(OS)。PFS指的是從患者TACE術(shù)后到觀察到疾病進展或發(fā)生死亡(由于任何原因)之間的時間；OS指的是從患者TACE術(shù)后到患者死亡(由于任何原因)之間的時間。

2 結(jié)果

2.1 KRAS基因突變檢測結(jié)果 97例患者中男61例、女36例，年齡30～78歲，平均(56.48±12.31)歲。腫瘤最大徑2.89～9.74 cm，平均(7.19±2.08)cm；腫瘤單個89例、≥2個18例。在本組97例晚期肝癌患者中，共檢出KRAS基因突變患者34例(35.05%)，其中檢出12號密碼子突變患者21例(61.76%)，13號密碼子突變患者13例(38.24%)。在檢出KRAS基因突變患者中，均為單個堿基的點突變，而并未檢出兩個或兩個以上堿基突變或其他形式的突變(圖1)。

注：a,KRAS基因12、13密碼子野生型基因序列；b,KRAS基因12密碼子GGT→GAT突變；c,KRAS基因12密碼子GGT→GTT突變；d,KRAS基因13密碼子GGC→GAC突變。

2.2 KRAS基因突變狀態(tài)與患者臨床病理特征的關系 KRAS基因突變型與野生型比較，肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、腫瘤數(shù)目的差異均有統(tǒng)計學意義(χ2值分別為3.965、6.593，P值均<0.05)(表1)。

表1 KRAS基因突變狀態(tài)與患者臨床特征的關系

2.3 KRAS基因突變狀態(tài)與患者生存分析 對本組97例患者進行追蹤隨訪顯示，KRAS基因野生型患者平均PFS為11.35個月，突變型患者平均PFS為19.65個月；KRAS基因野生型患者平均OS為19.18個月，突變型患者平均OS為26.54個月。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，KRAS基因野生型患者PFS及OS均顯著優(yōu)于KRAS突變型(P值均<0.05)(圖2、3)。

圖2 KRAS基因狀態(tài)與患者PFS的關系

2.4 影響患者預后的Cox分析 對可能影響患者總體生存預后的各因素進行Cox分析，結(jié)果顯示，KRAS基因狀態(tài)(RR=18.273,95%CI：5.584～98.305)、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移(RR=11.475,95%CI：3.029～56.490)、腫瘤數(shù)目(RR=10.038,95%CI：2.973～19.328)、BCLC分期(RR=12.384,95%CI：2.385～29.305)與患者預后密切相關，為影響患者總體生存預后的重要因素(P值均<0.05)(表2)。

表2 影響患者預后的Cox分析

圖3 KRAS基因狀態(tài)與患者OS的關系

3 討論

目前，TACE已經(jīng)成為無法外科切除中晚期肝癌患者的首選治療方式。肝癌的主要供血為肝動脈供血。經(jīng)肝動脈碘油注射后，碘油可在肝癌的組織間隙、肝竇以及細小血管內(nèi)選擇性停滯，從而導致癌細胞失去血液供應而導致腫瘤組織缺血壞死[9-10]；在碘油中混合化療藥物，從而使化療藥物在腫瘤組織中緩慢釋放，延長了化療藥物與腫瘤細胞之間的接觸時間，進而顯著提高化療藥物治療效果，同時可顯著減小化療藥物對患者全身的不良影響，并阻斷腫瘤血供，引起腫瘤組織發(fā)生缺血性壞死，進一步增加抗腫瘤療效[11-12]。研究提出[13-14]，采取非手術(shù)多模式治療，尤其對于原發(fā)性肝癌患者采取TACE治療，可有效延長患者生存期，在中晚期肝癌的治療中具有重要作用。

原發(fā)性肝癌是多基因、多分子、多通路間相互作用的結(jié)果，因此檢測原發(fā)性肝癌患者基因突變狀況，對于患者治療反應以及生存預后具有預測價值，從而有助于實現(xiàn)精準化治療的目的[15-16]。KARS基因突變在原發(fā)性肝癌患者中具有著較高的發(fā)生率。研究[17-18]顯示，原發(fā)性肝癌的發(fā)生是一種多步驟過程，而在腫瘤惡性發(fā)生的整個過程中，均與KRAS基因突變有關。有研究[19-20]認為，KRAS基因突變被認為是原發(fā)性肝癌發(fā)生的啟動性因子，尤其G-A堿基突變，可能在多種惡性腫瘤發(fā)生中具有重要作用。

本研究結(jié)果顯示，在本組97例中晚期肝癌患者中，共檢出KRAS基因突變患者34例(35.05%)，其中檢出12號密碼子突變患者21例(61.76%)，13號密碼子突變患者13例(38.24%)，且檢出的患者均為單個堿基突變。本組結(jié)果與相關研究報道結(jié)果基本一致[21]。KRAS基因突變率接近35%，是一種較為常見的基因突變形式。此外，KRAS基因突變與患者肝硬化、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、腫瘤數(shù)目有關。提示KRAS基因突變的存在可能與肝癌疾病的發(fā)生發(fā)展具有一定的內(nèi)在聯(lián)系，從而為KRAS突變可能成為預測患者治療預后的因素提供一定的基礎。

Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，KRAS基因野生型患者PFS及OS均顯著優(yōu)于KRAS突變型。表明了KRAS基因狀態(tài)與患者TACE術(shù)后生存狀況密切相關。KRAS基因野生型患者可受上游EGFR信號通路的調(diào)控，而當KRAS基因發(fā)生點突變時，導致該基因編碼P21蛋白的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了相應的變化，不再受上游EGFR信號的調(diào)控。KRAS基因突變亞型不同，可能也會導致該基因的空間構(gòu)象發(fā)生變化，引起相應的調(diào)節(jié)細胞內(nèi)信號通路不同，從而影響化療藥物的結(jié)合位點，也可能導致患者對化療藥物的敏感性有所差別，進而影響患者預后。

同時，本研究進一步對可能影響患者術(shù)后預后的各因素進行Cox回歸分析，結(jié)果顯示，KRAS基因狀態(tài)、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、腫瘤數(shù)目、BCLC分期進入回歸模型，為影響患者總體生存預后的重要因素。腫瘤數(shù)目、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移以及BCLC分期均可有效提示原發(fā)性肝癌患者自身狀態(tài)及腫瘤的進展情況，故而可影響患者預后，而KRAS基因狀態(tài)同樣進入了Cox回歸模型，提示KRAS基因狀態(tài)也對患者臨床預后有著重要的影響。此外，通過Kaplan-Meier生存分析以及Cox多因素分析，進一步確定了KRAS基因狀態(tài)與患者TACE術(shù)后預后具有密切關系，可能成為預測患者術(shù)后預后的重要因素之一。KRAS基因突變，可能是導致患者術(shù)后預后較差的因素，因此關注肝癌TACE患者KRAS基因狀態(tài)，對于提前制訂相關治療計劃具有重要價值。

但是由于本研究納入樣本量相對較小，研究結(jié)果可能存在一定的偏差，后期研究將進一步擴大研究樣本量，以獲得更為可靠的臨床研究數(shù)據(jù)。

綜上所述，KRAS基因突變在原發(fā)性肝癌中較為常見，與患者TACE術(shù)后不良預后密切相關，可成為患者臨床預后監(jiān)測的潛在指標。

倫理學聲明：本研究方案于2017年1月8日經(jīng)海南省第三人民醫(yī)院倫理委員會審批，批號：倫(審)2017-09，所納入患者均簽署知情同意書。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：劉旭初、覃世運、陳麗君、陳娟、尤曉光負責課題設計，資料分析，撰寫論文；劉旭初負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。