遠(yuǎn)隔缺血預(yù)處理上調(diào)線粒體自噬減輕小鼠急性腎缺血再灌注損傷

李軼男，裴漢軍，余學(xué)文

內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 包頭 014010

0 引言

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是常見嚴(yán)重的臨床疾病，除對患者自身產(chǎn)生危害外，其高發(fā)病率也給醫(yī)療保健系統(tǒng)帶來了巨大挑戰(zhàn)[1]。許多學(xué)者指出AKI的發(fā)生、發(fā)展與線粒體自噬水平的高低密切相關(guān)[2-3]，線粒體自噬水平的增加可作為腎小管細(xì)胞在應(yīng)激條件下的一種保護(hù)機(jī)制[4]。因此如何有效調(diào)控線粒體自噬水平、進(jìn)而改善腎臟缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）已成為現(xiàn)階段臨床研究的重點(diǎn)及熱點(diǎn)[5]。遠(yuǎn)隔缺血預(yù)處理（remote ischemic preconditioning，RIPC）是通過對器官或組織進(jìn)行短暫、可逆的缺血再灌注處理，使靶器官能夠抵抗氧化應(yīng)激和致死性IRI的方法[6]。有研究[7]發(fā)現(xiàn)RIPC可誘導(dǎo)對腎臟IRI產(chǎn)生保護(hù)作用。因缺血再灌注是引起AKI的主要原因，故本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建急性腎IRI模型，進(jìn)一步驗(yàn)證RIPC在AKI中的保護(hù)作用，并從線粒體自噬角度分析其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

研究所用24只雄性C57BL/6小鼠購買于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0010。飼養(yǎng)在包頭醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房內(nèi)，飼養(yǎng)條件：光暗循環(huán)12h、通風(fēng)良好、溫度21℃～25℃。定期更換墊料、喂食標(biāo)準(zhǔn)鼠糧及自來水。本研究的所有程序均獲得內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 分組方法

將C57BL/6小鼠8～10周（體重20～25g）隨機(jī)分為4組，每組6只。

（1）假手術(shù)組（Sham）：沿脊柱兩旁腎區(qū)部位切開，暴露兩側(cè)腎臟，不做任何處理，維持1h后縫合創(chuàng)口，正常飼養(yǎng)23h。

（2）缺血再灌注（I/R）：暴露兩側(cè)腎臟，微型動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)腎蒂，夾閉40min，再灌注1h后縫合創(chuàng)口，正常飼養(yǎng)23h。

（3）遠(yuǎn)隔缺血預(yù)處理組（RIPC）：橡皮筋結(jié)扎小鼠左后肢根部，缺血5min，再灌注5min，反復(fù)4個(gè)循環(huán)，之后的操作同I/R組。

（4）自噬抑制劑組（RIPC+3-MA）：在RIPC處理的基礎(chǔ)上，經(jīng)腹腔注射3-MA（30mg/kg，0.2mL/20g體重），2h后所有操作按I/R組進(jìn)行。

1.2.2 模型制備

（1）IRI模型：用10%的水合氯醛（3mL/kg）腹腔注射麻醉，待夾尾反射消失后，沿脊柱兩旁腎區(qū)部位切開暴露腎臟，微型動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)腎蒂40min，再灌注24h，構(gòu)建IRI模型。

（2）RIPC模型：用10%的水合氯醛（3mL/kg）腹腔注射麻醉，待夾尾反射消失后，用橡皮筋結(jié)扎小鼠左后肢根部，缺血5min，再灌注5min，反復(fù)4個(gè)循環(huán)，之后的操作同I/R組。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 血肌酐、尿素氮測定

使用全自動(dòng)生化分析儀（美國雅培C16000），檢測每組小鼠血清肌酐（Scr）和血尿素氮（BUN）濃度。

1.3.2 HE染色后觀察腎小管損傷程度

HE染色法：石蠟切片經(jīng)烤片、脫蠟、水化后，用蘇木素、伊紅染色，脫水、透明后觀察。在腎皮質(zhì)和髓質(zhì)結(jié)合部及外髓采集10個(gè)連續(xù)視野，進(jìn)行盲法半定量評分：無損傷（0分）、輕度損傷（＜25%，1分）、中度損傷（25%～50%，2分）、重度損傷（損傷面積51%～75%，3分）、極重度損傷（＞75%，記4分）。

1.3.3 線粒體自噬情況

免疫印跡法：取腎臟皮質(zhì)和髓質(zhì)交界區(qū)組織，提取總蛋白，BCA法測蛋白濃度，隨后經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗（LC3A/B、Beclin1）4℃過夜孵育、二抗孵育、顯色等步驟，觀察LC3A/B、Beclin1的表達(dá)。

免疫組織化學(xué)法：將制備好的石蠟切片經(jīng)脫蠟和水化、抗原修復(fù)、內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑孵育、一抗（p62）4℃過夜孵育、二抗孵育、DAB顯色、蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片等步驟后，在顯微鏡下觀察p62的表達(dá)情況。

免疫熒光雙標(biāo)法：將制備好的石蠟切片經(jīng)脫蠟和水化、抗原修復(fù)、3%雙氧水孵育、5%BSA封閉、一抗混合工作液（TOMM20、LAMP2、LC3A/B）4℃過夜孵育、熒光二抗混合工作液（山羊抗兔IgG二抗、山羊抗小鼠IgG二抗1）37℃避光孵育、DAPI染色、水溶性封片劑封片等步驟后，在熒光顯微鏡下觀察其定位情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 23.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，多組比較采用單因素方差分析（ANOVA），方差齊采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊采用Dunnetts T3檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組小鼠血Scr、BUN水平比較

與Sham組比較，其余各組Scr、BUN濃度均增加（P＜0.05）。與I/R組比較，RIPC組Scr、BUN濃度均降低（P＜0.05）。與RIPC組相比，RIPC+3-MA組Scr、BUN濃度增加（P＜0.05），見表1。

表1 三組小鼠SCr、BUN 比較（）

表1 三組小鼠SCr、BUN 比較（）

注：*P＜0.05vs Sham group；#P＜0.05vs I/R group；△P＜0.05vs RIPC group。

2.2 四組小鼠腎小管損傷情況比較

與Sham組比較，其余各組腎小管損傷半定量損傷評分均增加（P＜0.05），與I/R組比較，RIPC組腎小管損傷半定量評分降低（P＜0.05）。與RIPC組相比，RIPC+3-MA組腎小管損傷半定量評分增加（P＜0.05），見圖1。

圖1 各組腎組織腎小管損傷半定量評分比較

2.3 四組小鼠線粒體自噬情況比較

免疫印跡法示：與Sham組相比，I/R組、RIPC組LC3A/BⅡ/LC3A/BⅠ、Beclin1蛋白的表達(dá)水平明顯增加（P＜0.05）。與I/R組相比，RIPC組LC3A/BⅡ/LC3A/BⅠ、Beclin1蛋白的表達(dá)水平增加（P＜0.05）。與RIPC組相比，RIPC+3-MA組LC3A/BⅡ/LC3A/BⅠ、Beclin1蛋白的表達(dá)水平減低（P＜0.05），見圖2。

圖2 免疫印跡法檢測各組腎組織LC3A/B、Beclin1 蛋白半定量分析

免疫組化示：與Sham組相比，其余三組p62蛋白的光密度值降低（P＜0.05）。與I/R組相比，RIPC組p62蛋白的光密度值降低（P＜0.05）。與RIPC+3-MA組相比，RIPC組p62蛋白的光密度值降低（P＜0.05），見圖3。

圖3 免疫組織化學(xué)法各組腎組織p62 蛋白平均光密度值比較

免疫熒光雙標(biāo)共定位結(jié)果示：與Sham組相比，各組腎組織線粒體外膜轉(zhuǎn)位酶20（translocase of outer mitochondrial membrane 20，TOMM20）與LC3A/B、TOMM20與溶酶體相關(guān)膜蛋白2（lysosome-associated membrane protein-2，LAMP2）共定位面積百分比明顯增加（P＜0.05）。與I/R組相比，RIPC組腎組織TOMM20和LC3A/B及TOMM20和LAMP2共定位面積百分比增加（P＜0.05）。與RIPC組相比，RIPC+3-MA組腎組織TOMM20和LC3A/B及TOMM20和LAMP2共定位面積百分比降低（P＜0.05），見圖4、圖5。

圖4 免疫熒光雙標(biāo)各組腎組織TOMM20 與LC3A/B 共定位面積百分比比較

圖5 免疫熒光雙標(biāo)各組腎組織TOMM20 與LAMP2 共定位面積百分比比較

3 討論

目前臨床尚缺乏預(yù)防AKI的有效方法。RIPC是在致傷因素作用于靶器官之前，通過對遠(yuǎn)隔組織（如四肢動(dòng)脈）或器官血供短暫阻斷后恢復(fù)灌注，以期保護(hù)靶器官的治療方法。該技術(shù)最早被用于減輕心肌組織的缺血再灌注損傷，其可減小由冠狀動(dòng)脈長時(shí)間閉塞導(dǎo)致的心肌梗死的面積[8]。隨后的研究發(fā)現(xiàn)RIPC的保護(hù)作用同樣存在于除心臟之外的其他器官，例如腎臟[9]，但RIPC對腎功能保護(hù)作用的具體機(jī)制尚未闡明。

線粒體自噬是通過自噬途徑選擇性降解過量或缺陷的線粒體，是線粒體質(zhì)量控制的核心及細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)態(tài)的必要條件[10]。不同途徑介導(dǎo)的線粒體自噬作為腎臟的保護(hù)機(jī)制被激活，在應(yīng)激條件下，線粒體自噬可以作為一種防御性或適應(yīng)性機(jī)制被誘導(dǎo)，來維持健康的線粒體群體，以促進(jìn)細(xì)胞存活[11]。線粒體自噬水平的不足和下降與AKI的發(fā)生、進(jìn)展密切相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示：通過對IRI模型小鼠行RIPC后，小鼠Scr、BUN濃度明顯下降，腎小管損傷半定量評分減低，說明RIPC可以減輕腎IRI。Beclin1、LC3A/B、p62均是參與線粒體自噬的關(guān)鍵分子。有研究[12]指出Beclin1是自噬啟動(dòng)的關(guān)鍵分子，Beclin-1/（VPS34）/VPS15/Atg14復(fù)合物可促使自噬囊泡成核；LC3-I與磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成LC3-II，介導(dǎo)吞噬泡的生長和閉合形成自噬體；p62是自噬的選擇性底物，在自噬過程中，它通過LC3相互作用區(qū)與LC3結(jié)合，依靠自噬溶酶體途徑促使泛素化的線粒體在溶酶體內(nèi)降解，同時(shí)其自身也被降解。因此p62蛋白含量的降低，以及Beclin1含量的增加和LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化可作為線粒體自噬激活的標(biāo)志。此外，我們用TOMM20分別與LC3A/B及LAMP2進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)共定位，標(biāo)記線粒體自噬體和線粒體自噬溶酶體，描述線粒體自噬水平在早期和中期的變化，使線粒體自噬可視化。本研究通過對四組小鼠的線粒體自噬水平進(jìn)行綜合評估后發(fā)現(xiàn)，與I/R組相比，RIPC組LC3A/BⅡ/LC3A/BⅠ、Beclin1蛋白表達(dá)水平增高，p62蛋白光密度值降低，TOMM20與LC3A/B、TOMM20與LAMP2熒光共定位面積百分比增加，說明RIPC可以上調(diào)線粒體自噬水平。給予自噬抑制劑后，線粒體自噬水平降低且RIPC的腎保護(hù)作用被逆轉(zhuǎn)，進(jìn)一步支持RIPC可誘導(dǎo)線粒體自噬減輕腎IRI。

綜上所述，RIPC可減輕小鼠急性腎IRI，其機(jī)制與激活線粒體自噬有關(guān)，為減輕AKI提供了新思路。