轉基因食品成分檢測技術研究進展

候吉超，吳 斌，姜 蕾，宋晶晶，任小娜，王 東

（喀什大學 生命與地理科學學院，新疆帕米爾高原生物資源與生態(tài)重點實驗室，新疆喀什 844000）

隨著世界人口的高速增長，“全球糧食危機”已經成為全世界關注的焦點，而轉基因技術的誕生為解決“全球糧食危機”帶來了希望[1-2]。與傳統(tǒng)食品不同，轉基因食品是利用基因工程技術將外源基因導入植物體內并使其表達，通過對其加工后形成供人類食用或飲用的物質，包括加工食品、半成品和未加工食品，但不包括煙草或用于藥品的物質，而導入的外源基因通常來自于其他的生物體，包括動物、植物和微生物[3-4]。隨著轉基因作物種類的增加及其產品的大規(guī)模商業(yè)化，人們對轉基因產品的安全性產生一定的質疑，監(jiān)管部門、企事業(yè)單位、科研單位和消費者對轉基因檢測技術提出更高的要 求[5-6]。因此，建立高通量、便捷、高效的轉基因檢測方法對促進我國食品安全檢測的發(fā)展以及完善轉基因標識管理制度等方面意義重大。

目前，國內外對轉基因食品的檢測主要是基于外源蛋白靶標和外源核酸成分，相繼建立了一系列快速、靈敏的轉基因食品定性、定量檢測技術，如酶聯(lián)免疫吸附技術（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）、聚 合 酶 鏈 式 反 應（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術等[7]。本文對轉基因食品檢測技術的原理、優(yōu)缺點、研究進展及發(fā)展方向進行簡要概述，以期為我國轉基因食品檢測技術體系的發(fā)展提供參考依據(jù)。

1 外源基因的檢測技術

基于外源基因的轉基因食品檢測技術主要以PCR為主，它利用聚合酶鏈式反應將外源基因在體外進行擴增，通過是否擴增出外源基因對轉基因食品進行檢測。常見的基于外源核酸成分的轉基因檢測技術主要包括多重PCR檢測技術[8]、熒光定量PCR檢測技術[9]、等溫擴增技術[10]和基因芯片技術[11]等。

1.1 多重PCR檢測技術

多重PCR（Multiplex PCR）又稱復合PCR，是在常規(guī)PCR基礎上發(fā)展而來的。多重PCR是指在同一個PCR反應體系中加入多對特異性引物，可以同時擴增出多個目的基因片段。與常規(guī)PCR相比，該技術是多個擴增反應同時進行，各個擴增反應在擴增過程中存在相互競爭，一定程度上降低了假陽性出現(xiàn)的概率[12]；同時各個擴增反應之間會相互競爭Taq DNA聚合酶，擴增效率相對較低的反應將會受到抑制，添加適量濃度的Taq DNA聚合酶可以有效地減弱抑制作用[13]。多重PCR具有高效性，對多個品系的轉基因成分進行檢測時，同一PCR反應體系中可以同時擴增出多個不同的目的基因，因此在檢測通量和成本控制方面具有明顯優(yōu)勢，且節(jié)省時間和試劑[14]。潘志文等[15]對轉基因抗病番木瓜品系Event55-1、GM YK、華農1號共3個轉基因番木瓜品系的序列進行分析，成功建立了轉基因木瓜多重PCR方法，并利用不同的轉基因木瓜品系對該方法進行驗證，但該方法各個反應條件仍需要進一步優(yōu)化，否則易使特異性和靈敏度降低。

1.2 熒光定量PCR檢測技術

隨著世界各國對轉基因相關產品標識制度的逐步建立和不斷完善，一些國家明確規(guī)定了轉基因成分的最低含量閾值，如韓國為3%，巴西為1%，歐盟為0.9%等[16-17]。因此，需要建立和開發(fā)新的轉基因產品定量檢測技術。實時熒光定量PCR技術是將熒光染料和PCR結合，利用實時熒光信號變化監(jiān)測靶基因擴增的整個過程，根據(jù)建立的標準曲線以及Ct值對目的基因進行定量分析，實現(xiàn)了PCR從定性分析到定量分析的飛躍。與常規(guī)PCR技術相比，實時熒光定量PCR技術具有污染少、定量準確、實時監(jiān)測和自動化程度高等優(yōu)點[18]，但該方法對引物設計要求高且設備儀器昂貴，需專業(yè)操作人員操作。目前，熒光定量PCR已被廣泛應用于轉基因產品檢測。根據(jù)熒光定量PCR的化學發(fā)光原理，可將熒光定量PCR分為TaqMan探針法與SYBR Green染料法[19]兩大類。邵彪等[20]以CaMV 35S啟動子、NOS終止子以及標記基因NPTⅡ特異片段序列為靶基因，利用多重PCR和熒光定量PCR的特點，成功建立了多重熒光定量PCR方法，成功在肉制品中檢測到植物源性轉基因成分：CaMV 35S啟動子、NOS終止子以及標記基因NPTⅡ。該方法靈敏度高達1 pg、重復性好且與單重PCR體系的檢測結果一致。

1.3 等溫擴增技術

等溫擴增技術是近年來新發(fā)展起來的核酸恒溫擴增檢測技術。該技術是在恒溫條件下，利用不同活性的酶和特異性引物對目的基因進行擴增的技術。與常規(guī)PCR相比，該類檢測技術具有靈敏度高、特異性強、等溫高效、操作簡單和設備要求低等優(yōu)勢，具有良好的應用前景[21-22]。由于該方法靈敏度高，操作時容易形成氣溶膠污染且對引物的設計要求比較高。常見等溫擴增技術包括環(huán)介導等溫擴增（Loopmediated Isothermal Amplification，LAMP）[23]、 鏈替代等溫擴增（Strand Displacement Amplification，SDA）[24]、單引物等溫擴增（Single Primer Isothermal Amplification，SPIA）[25]、滾 環(huán) 等 溫 擴 增（Rolling Circle Amplification，RCA）[26]以 及 跨 越 式 滾 環(huán)等 溫 擴 增（Saltatory Rolling Circle Amplification，SRCA）[27]等。目前，環(huán)介導等溫擴增技術已在一定范圍內得到應用，其他新發(fā)展起來的等溫擴增技術還在不斷完善中。YU等[28]將LAMP技術和TaqMan探針相結合，建立了一種新的LAMP-TaqMan檢測方法，該方法在65 ℃恒溫下，20 min內可擴增出目的DNA，可檢測到至少5個拷貝的靶序列，該方法具有類似于TaqMan qPCR的高特異性，且檢測速度比TaqMan qPCR快，為食品中轉基因成分的快速檢測提供了一種新的技術。

1.4 基因芯片技術

基因芯片技術是近年來快速發(fā)展起來的分子生物學高新技術，是基于核酸雜交的一項高通量檢測技術。該技術利用固體基質表面上特定探針與標記的樣品進行雜交，通過分析雜交信號強度，能夠準確地對樣品中不同種類的DNA序列進行定性、定量的檢測[29]?；蛐酒某霈F(xiàn)解決了傳統(tǒng)核酸印記雜交技術，如Southern Blotting和Northern Blotting等存在的操作繁雜、自動化程度低、操作序列數(shù)量少和檢測效率低等不足的問題[30]。而且，通過設計不同的探針陣列、使用特定的分析方法可使該技術具有多種不同的應用價值，如基因表達譜測定、實變檢測、多態(tài)性分析、基因組文庫作圖及雜交測序等，目前該技術已被廣泛應用于轉基因檢測等許多領域[31]。TURKEC等[32]針對12個轉基因品種（3個大豆和9個玉米）開發(fā)出一套基因芯片檢測方法，該方法能夠特異性地識別每個品種，且靈敏度高。基因芯片技術具有高通量、靈敏度高、特異性強等優(yōu)點，但由于其成本較高、制作基因芯片技術復雜、背景干擾嚴重等問題，一定程度上影響了該技術的廣泛應用。

2 基于外源蛋白的檢測技術

基于外源蛋白的轉基因食品檢測技術主要以免疫分析技術為基礎建立，利用轉基因作物產生的特定的外源蛋白與抗體的免疫反應從而對外源蛋白進行定性和定量的分析。常見的基于外源蛋白靶標的轉基因食品檢測技術包括酶聯(lián)免疫吸附技術（ELISA）[33]、蛋白免疫印跡（Western blot）檢測技術[34]、膠體金試紙條技術和蛋白質芯片技術[35]等。

2.1 酶聯(lián)免疫吸附技術

酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）是將可溶性的抗原或抗體固定到ELISA酶標板上，保持其免疫活性，同時利用抗原抗體特異性結合反應與酶對底物高效催化反應相結合，通過酶催化產生的顏色深淺進行定性和定量分析檢測[36-37]。目前，該方法已被廣泛用于轉基因作物及其相關產品的定性和定量分析。常見的ELISA方法主要以雙抗夾心ELISA為主，該方法靈敏度高、特異性強、高通量以及定量準確，是目前商品化檢測試劑盒采用的主要方法之一[38]。GUERTLER等[39]利用雙抗體夾心ELISA實現(xiàn)了對轉基因玉米中Cry1Ab蛋白的檢測，最低檢測限為 0.4 ng/mL。但該方法操作步驟煩瑣，需要頻繁地洗滌孵育，檢測時間達3～4 h。JIANG等[40]對ELISA方法進行改良，通過制備初級抗體-次級抗體復合物（Ab-Ab復合物）建立了一步ELISA方法。相對于傳統(tǒng)的ELISA，該方法不僅可以提高檢測靈敏度，而且簡化了操作步驟，極大地縮短了檢測時間，為開發(fā)蛋白質快速檢測方法提供了新的方向。

2.2 Western Blot檢測技術

Western Blot檢測技術是定性、定量檢測蛋白表達的一種經典實驗方法，其原理是利用蛋白質凝膠電泳在電場力的作用下使蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠上逐步分離，并轉移到固相載體（如硝酸纖維素膜或聚偏二氟乙烯膜上），使膜上的蛋白質與相應的抗體發(fā)生免疫反應形成抗原-抗體復合物，然后與酶標記的二抗反應，通過顯色反應對轉基因食品中外源蛋白進行檢測[41]。該技術將電泳的高分辨能力與抗原抗體免疫反應的特異性相結合，可以定性和定量地檢測轉基因作物和食品中的外源蛋白質。TIAN等[42]建立了一種Western Blot方法，該方法可以快速、靈敏地檢測轉基因飼料產品中的外源蛋白，檢測限為0.5%。WANG等[43]利用Western Blot技術成功檢測到外源EPSPS蛋白在轉基因煙草葉片中的完整表達。但是該方法操作步驟煩瑣，檢測周期長，需要專業(yè)的技術操作及設備，適用于實驗室檢測，不適用于快速檢測和商品化檢測[5]。

2.3 膠體金試紙條技術

膠體金試紙條檢測法是利用膠體金免疫層析技術研制而成，該技術是以免疫滲濾技術為基礎建立的一種快速簡易的免疫學檢測技術，可用于間接定性或半定量的檢測[44]。膠體金在堿性環(huán)境中帶負電荷，并與蛋白質分子的正電荷產生靜電吸引，從而牢固結合，以硝酸纖維素膜為載體，利用了微孔膜的毛細血管作用，使滴加在膜一端的液體緩慢向另一端滲透轉移，通過抗原抗體結合，并利用膠體金呈現(xiàn)顏色反應，檢測外源蛋白[45-46]。SANTOS等[47]研究開發(fā)了一種試紙條，它可以同時檢測Cry1Ac和Cry8Ka5殺蟲蛋白，檢出限為0.06 μg。目前，膠體金免疫層析試紙條技術已被應用于食品各領域，如利用膠體金免疫層析試紙條技術檢測食品中的污染物[48]、非法添加劑[49]、食源性致病菌[50]、食品中農藥殘留[51]及食品中重金屬污染[52]等。膠體金試紙條法具有快速、簡便、靈敏度高及較低基質效應等特點，個人可以獨立完成，判定方法簡單，適合于單個樣品檢測和非專業(yè)人士使用，且不需要其他設備，操作簡單，可立即得到檢測結果，適用于社會防疫、現(xiàn)場檢測等方面[53]。但該方法易受待測樣品中雜質的干擾，導致假陰性的出現(xiàn)，同時該方法對配對金標抗體特異性要求極高，制作復雜，時間成本高[54]。

2.4 蛋白質芯片技術

蛋白芯片技術又稱蛋白質微陣列，是一種高通量的蛋白功能分析技術，可用于蛋白質表達譜分析，研究蛋白質與蛋白質的相互作用[55]。與基因芯片類似，蛋白質芯片利用化學和物理方法對固相載體進行處理，再將已知的蛋白固定在載體上形成蛋白質探針，如酶、抗原、抗體等，捕獲能與之特異性結合的轉基因蛋白，最后用專用計算機進行定性、定量分析[56]。汪琳等[57]建立了抗體蛋白芯片檢測方法，可同時檢測3種轉基因成分。蛋白質芯片技術有著快速、高通量、特異性強及檢測效率高的優(yōu)點，能將多個、不連續(xù)的檢測過程轉變?yōu)橐粋€連續(xù)、快速的檢測分析過程，極大地節(jié)省了時間、試劑以及勞動量，在未來食品科學和檢測領域具有廣闊的發(fā)展前景，但該方法也存在蛋白芯片成本高、固相載體的選擇易導致雜蛋白的非特異性吸附以及靈敏度低等問題。

3 展望

隨著轉基因作物迅速推廣及擴大種植，轉基因食品的安全性成為人們關注的焦點，現(xiàn)有的常規(guī)轉基因檢測方法都存在一些局限性，如通量低、檢測時間長、成本高及需要特殊的儀器設備等，已不能滿足對轉基因食品快速、靈敏、高通量的檢測。因此建立一種快速檢測轉基因食品的檢測技術極為重要。

目前，商品化轉基因檢測試劑盒中基于蛋白檢測的ELISA定性、定量檢測試劑盒與試紙條檢測深受科研人員的青睞，相比于核酸檢測試劑盒，PCR檢測對檢測環(huán)境要求高、易污染，且步驟煩瑣，而ELISA試劑盒與試紙條對檢測環(huán)境要求低，操作相對簡單。試紙條在檢測時速度快，使用方便，但其在進行批量檢測時成本較高，而ELISA試劑盒由于其高通量、較高靈敏度、特異性強、重復性好、可進行定量和半定量測定等優(yōu)點已被廣泛應用。候吉超等[5]對雙抗夾心ELISA方法進行改良，利用方陣法篩選出識別不同抗原表位的單抗并進行配對，同時對工作條件進行優(yōu)化，整個檢測過程僅需2步，減少了一抗、二抗的孵育和煩瑣的洗滌過程，簡化了操作步驟，將檢測時間縮短至30 min內，極大地節(jié)約了檢測成本。

目前，轉基因作物及食品的檢測方法主要以蛋白檢測和核酸檢測為主，但由于蛋白質在加工過程中受高溫高壓及酸堿的作用，蛋白質結構易改變，易喪失抗原性，因此蛋白質檢測方法適用于轉基因初產品，而基于PCR技術的檢測方法因具有檢測范圍廣、特異性好、靈敏度高等優(yōu)點而被廣泛使用，但由于其對引物設計、操作環(huán)境、檢測設備要求高，使其使用受到一定限制。因此，在檢測過程中，應根據(jù)檢測環(huán)境、檢測性質、操作方式和儀器設備等選擇合適的檢測方法。不同的檢測技術都有其各自的優(yōu)缺點，為了快速準確地對轉基因作物及食品進行檢測，可以利用不同檢測技術的特點，將不同的檢測技術相結合，最大限度地提高檢測效率和準確率，實現(xiàn)對轉基因產品的快速定量檢測，因此開發(fā)聯(lián)合檢測技術是一個新的方向。

隨著人們對食品安全的關注度的提高以及轉基因檢測技術的發(fā)展，轉基因食品檢測趨于自動化、信息化，轉基因檢測技術將不僅僅局限于科學研究和實驗室檢測，為了方便更多的家庭及非專業(yè)人士可以快速分辨出食物中是否含有轉基因成分，開發(fā)出高效、快速、便捷、高通量、低成本，且無需特殊的檢測設備適合非專業(yè)人士的檢測方法，將成為今后轉基因檢測技術研究的發(fā)展趨勢。