氟苯尼考通過影響肉雞藥物代謝和介導(dǎo)炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)腎損傷

盧春雨，張 璐，劉 維，竇萌萌，史萬玉,2*，包永占,2*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 中獸醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000；2.河北省生物技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 保定 071000)

氟苯尼考(florfenicol,FFC)，又稱氟甲砜霉素，是一種廣譜抗生素，于1988年在美國被Schering-Plough公司研制成功[1]。FFC具有吸收良好、體內(nèi)分布廣泛、抗菌譜廣、抗菌作用強(qiáng)等特點(diǎn)，在農(nóng)場動物中被廣泛使用，以治療感染，也用于預(yù)防以及飼料添加劑[2-3]。隨著FFC的廣泛使用，F(xiàn)FC對各種動物的多器官損害已被報(bào)道。高劑量的FFC(40,60 mg/kg)顯著改變了山羊血液中的腎臟和肝臟功能指標(biāo)[4]；FFC引起大鼠的空腸黏膜損傷和絨毛破裂，阻礙有益菌增殖而使腸道菌群失調(diào)，引起胃腸道功能紊亂[5]。FFC誘導(dǎo)造血細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯和凋亡，并通過減少外周血細(xì)胞的數(shù)量改變骨髓造血微環(huán)境[6]。治療劑量的FFC誘導(dǎo)仔豬血清和組織中出現(xiàn)IL-6、HSP70濃度的增加，并影響免疫功能[7]。

家禽腎臟結(jié)構(gòu)較簡單，濾過面積小，有效濾過壓較低，對經(jīng)腎臟排泄的物質(zhì)(包括藥物)很敏感，極易造成損害，引起腎功能不全[8]。研究表明，雞內(nèi)服FFC后吸收迅速,代謝相對緩慢，在腎臟分布濃度較高，代謝產(chǎn)物主要經(jīng)尿及膽汁排泄，極易傷害腎臟[9-10]。FFC在雛雞腎臟結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯的損傷作用，損害雛雞的腎功能[11]。WANG等[12]發(fā)現(xiàn)FFC通過促進(jìn)凋亡因子Caspase-3 和 Caspase-6的表達(dá)來提高腎臟細(xì)胞的凋亡率，導(dǎo)致腎細(xì)胞過度凋亡，嚴(yán)重影響雛雞腎功能。此外，藥敏試驗(yàn)表明FFC對垂直感染的疾病，如沙門菌、大腸桿菌及支原體敏感性較好，目前 FFC常作為開口藥用于家禽養(yǎng)殖，并且近年來 FFC 是禽蛋及禽肉中藥殘檢出率較高的藥物之一，也導(dǎo)致藥物在雞體內(nèi)殘留，影響雞肉食品的質(zhì)量和安全，進(jìn)而影響人體健康[13]。因此，本研究分析FFC誘導(dǎo)雛雞腎損傷的分子機(jī)制，為獸醫(yī)臨床防治的合理使用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑FFC溶液(市售獸用臨床非處方藥物，純度≥10%，山東神牛動物藥業(yè)有限公司)；尿酸(UA)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cre)(南京建成生物工程研究所)；蘇木精、伊紅染色液(北京博奧拓達(dá)科技有限公司)；IL-6、IL-1β、TNF-α、ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，上海)；Eastep?Super總 RNA提取試劑盒(LS1040,Promega,北京)；Go ScriptTMReverse Transcription System(A5001,Promega,USA)；Go Taq?PCR Master Mix(A6001 Promega,USA)。

1.2 動物分組與處理1日齡AA肉雞(購自河北大午公司)肉雛雞隨機(jī)分成2組，每組30只，分別為空白組和FFC組。FFC組給予0.15 g/L FFC混水(中國獸藥典推薦劑量)，從 1日齡開始，連續(xù)給藥 5 d，飼養(yǎng)周期42 d。每天保證24 h光照，溫度(25±5)℃，濕度55%±5%，自由飲水采食。給藥結(jié)束，各組分別隨機(jī)取 3只雞，無菌摘取其腎組織，置于無酶管，送上海派森諾生物技術(shù)有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。分別于6，42日齡，每組隨機(jī)選10只，翅下靜脈采血，在4℃低溫條件下以3 500 r/min離心10 min，分離出血清。迅速摘取腎臟組織，然后將腎組織分為2部分，一部分用10%中性甲醛溶液固定，一部分于-80℃冰箱冷凍保存。

1.3 腎功能測定分離的血清嚴(yán)格按UA、BUN、Cre試劑盒說明書操作，測定血清中各指標(biāo)水平的變化。

1.4 腎臟病理切片取固定好的腎組織，脫水，石蠟包埋，以5 μm的厚度切片后，用蘇木精-伊紅(HE)染色，并在光學(xué)顯微鏡下觀察石蠟切片。

1.5 炎性因子檢測稱取500 mg腎組織放到適量的預(yù)冷的PBS的離心管內(nèi)，進(jìn)行勻漿后，離心取上清液，得到10%的腎臟組織勻漿溶液，并通過ELISA法分別對其進(jìn)行IL-6、IL-1β、TNF-α ELISA 試劑盒操作，計(jì)算腎組織中炎癥因子的水平。

1.6 轉(zhuǎn)錄組測序通過 Oligo(dT) 磁珠富集總 RNA 中帶有 poly A 結(jié)構(gòu)的 mRNA，采用離子打斷的方式，將 RNA 打斷到長度300 bp左右的片段。以 RNA 為模板，用6堿基隨機(jī)引物和逆轉(zhuǎn)錄酶合成 cDNA 第一鏈，并以第一鏈 cDNA 為模板進(jìn)行第二鏈 cDNA 的合成。文庫構(gòu)建完成后，采用PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫片段富集，之后根據(jù)片段大小進(jìn)行文庫選擇，文庫大小在450 bp。接著，通過 Agilent 2100 Bioanalyzer 對文庫進(jìn)行質(zhì)檢，再對文庫總濃度及文庫有效濃度進(jìn)行檢測。樣品經(jīng)過 RNA 抽提、純化、建庫之后，基于 Illumina HiSeq 測序平臺，對這些文庫進(jìn)行雙末端 (Paired-end，PE)測序。采用 DESeq 對基因表達(dá)進(jìn)行差異分析，篩選差異表達(dá)基因條件為表達(dá)差異倍數(shù) |log2FoldChange|>1 ，顯著性P<0.05 。使用數(shù)據(jù)庫GO對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能注釋，包括分子功能(molecular function)、細(xì)胞組分(cellular component)和生物過程(biological process)3大類。同時(shí)將差異表達(dá)基因序列在KEGG 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行注釋，其顯著性富集分析的P值計(jì)算和閾值與GO 富集分析相同。通過pathway 顯著性富集確定差異表達(dá)基因參與的最主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

1.7 RT-PCR檢測差異基因使用總RNA提取試劑盒提取不同組肉雞腎臟組織總RNA。用核酸定量儀器上檢測，將合格的RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA的合成。以β-action作為內(nèi)參基因，用RT-PCR法對UGT1A1、CYP1B1、TLR1、TLR2、TLR4、Caspase-8基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測，引物由TaKaRa(大連，中國)設(shè)計(jì)并合成(表1)。使用LightCycler?96全自動熒光定量PCR儀設(shè)置程序如下：預(yù)變性95℃ 30 s;以95℃ 5 s,55℃ 30 s,72℃30 s擴(kuò)增4個(gè)循環(huán)。以2-△△Ct計(jì)算各目的基因相對轉(zhuǎn)錄水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS 18.0軟件統(tǒng)計(jì)差異顯著性，P<0.05或P<0.01表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示；通過GraphPad Prism 5.0 軟件對數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行繪圖分析。

表1 引物和基因序列

2 結(jié)果

2.1 腎臟功能指標(biāo)對6,42日齡的肉雞進(jìn)行腎功能指標(biāo)檢測,由圖1可知，與空白組相比，F(xiàn)FC組6和42日齡肉雞血清中Cre、BUN、UA都顯著升高(P<0.05或P<0.01)。

注：與正常組相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01。下同

2.2 腎臟病理切片在光學(xué)顯微鏡下，空白組6和42日齡肉雞腎小管結(jié)構(gòu)完整清晰，未見炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象(圖2A,B)。與空白組相比，F(xiàn)FC組6和42日齡肉雞腎小管結(jié)構(gòu)損傷較為嚴(yán)重，可見明顯的腎小管上皮細(xì)胞崩解，刷狀緣脫落，細(xì)胞碎片進(jìn)入腎小管管腔(圖2C,D)。此外，42日齡肉雞的腎臟間質(zhì)有炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象(圖2 D)。

A.6日齡空白組肉雞腎臟組織，400×；B.42日齡空白組肉雞腎臟組織，400×；C.6日齡FFC組肉雞腎臟組織，400×；D.42日齡FFC組肉雞腎臟組織，400×。(黃色箭頭指示腎小管結(jié)構(gòu)，TEC；紅色箭頭指示腎小管上皮細(xì)胞脫落，DTEC；綠色箭頭指示炎癥因子浸潤，Ⅱ)

2.3 原始數(shù)據(jù)質(zhì)量評估與參考序列比對分析本研究通過構(gòu)建空白組和FFC組的轉(zhuǎn)錄組文庫，共獲得 6 GB clean data數(shù)據(jù)量，各樣品的clean rate 均高達(dá)93%，Q30均在92%以上，比對率均在93%以上，說明測序數(shù)據(jù)質(zhì)控水平較高，測序質(zhì)量優(yōu)良，完整性高，能夠滿足后續(xù)數(shù)據(jù)分析的要求(表2)。

表2 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.4 差異基因篩選本研究篩選各組的差異表達(dá)基因，由圖3知，與空白組相比，F(xiàn)FC組上調(diào)109個(gè)，下調(diào)基因584個(gè)。其中，F(xiàn)FC組與免疫相關(guān)顯著差異表達(dá)的基因： Toll樣受體1(TLR1)、Toll樣受體2(TLR2)、Toll樣受體4(TLR4)、半胱氨酸蛋白酶-8(caspase-8)、具有膠原結(jié)構(gòu)巨噬細(xì)胞受體(MARCO)、腫瘤壞死因子超家族成員10(TNFSF10)等；與藥物代謝酶有關(guān)的基因：葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UGT1A1)、細(xì)胞色素P450 1B1 (CYP1B1)、細(xì)胞色素P450 2D6 (CYP2D6)、細(xì)胞色素P450 51A1(CYP51A1)。

圖3 空白組與FFC組差異表達(dá)基因分布火山圖

2.5 差異表達(dá)基因的GO富集分析與空白組相比，F(xiàn)FC組差異表達(dá)基因分類于405個(gè)功能項(xiàng)中，包括305個(gè)生物學(xué)過程(BP)，51個(gè)細(xì)胞組分(CC)和49個(gè)分子功能(MF)。挑選富集最顯著的前30個(gè)GO term條目進(jìn)行展示(圖4)，空白組與FFC組其中參與細(xì)胞過程(BP)較為豐富的是(GO:0002682)調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)過程、(GO:0002376)免疫系統(tǒng)進(jìn)程、(GO:0022610)生物黏附等。參與細(xì)胞組分(CC)富集較為豐富的是(GO:0031012)細(xì)胞外基質(zhì)、(GO:0005576)細(xì)胞外區(qū)域、(GO:0044459)質(zhì)膜部分等。參與分子功能(MF)較為豐富的是(GO:0048407)血小板衍生生長因子結(jié)合、(GO:0004871)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性等。圖4B分析結(jié)果顯示，生物過程中的免疫系統(tǒng)進(jìn)程的調(diào)節(jié)是腎臟損傷的關(guān)鍵門類。

A.空白組與FFC組GO富集分析柱狀圖； B.空白組與FFC組生物過程分析圖(Top 10)。

2.6 KEGG通路由圖5可知，KEGG分析發(fā)現(xiàn)FFC組肉雞腎臟涉及的代謝通路主要包括吞噬體、細(xì)胞黏附、細(xì)胞因子與細(xì)胞因子互作、藥物代謝-細(xì)胞色素P450、類固醇生物合成、細(xì)胞色素P450對外源性物質(zhì)的代謝、腸道免疫IgA的產(chǎn)生、Toll樣受體通路等，當(dāng)腎臟損傷時(shí)，其相關(guān)代謝通路的含量也會隨之變化。由表3可知，F(xiàn)FC組肉雞腎臟主要富集在Toll受體信號通路的TLR1、TLR2、 TLR4 和Caspase-8基因和外源性物質(zhì)通過細(xì)胞色素P450代謝通路的CYP1B1和UGT1A1基因。

圖5 空白組與FFC組KEGG柱狀圖

表3 主要富集通路及差異基因

2.7 RT-PCR驗(yàn)證差異基因?qū)νㄟ^GO和KEGG富集分析的差異基因UGT1A1、CYP1B1、TLR1、TLR2、TLR4、Caspase-8進(jìn)行驗(yàn)證，由圖6可知，與空白組相比，F(xiàn)FC組6和42日齡肉雞CYP1B1、UGT1A1表達(dá)水平降低(P<0.05)；FFC組6和42日齡肉雞TLR4表達(dá)水平升高(P<0.01)；此外，F(xiàn)FC組6日齡肉雞TLR1表達(dá)水平升高(P<0.05)；UGT1A1、CYP1B1、TLR1、TLR4基因表達(dá)水平與RNA-seq結(jié)果一致。TLR2、Caspase-8基因表達(dá)水平無顯著性差異(P>0.05)。

圖6 各組肉雞差異基因RT-PCR分析

2.8 腎臟炎性因子的檢測由圖7可知，與空白組相比，F(xiàn)FC組6日齡和42日齡肉雞腎臟組織中IL-6表達(dá)水平均上調(diào)(P<0.05)；此外，6日齡肉雞腎臟組織中TNF-α表達(dá)水平顯著性上調(diào)(P<0.05)。6日齡和42日齡肉雞腎臟組織中IL-1β表達(dá)水平無顯著性差異(P>0.05)。

圖7 各組肉雞腎臟炎癥因子IL-6(A)、IL-1β(B)和TNF-α(C)的表達(dá)水平

3 討論

腎臟具有循環(huán)和排泄功能，是毒物的靶器官[14]。FFC暴露后引起腎臟組織的微觀結(jié)構(gòu)變化，包括充血、腫脹和管型。UA、BUN 和 Cre常用于評估腎臟疾病進(jìn)程。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，F(xiàn)FC誘導(dǎo)的肉雞腎臟損傷在用藥結(jié)束(6日齡)出現(xiàn)UA、BUN 和 Cre 水平的升高，且隨著時(shí)間延長至出欄時(shí)(42日齡)，UA、BUN 和 Cr 水平也升高，提示肉雞腎臟損傷模型建立成功。這與WANG等[12]的研究一致。為了進(jìn)一步探討FFC對肉仔雞腎損傷的作用機(jī)制，我們采用了轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)分析FFC對肉雞腎損傷的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)，為臨床研究提供參考。結(jié)果表明，F(xiàn)FC能不同程度地誘導(dǎo)Toll受體信號通路(TLR1、TLR4)和外源性物質(zhì)通過細(xì)胞色素P450代謝(CYP1B1、UGT1A1)等途徑。提示FFC可通過引起肉雞腎功能紊亂而影響肉雞這些基因的異常表達(dá)。

肉雞藥物性腎損傷最常見的原因是抗生素、氨氣、重金屬等，它們的大多數(shù)代謝物具有腎毒性。藥物反應(yīng)有2個(gè)步驟，即Ⅰ期和Ⅱ期。第一階段反應(yīng)：藥物水解、氧化和還原生成代謝物，主要代謝產(chǎn)物酶是細(xì)胞色素P450[15]。研究表明FFC能顯著抑制肉雞肝組織內(nèi)肝藥酶CYP1A1和CYP2H1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平[16]。我們的結(jié)果表明FFC降低了6日齡和42日齡肉雞腎臟CYP1B1含量。另外，UDP-葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UGT)是體內(nèi)重要的Ⅱ相代謝酶之一，內(nèi)外源性化合物及毒性代謝物清除與解毒的機(jī)制是其經(jīng)UGT催化轉(zhuǎn)化為極性較強(qiáng)的結(jié)合物,后經(jīng)腎臟排出體外,從而完成內(nèi)外源性化學(xué)物以及毒性代謝物在體內(nèi)的代謝消除[17-18]。在本研究中，F(xiàn)FC顯著抑制了6日齡和42日齡肉雞腎臟UGT1A1的表達(dá)。提示FFC通過CYP1B1、UGT1A1影響腎臟藥物代謝反應(yīng)；FFC及其代謝產(chǎn)物的積聚可能會影響腎小管并引起腎小管內(nèi)藥物濃度增加，進(jìn)而影響腎臟的正常生理功能。

TLRs 與腎臟疾病的發(fā)生密切相關(guān),TLRs可能通過激活 NF-κB 信號通路，促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)而在腎臟衰老過程中發(fā)揮重要作用[19]。過度激活炎癥受體TLR1和TLR4可誘導(dǎo)TNF-α、IL-6和IL-1β的強(qiáng)烈表達(dá)，從而促進(jìn)多器官細(xì)胞毒性[20]。研究發(fā)現(xiàn)脂多糖誘導(dǎo)的急性腎損傷模型中，腎臟組織中TLR4的表達(dá)明顯增加，血清中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平上升[21]。四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠急性腎損傷中，存在腎臟組織促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β和TLR4 表達(dá)上調(diào)[22]。本研究發(fā)現(xiàn)FFC均可以明顯增加肉雞腎臟組織TLR1、TLR4的基因表達(dá)水平，且炎癥因子TNF-α和IL-6水平顯著上升。

本研究發(fā)現(xiàn)FFC造成肉雞腎臟損傷機(jī)制：一方面通過抑制藥物代謝酶CYP1A1、UGT1B1，抑制FFC的代謝過程；另一方面，F(xiàn)FC通過誘導(dǎo)TLR1、TLR4的表達(dá)，增加促炎因子TNF-α、IL-6的生成，從而造成腎小管結(jié)構(gòu)變化，并升高了肉雞血清中肌酐、尿素氮、肌酸水平。這一研究表明，F(xiàn)FC的應(yīng)用可能通過抑制藥物代謝、介導(dǎo)炎癥等方式促進(jìn)肉雞腎臟損傷的形成。