單細胞轉錄組測序技術及其在植物研究中的應用

陳柳宏，趙春雷，王 希，李彥麗,4，丁廣洲，陳 麗

（1黑龍江大學現代農業(yè)與生態(tài)環(huán)境學院，哈爾濱 150080；2黑龍江省甜菜工程技術研究中心，哈爾濱 150080；3國家糖料改良中心，哈爾濱 150080；4國家甜菜種質中期庫，哈爾濱 150080）

0 引言

轉錄組廣義上指某一生理條件下，細胞內所有轉錄產物的集合，包括信使RNA、核糖體RNA、轉運RNA 及非編碼RNA；狹義上指所有mRNA 的集合[1]。轉錄組測序(RNA-seq)就是利用高通量測序技術將細胞或組織中全部或部分mRNA、smallRNA 和nocodingRNA進行測序分析的技術[2]。

基本上，單個生物體內的所有細胞都具有近乎相同的基因型，在基因的核苷酸序列不產生變化的情況下，基因表達的可遺傳變化成為一種突破口。多細胞生物中不同細胞類型和特定細胞功能的產生很大程度上是基因差異性表達的結果。常規(guī)的轉錄組測序技術雖然能測序大部分的細胞，但所測結果實際上是一群細胞基因表達的平均值，忽略了細胞的異質性。此外，由于技術的局限性常導致RNA 純化的效率以及檢測的靈敏度不佳，在某些胚胎細胞的研究中還存在著可用前體細胞稀少等情況，在研究過程中進行轉錄組分析往往十分困難并在一定程度上無法收集到大量的細胞數據。因此，檢查單個細胞的轉錄組是解釋基因表達異質性和隨機性必不可少的過程。

單細胞轉錄組測序(Single-cell RNA-seq,scRNAseq)的研究為理解不同細胞類型或單個細胞的的轉錄過程創(chuàng)造了可能性，目前已經廣泛地被應用與醫(yī)學與動物研究之中，如使用單細胞轉錄組測序技術對細胞譜系軌跡以及稀有細胞類型進行鑒定[3]，并在疾病研究與動物胚胎發(fā)育中取得了可觀的進展[4-5]。高通量單細胞轉錄組測序技術可以識別和表征來自組織或器官中的大量細胞群體中的稀有細胞類型，目前在擬南芥中發(fā)現其基因型之間的表達差異性很大[6]，利用大量根表達標記基因能夠完成罕見細胞類型（如QC細胞）的鑒定。因此，深入理解單細胞轉錄組測序技術可為研究細胞功能提供新的思路，有助于人類探索不同細胞類型在發(fā)育過程中的作用及細胞調控網絡[7]。

1 單細胞轉錄組測序及其發(fā)展概況

1.1 單細胞轉錄組測序技術

細胞是生物體的基本結構和功能單位。每一個生命體都是從一個細胞生長發(fā)育而來，每個細胞都具有獨特的表型和生物學功能。生物體中相同或者不同的組織、器官、系統(tǒng)中的細胞均存在異質性，細胞的異質性由其遺傳物質所決定，其本質差異體現在基因組、轉錄組、表觀組層面。因此，為了研究生物體的功能機制并避免樣本均質化掩蓋單細胞的異質性，單細胞轉錄組測序技術應運而生。單細胞轉錄組測序技術(scRNA-seq)是指能夠獲得單個細胞內近萬個基因表達信息，并且能夠辨別生物組織中各種細胞類型的轉錄特征以及全面揭示細胞之間基因表達異質性的測序方法[8]。以目前應用廣泛的10 X Genomics 單細胞轉錄組測序平臺為例，該技術利用微流控、油滴包裹和baecode標記等技術來實現高通量的細胞捕獲技術，能夠一次性分離、并標記500～10000 個單細胞，從而獲得每個細胞的3’端的轉錄組信息，具有細胞通量高、建庫成本低、捕獲周期短等優(yōu)勢。該技術主要用于細胞分型和標記因子的鑒定，從而實現對細胞群體的劃分與細胞群體間基因表達差異的檢測，此外該技術還可以預測細胞分化與研究發(fā)育軌跡，在當下疾病、免疫、腫瘤領域以及組織、器官、發(fā)育研究中發(fā)揮越來越重要的作用。

1.2 單細胞轉錄組測序發(fā)展概況

最早的單細胞轉錄組技術利用基于PCR 技術的對單個細胞cDNA 的指數擴增和線性擴增進行了探索，但僅局限于檢測單個細胞中的少數基因[9]。2006年，Kurimoto 等[10-11]改進了單細胞cDNA 擴增方法，將定向的PCR 擴增與線性擴增相結合，結合芯片技術對單個胚胎干細胞進行了分析，在高覆蓋率和準確性的前提下，使細胞和基因的通量有所提升。隨著測序技術的發(fā)展，2009 年，Tang[12]首次創(chuàng)立基于高通量測序的單細胞RNA 測序分析并應用于單個小鼠的卵裂球，使基因檢測通量大幅度提高，檢測出比芯片技術更多的轉錄本。隨后，CEL-Seq 技術的開發(fā)克服了單個細胞中由于少量起始RNA 導致的高通量測序受限，并應用于秀麗隱桿線蟲胚胎姐妹細胞研究之中，成功觀察到其姐妹細胞之間轉錄物的差異性分布[13]。類似采用線性擴增或擬線性擴增的技術如PMA[14](phi29- mRNA amplification)， SMA[14](semirandom primed PCR- based ,RNA transcriptome amplification)，哈佛大學謝曉亮院士發(fā)明的MALBAC[15](Multiple Annealing and Looping Based Amplification Cycles)，即多次退火環(huán)狀循環(huán)擴增技術（可以對單個細胞、單條染色體或者0.5 pg 的RNA 進行高保真擴增）均在研究中使用以便保留完整的轉錄組信息，并已經進行商業(yè)化運作。在此基礎上，單細胞轉錄組測序技術發(fā)展愈發(fā)成熟，2018 年，浙江大學醫(yī)學院郭國驥團隊自主研發(fā)出高通量測序平臺Microwell-seq，并發(fā)表了世界首個小鼠細胞圖譜[16]，且在2020 年成功繪制世界首個涵蓋八大系統(tǒng)的人類細胞圖譜[17]。

單細胞轉錄組測序技術最先運用于對胚胎早期發(fā)育、分化以及重編過程中起作用的動態(tài)基因的研究。Tang 等[18]利用該技術首次檢測到胚胎發(fā)育過程中microRNA 的變化，揭示了體外囊胚期內細胞團向多能胚胎干細胞轉變中的轉錄組重編過程。近期，Briggs 等[19]基于微流控技術對西部爪趾蛙進行單細胞轉錄組測序分析，推導出脊椎動物中細胞狀態(tài)的詳細變化情況，闡明了脊椎動物早期發(fā)育基因表達程序的保守性和發(fā)散性特征。除此之外，Treutlein 等[20]又將該技術運用于遠端肺上皮譜系層次建立中，實現了其在組織器官發(fā)育中的運用。隨著單細胞轉錄組測序技術的不斷發(fā)展，之后又相繼應用于在免疫細胞對于抗原的應答機制中的一致性分析[21]以及腫瘤細胞之間基因突變或表達圖譜差異性的研究中[22]。在動物中的成功運用也為植物研究提供了新的思路，Mello等[23]在2015年對擬南芥采用流式技術進行單細胞轉錄組測序，并將擬南芥根尖細胞進行分類，成功完成了植物種單細胞水平標記基因的篩選。Shulse等[24]在2019 年對擬南芥根部細胞進行更深入的研究，涵蓋幾乎所有主要的根組織和發(fā)育階段的細胞類型，證明了單細胞轉錄組測序可用于分析植物的發(fā)育過程，并展示了外部刺激導致的植物根細胞轉錄組變化。此外，單細胞轉錄組測序也被運用于植物保衛(wèi)細胞功能分析中，以解釋關鍵基因表達的作用機理[25]，并在玉米生殖細胞研究中解釋了減數分裂失敗情況下胚轉錄繼續(xù)進行的原因[26]。綜上所述，人們可以通過單細胞轉錄組測序技術對生命體在單個細胞層面上對其內部復雜的轉錄調控和表觀遺傳進行更深層次的分析，從而全面了解各類細胞以及其功能。

2 單細胞轉錄組測序技術要點

單細胞轉錄組測序的工作流程包括三個關鍵步驟：第一，單細胞的分離；第二，單細胞全轉錄組cDNA 擴增；第三，測序和初級分析；第四，數據可視化與解讀。其中包含三個關鍵的技術要點[27]：單細胞分離技術、單細胞全轉錄組cDNA 擴增技術、高通量測序技術。下文將對三個關鍵的技術要點進行闡述。

2.1 單細胞分離技術

單細胞分離技術對提升細胞通量起到關鍵的作用。由于單個細胞體積微小并容易受到外界環(huán)境的影響，分離單細胞往往十分困難。分離方法從最初的人工手動分離逐步發(fā)展至自動化的集成流體電路、微流控技術等，實現了細胞通量的大幅度提升，這些方法各有利弊，應根據具體的研究內容進行適當的選用。此外，分離得到的單細胞需要進行隔離以保證其獨有的微反應體制。

2.1.1 微流控技術 該技術具有基于流體動力穿梭的微流控芯片、微濾器以及微通道。由于單個細胞的細胞大小、物理結構都有所不同，可通過控制細胞的數量和密度實現高精度的單細胞捕獲。微流控芯片中微米級的二維或三維通道為單個細胞的操縱提供了尺寸相匹配的結構。根據不同的研究需求，微流控芯片系統(tǒng)可以將多種單細胞研究所需的操作單元，如細胞操縱相關的微泵、微閥技術，單細胞捕獲技術以及檢測分析單元等設計并集成到微小的芯片平臺上。此外，這些物理結構也會影響細胞培養(yǎng)和動態(tài)活細胞的成像能力。微流體幾何捕集系統(tǒng)通過對細胞特征信息進行成像來分離目標單細胞，有助于闡明細胞的異質性[28]。目前微流控技術已經進行了商業(yè)化的運用。

2.1.2 稀釋法 稀釋法是得到單細胞的一種相對簡單的途徑，通過將細胞群體放入不同倍比梯度的細胞懸液中稀釋，指導得到單個狀態(tài)或者極少數量狀態(tài)的細胞[29,30]。這種方法操作簡單，但不易精確控制單個細胞，容易造成分離錯誤或者丟失。因此，稀釋法可以與微流控技術相結合[31]，在微流控芯片的基礎上，設計一系列復雜的梯度網絡實現連續(xù)稀釋，使最終被分離的細胞進入芯片通道內，更有效的控制單個細胞，該方法已經被用于檢測抗菌藥物敏感性等實驗中[32]。

2.1.3 顯微操作法 顯微操作法是使用光學顯微鏡直接進行顯微操作分選的方法，能成功地分理出單個細胞，但其不適用于大量樣品的分離[33]。該方法易于操作并且能夠對單細胞進行直觀觀察，但容易損傷細胞，造成識別錯誤。

2.1.4 熒光激活細胞分選法 熒光激活細胞分選法是將表面具有特定標記的靶細胞進行富集或簡單分選的方法[34]。但在其分解流體過程中，容易造成細胞的損壞甚至導致mRNA 或DNA 的丟失。此外，使用此方法需要較大的樣品量[35]。

2.1.5 光學鑷子法 光學鑷子法是顯微操作中的一種方法[36]，通過高度聚焦的激光束夾取細胞。其缺點是不能直接接觸細胞，因為其對細胞產生的光損傷和熱損傷是無法避免的[37]。

2.1.6 集成流體電路法 集成流體電路法通過與微流控芯片技術相結合，可以設計出集成單細胞捕獲的介電泳連續(xù)分離微流控芯片,并利用介電泳原理，對外部施加非均勻電場，使細胞受到的不同大小或方向的介電泳力而實現細胞分離,利用微捕獲結構來捕獲單細胞[38]。該方法具有高通量、低成本等優(yōu)點，已經被廣泛應用于細胞捕獲和排列[39]、細胞聚焦[40]等領域中。

2.2 單細胞全轉錄組cDNA擴增技術

單細胞全轉錄組擴增是進行后續(xù)單細胞測序的前提，傳統(tǒng)的擴增方法如引物延伸與擴增法，簡并寡核苷酸引物PCR 技術對溫度等條件要求較高，且擴增片段較短，變異系數高，容易造成非特異性擴增，導致擴增產物不均勻并出現擴增偏好性[41-42]。近年來，隨著擴增技術的發(fā)展，多重置換擴增技術和多次退火環(huán)狀循環(huán)擴增技術被廣泛應用于全轉錄組cDNA 擴增中。

2.2.1 多重置換擴增技術 多重置換擴增(multiple displacement amplification, MDA)是一種等溫擴增方式，由Dean 于2002 年發(fā)明[43]。其對整個基因組覆蓋廣泛，并且在各個位點上產生的擴增偏移最小[44]，在全基因組擴增中應用廣泛。該方法先由隨機6 堿基引物在多個位點與模板DNA 進行復性，然后在phi29DNA 聚合酶的作用下在DNA 的多個位點同時開始復制；復制合成的DNA 取代模板的互補鏈，同時被置換的互補鏈又成為新的模板進行擴增[45]。該方法具有高通量和能獲取高質量DNA 的優(yōu)點，但MDA往往存在與模板無關的擴增。為了解決此問題，2017年，Wang 等[46]對MDA 進行改進，創(chuàng)造了僅以模板依賴為方式的等溫擴增(template-dependent MDA,tdMDA)，通過5’端封閉的隨機無聚體引物開展逆轉錄和MDA，以便消除與模板無關的擴增，并在人類循環(huán)RNA擴增中應用。

2.2.2 多次退火環(huán)狀循環(huán)擴增技術 多次退火環(huán)狀循環(huán)擴增技術(multiple annealing and looping-based amplification cycles, MALBAC)是謝曉亮等[42]在2012年發(fā)明全新的全基因組擴增方法。該方法引入了類似線性預擴增的方式以減少與非線性擴增相關的偏差，使用pg 級的DNA 片段作為擴增模板并使用隨機引物進行擴增，引物由固定的27個核苷酸序列和8個可在0℃下與模板均勻結合的可變核苷酸組成；在溫度升至65℃下，在具有鏈置換活性的DNA 聚合酶作用下產生長度不一(0.5 k～1.5 kb)的半擴增子；半擴增子在94℃下離開模板，并以其為模板擴增產生兩端具有互補末端(27 nt)的完整擴增子。隨后降溫至58℃使完整擴增子環(huán)化，防止進一步的擴增和交叉雜交，因此可以在很大程度上保證其發(fā)生線性擴增。在經過線性擴增循環(huán)后，使用27 nt 通用引物對得到的大量的全擴增子進行指數PCR 反應，產生下一代測序所需的微克級別DNA。

MALBAC 擴增效率高，能實現全基因組覆蓋并克服了PCR 放大過程中產生的偏差，并在輔助生殖[47]等領域發(fā)揮了重要的作用，為研究染色體疾病提供了工具。

2.3 高通量測序技術

高通量測序技術(High- throughput RNA Sequencing)是以Roche 公司的454 技術、lllumina 公司的Hi Seq 和Mi Seq 測序平臺以及Solexa 技術為基礎的測序技術。相對于傳統(tǒng)的桑格測序而言，高通量測序技術能一次對幾十萬到幾百萬條DNA 分子進行序列測定，能對絕大多數的轉錄表達進行精準地定量。其原理是酶級聯化學發(fā)光反應，將PCR 擴增的單鏈DNA 與引物雜交，并在DNA 聚合酶、底物熒光素酶等酶的作用下共同孵育形成單分子簇；擴增達到測序所需模板量后加入帶有特異熒光的堿基(dNTP)，每次只添加一個，通過其可逆止的特性，依次添加激發(fā)不同顏色的熒光基團，轉化得到結果，最終完成測序[48]。

3 單細胞轉錄組測序技術在植物研究中的應用

3.1 植物單細胞轉錄組測序技術

單細胞轉錄組測序技術目前已被生物學與醫(yī)學領域廣泛應用，由于植物細胞存在細胞壁，進行單細胞測序存在一定的難度，但其在植物研究中存在著巨大的潛力。不同的scRNA-seq 技術適用于不同的范圍，多孔板法和液滴法是目前植物研究中應用最廣泛的技術，可根據實驗目的和植物樣本類型選擇合適的技術方法[49]。在樣本量較少以及樣本稀有的情況下，使用多孔板法；對于樣本量高的實驗，可采用微流控芯片，利用液滴分選單個細胞，該方法具有高通量的特性，可獲得大量的細胞。

3.2 單細胞轉錄組測序在植物中的應用

3.2.1 研究基因表達模式和細胞功能區(qū)域特性 不同細胞內不同基因的表達影響著植物的生長與代謝，研究基因表達模式有助于判斷調控植物體內反應的基因類型，以便對植物本身以及和外部環(huán)境之間的反應進行更好的研究與改良，提高了優(yōu)化目的性狀的靶向性與可操作性。2008 年，Lieckfeldt 等[50]對擬南芥的基底細胞、表皮細胞和表皮毛細胞進行了研究，通過RT-PCR 將三類細胞的基因表達進行了分類，并從中定位參與代謝的基因。2015 年，華中農業(yè)大學嚴建兵團隊實現了玉米單細胞轉錄組測序，通過對玉米四分體的每個小孢子進行測序，加深了對減數分裂的理解[51]。Ryu 等[52]在2019 年對超過10000 個擬南芥根細胞以液滴微流控技術為基礎進行單細胞轉錄組測序，集中分析了單個細胞的發(fā)育軌跡，同時從根表皮突變體中獲得單細胞轉錄組，對其基因表達進行比較分析，完成了擬南芥根的第一代基因表達圖譜，為研究突變基因的影響提供了新的視角。

3.2.2 解釋植物發(fā)育過程與生理特性 通過對細胞類型特異性表達差異的研究，能夠解釋新的細胞類型和細胞譜系的發(fā)育軌跡，2019 年，Jean-Baptiste 等[53]通過對擬南芥跟細胞的單細胞轉錄組進行分析排序，鑒定了數百種具有細胞異質性表達的基因；此外，對總RNA 表達在發(fā)育軌跡中的變化進行評估闡明了其發(fā)展方向；最后對擬南芥幼苗進行高溫脅迫，研究了長期存在的對非生物脅迫響應中細胞異質性可能存在的影響，檢測出除熱休克基因主導跨細胞類型的表達外，其他基因之間也存在著細微但顯著的差異，證明單細胞轉錄組學對植物發(fā)育與植物生理有著重要的研究意義。此外，Denyer 等[54]通過高通量單細胞轉錄組測序技術構建了擬南芥單細胞RNA 表達圖譜，揭示了擬南芥發(fā)育中關鍵的發(fā)育調節(jié)因子和下游基因，這些基因決定了不同細胞獨特的形狀和功能，證明了單細胞轉錄組測序應用于植物的能力。

3.2.3 對植物細胞類型進行鑒定 基因的選擇性表達導致細胞分化成不同的類型，不同類型的細胞具有其獨特的功能。對植物細胞類型進行鑒定，有利于進一步研究各類別細胞對植物生命活動的影響。Zhang等[55]收獲了擬南芥根組織細胞，并將其轉化為原生質體進行單細胞轉錄組測序，將得到的數據進行線性維數縮減并得到100 個近似主成分，對其進行分析，成功將擬南芥根細胞分為24 個細胞簇；通過富集簇基因與已知的跟細胞類型和相關系數分析，進一步驗證了每個簇的細胞類型。此外Ryu 等[52]也根據擬南芥細胞的原生質體測定了每個原生質體的轉錄組，通過聚類分析將10000 個擬南芥根細胞分成了九個簇并進行了細胞亞群和罕見的細胞類型鑒定。可見，單細胞轉錄組測序技術能有效地運用于細胞類型鑒定之中。

4 展望

單細胞轉錄組測序技術能夠對植物的基因表達、發(fā)育過程以及細胞類型進行測序分析，是從細胞水平解釋動植物生命活動的有效工具。但是，在植物研究中仍存在以下兩點問題：（1）由于植物細胞存在細胞壁，目前在植物中進行的單細胞轉錄組測序僅能通過原生質體進行測序。（2）在植物基因表達模式的研究中常存在數據結果精度較低的情況。盡管如此，許多單細胞組學工具已經存在或正在開發(fā)中[56-57]，可以通過檢測染色質的可及性[58]和映射細胞的基因組情況[59]來解決這些問題，同時使該技術能更好的運用于植物研究中并建立相關抗病機制遺傳圖譜，為理解植物細胞提供更好的技術支撐。