廣西地區(qū)不同黃羽肉雞品系種公雞群中禽白血病流行病學(xué)調(diào)查

崔真毓，韋祖樟，張亞文，張智慧，趙 鵬，常 爽*，黃偉堅(jiān)*

(1.廣西大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山東 泰安 271018)

禽白血病(avian leukemia,AL)是由禽白血病/肉瘤病毒群病毒(avian leukosis/sarcoma viruses，ALSV)引起的以免疫抑制、生長(zhǎng)抑制和多器官組織出現(xiàn)腫瘤等為主要特征的禽類多種良性和惡性的腫瘤性疾病統(tǒng)稱[1]。根據(jù)ALV的宿主范圍、病毒囊膜糖蛋白抗原結(jié)構(gòu)和病毒中和反應(yīng)將其分為A～J共10個(gè)亞群[2]，以及在我國(guó)地方品系雞基因庫(kù)中新鑒定出的K亞群[3]。此前，在很長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)，由于我國(guó)一直未曾開展全面系統(tǒng)的AL凈化，我國(guó)不同雞群特別是黃羽肉雞群和純地方品系雞群感染ALV的報(bào)道已有很多[4-8]。

為了減少ALV感染帶來的巨大損失，一些大型種雞場(chǎng)不得不開始實(shí)施嚴(yán)格的AL凈化措施，凈化初期主要借鑒發(fā)達(dá)國(guó)家的凈化程序。盡管ALV可以在孵化和育雛期間通過水平傳播，也可以通過使用了含有ALV污染的弱毒疫苗等特殊途徑而傳播[9-10]，但垂直傳播始終是ALV最主要的傳播方式，因此凈化始終瞄準(zhǔn)種雞繁育體系中的原種雞群開展。最初凈化時(shí)多數(shù)種禽場(chǎng)重點(diǎn)關(guān)注了母雞而忽視了公雞,特別是公雞精液在ALV傳播中的作用，其客觀原因是，在很長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)國(guó)際上對(duì)于公雞在ALV傳播中發(fā)揮的作用并無明確闡述。然而在凈化的長(zhǎng)期實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，公雞及其精液在ALV傳播中可能發(fā)揮了重要作用，并開始重視對(duì)種公雞的檢測(cè)。李陽等[11]通過系統(tǒng)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)首次證明了ALV-J可以通過公雞的精液感染母雞并且垂直傳播給子代的雛雞，這一發(fā)現(xiàn)提示加強(qiáng)對(duì)公雞ALV的感染和帶毒情況開展系統(tǒng)流行病學(xué)調(diào)查對(duì)于實(shí)施AL凈化具有非常重要的意義。本研究對(duì)廣西地區(qū)正在實(shí)施AL凈化的種雞場(chǎng)的12個(gè)不同品系種公雞群,分別同時(shí)采用血漿病毒分離和精液病毒分離兩種方式對(duì)其ALV感染狀況開展了流行病學(xué)調(diào)查，以期為了解這些品系公雞中ALV感染狀況進(jìn)而實(shí)施凈化提供必要的參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品與細(xì)胞分別從正在實(shí)施AL凈化的12個(gè)不同黃羽肉雞品系種公雞群采集樣品，各品系代號(hào)及其日齡與采樣數(shù)量參見表1。對(duì)每一只公雞以含有肝素鈉的一次性無菌抗凝采血管采集血液，同時(shí)采集精液，所有公雞的血液和精液樣品均一一對(duì)應(yīng)編號(hào)?？蓞^(qū)分內(nèi)源性和外源性ALV的DF-1細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC(American Type Culture Collection)，其培養(yǎng)所需的生長(zhǎng)液為含10%胎牛血清(FBS，GIBCO，USA)的DMEM，維持液為含1%FBS的DMEM。

表1 12個(gè)黃羽肉雞品系種公雞群編號(hào)表

1.2 血漿樣品的病毒分離鑒定每只公雞均以無菌肝素鈉抗凝采血管經(jīng)翅靜脈無菌采集抗凝血1 mL，在1 200 r/min轉(zhuǎn)速下，于4℃離心3 min后取100 μL血漿樣品接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板已長(zhǎng)成單層的DF-1細(xì)胞上，37℃孵育2 h后棄掉細(xì)胞生長(zhǎng)液，用無菌PBS洗滌2次細(xì)胞后更換為細(xì)胞維持液，在37℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)9 d后收集培養(yǎng)上清，以ALV-p27抗原ELISA檢測(cè)試劑盒(IDEXX，USA)按照說明書進(jìn)行檢測(cè)，以確定是否存在外源性ALV感染，p27陽性樣品的上清液保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 精液樣品的病毒分離鑒定參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《原種雞群禽白血病凈化檢測(cè)規(guī)程》附錄采集精液。首先以酒精棉球?qū)⑿怪城恢車潦酶蓛粢越档图?xì)胞接種時(shí)的污染概率，然后將精液采集到2 mL無菌離心管中，置于冰盒中存放。在無菌離心管中預(yù)先加入100 μL含有兩性霉素B和青鏈霉素的無菌PBS緩沖液，再加入25 μL采集的精液后充分震蕩混勻，于4℃以3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心3 min后取100 μL上清液接種到已長(zhǎng)成單層DF-1細(xì)胞的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，37℃孵育2 h后棄掉細(xì)胞生長(zhǎng)液，用滅菌PBS洗滌3次后更換為細(xì)胞維持液，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)9 d后收集培養(yǎng)上清，以ALV-p27抗原ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，以確定是否存在外源性ALV感染，p27陽性樣品的上清液保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 分離毒株gp85基因的擴(kuò)增、克隆和測(cè)序?yàn)檫M(jìn)一步鑒定種禽場(chǎng)主要流行毒株的亞群，對(duì)來自于上述4個(gè)雞場(chǎng)種公雞的6份S/P值讀數(shù)較高且接種DF-1細(xì)胞可成功增殖的樣品進(jìn)行了gp85基因擴(kuò)增和克隆測(cè)序。將樣品以Viral RNA Kit(OMEGA，USA)參照說明書提取其總RNA，根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)合成了相應(yīng)引物擴(kuò)增ALV的gp85基因[12]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并將目的條帶切下后以商品化凝膠回收純化試劑盒E.Z.N.A Gel Extraction Kit(OMEGA，USA)參照說明書回收純化DNA，將純化后DNA連接至pMD18-T Vector(TaKaRa，Japan)后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，挑取單菌落以質(zhì)粒提取試劑盒Plasmid Mini Kit(OMEGA，USA)提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定，鑒定為陽性的克隆質(zhì)粒送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.5 序列比對(duì)和遺傳進(jìn)化分析使用DNA Star軟件對(duì)所測(cè)定的gp85序列進(jìn)行分析，將其與GenBank中已發(fā)表的不同亞群ALV的gp85參考序列進(jìn)行比對(duì)，分析分離毒株與不同參考毒株間的同源性并繪制分子遺傳進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 以公雞血漿樣品為標(biāo)準(zhǔn)的分離鑒定結(jié)果按照本研究規(guī)定的血漿樣品病毒分離程序，經(jīng)商品化ALV-p27抗原ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)確定，標(biāo)號(hào)為SY、QA、CM、QSB、QSB+、GX2、QA1、QA3、BW、YB2、GX2-1、ZS的12個(gè)不同地方品系種公雞群的ALV 陽性率分別為0.74% (1/135),3.46%(8/231),1.37%(1/73),3.78%(9/238),8.12%(38/468),5.33%(73/1370),5.45%(9/165),2.13%(1/47),0.00%(0/29),2.50%(1/40),1.72%(3/174),2.50%(5/200)。結(jié)果表明，除標(biāo)號(hào)BW的品系未分離到ALV外，其他11個(gè)黃羽肉雞品系種公雞群中均存在ALV的感染，最高陽性率達(dá)到8.12%，對(duì)經(jīng)血漿樣品病毒分離鑒定為陽性的種公雞淘汰不再作為種用。

2.2 以公雞精液樣品為標(biāo)準(zhǔn)的分離鑒定結(jié)果按照本研究規(guī)定的精液樣品病毒分離程序，經(jīng)商品化ALV-p27抗原ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)確定，標(biāo)號(hào)為SY、QA、CM、QSB、QSB+、GX2、QA1、QA3、BW、YB2、GX2-1、ZS 的12個(gè)不同地方品系種公雞群的ALV 陽性率分別為0.74%(1/135),1.73%(4/231),1.37%(1/73),1.26%(3/238),1.71%(8/468),6.64%(91/1370),4.24%(7/165),0.00%(0/47),0.00%(0/29),0.00%(0/40),5.17%(9/174),1.50%(3/200)。結(jié)果表明，有3個(gè)品系未分離到ALV，特別是標(biāo)號(hào)BW的品系精液病毒分離也未分離到ALV。總體可見，在12個(gè)品系種公雞群中，精液病毒分離陽性率普遍低于血漿病毒分離陽性率，對(duì)所有經(jīng)精液樣品病毒分離結(jié)果鑒定為ALV陽性的種公雞淘汰不再留作種用。

2.3 分別以血漿樣品和精液樣品實(shí)施病毒分離的結(jié)果對(duì)比通過對(duì)12個(gè)不同品系種公雞群進(jìn)行病毒分離結(jié)果的對(duì)比發(fā)現(xiàn)同一雞群內(nèi)精液和血漿病毒分離陽性率并不一致，有的精液病毒分離陽性率高于血漿病毒分離陽性率，如表2所示，編號(hào)GX2的品系共檢測(cè)公雞1 370只，2種樣品均采集1 370份，其中精液病毒分離鑒定為ALV陽性的91份，血漿病毒分離鑒定為ALV陽性的73份，精液病毒分離和血漿病毒分離同時(shí)為陽性的卻僅僅只有9份。多數(shù)血漿病毒分離陽性率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于精液病毒分離陽性率，如表2所示，編號(hào)QA的品系共檢測(cè)公雞231只，2種樣品均采集231份，其中血漿病毒分離鑒定為ALV陽性的8份，精液病毒分離鑒定為ALV陽性的4份，且精液陽性公雞其血漿檢測(cè)也均為陽性；編號(hào)QSB的品系中，經(jīng)血漿病毒分離鑒定為ALV陽性9份，精液病毒分離鑒定為ALV陽性的有3份，兩者同時(shí)為陽性的僅有1份；編號(hào)QSB+的品系中，經(jīng)血漿病毒分離鑒定為ALV陽性多達(dá)38份，精液病毒分離鑒定為ALV陽性的只有8份，兩者同時(shí)為陽性的僅有4份。

表2 12個(gè)黃羽肉雞品系種公雞群ALV分離的檢測(cè)結(jié)果及其對(duì)比 份

2.4 部分分離毒株的gp85序列分析與亞群鑒定因?yàn)闄z測(cè)凍融的損失和部分樣品其S/P值較低，難以形成有效細(xì)胞復(fù)制和PCR擴(kuò)增，本研究最終選取細(xì)胞上清S/P值較高的6株外源性ALV進(jìn)行了gp85基因的擴(kuò)增和克隆測(cè)序。同源性分析結(jié)果顯示，6株ALV分離株之間其gp85核苷酸同源性為91.1%～100.0%，氨基酸同源性為87.5%～100.0%，所有分離株與J亞群ALV參考毒株gp85核苷酸同源性為88.5%～94.5%，而與其他亞群參考毒株gp85核苷酸同源性僅保持在49.6%～52.1% 之間。進(jìn)一步對(duì)所有毒株的gp85基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析顯示所有分離株與J亞群參考毒株處于進(jìn)化樹的同一分支上(圖1)，表明6株ALV均屬于J亞群。

圖1 分離株與不同亞群參考株ALV gp85核苷酸序列遺傳進(jìn)化樹

3 討論

我國(guó)家禽飼養(yǎng)量約占世界存欄量的1/3，長(zhǎng)期居世界首位。目前，我國(guó)每年飼養(yǎng)白羽肉雞和黃羽肉雞均在45億只左右，已成為我國(guó)居民肉食品供應(yīng)的主要來源之一。白羽肉雞的種源主要來源于國(guó)外進(jìn)口，而黃羽肉雞是我國(guó)自繁自養(yǎng)的特色品系。禽病一直是導(dǎo)致我國(guó)家禽生產(chǎn)性能不高和淘汰死亡的主要原因，在諸多禽病中，ALV、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒和雞傳染性貧血病毒等病毒可按照“曾祖代—祖代—父母代—商品代”這一金字塔式擴(kuò)繁鏈條在垂直傳播過程中逐代放大，此類疾病在嚴(yán)重威脅種雞健康的同時(shí)還給商品雞群造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。發(fā)達(dá)國(guó)家經(jīng)過了長(zhǎng)達(dá)數(shù)十年的努力成功凈化了AL，而同時(shí)期我國(guó)黃羽肉雞一直未開展規(guī)?；到y(tǒng)性AL凈化導(dǎo)致ALV感染帶毒率越來越高。

我國(guó)最初開展AL凈化基本借鑒和參照了發(fā)達(dá)國(guó)家的凈化程序，重點(diǎn)關(guān)注了母雞的淘汰，如對(duì)母雞的初產(chǎn)蛋采集蛋清檢測(cè)其p27抗原并淘汰陽性母雞是生產(chǎn)中應(yīng)用最多的方法。在證實(shí)了公雞及其精液在ALV傳播中的重要作用后，很多種禽企業(yè)開始重視對(duì)種公雞的凈化。但是對(duì)于公雞，除了病毒分離外尚無更科學(xué)更可靠的檢測(cè)途徑。在對(duì)不同的雞群實(shí)施凈化的過程中，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)一些母雞經(jīng)血漿病毒分離已經(jīng)無法檢測(cè)到ALV，公雞通過血漿病毒分離也檢測(cè)不到ALV時(shí)，這些母雞經(jīng)人工授精后又變成了ALV陽性，這促使我們懷疑公雞在某個(gè)特定感染時(shí)期僅在精液中存在ALV而血液中檢測(cè)不到ALV。

作為我國(guó)重要的黃羽肉雞種源基地，了解廣西地區(qū)種公雞中ALV的帶毒狀況對(duì)于加速特定雞群的凈化具有重要的意義。為此，本研究同時(shí)采取血漿病毒分離和精液病毒分離兩種方式對(duì)12個(gè)黃羽肉雞品系開展了ALV的調(diào)查。通過大量的樣品檢測(cè)顯示，12個(gè)黃羽肉雞品系種公雞群中僅有1個(gè)品系從血漿和精液中均未分離到任何ALV外，其他11個(gè)品系均存在一定程度的ALV流行，未分離到ALV的公雞是否因其群體過小導(dǎo)致病毒分離概率較低尚不可知，但總體上多個(gè)品系都存在ALV感染的現(xiàn)狀提醒我們要高度關(guān)注種公雞中ALV的感染和帶毒。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)對(duì)某一確定雞個(gè)體而言，血液和精液兩種樣品病毒分離的結(jié)果存在不一致的情況，即在同一只公雞存在精液和血液中ALV帶毒狀態(tài)的不一致性，這為我們實(shí)施ALV凈化過程中對(duì)陽性公雞的淘汰帶來了挑戰(zhàn)。以往針對(duì)ALV凈化時(shí)僅僅采集公雞血液開展病毒分離并實(shí)施淘汰，從現(xiàn)有結(jié)果看，這可能漏掉某些病毒血癥消失但精液中仍舊存在ALV的公雞，這些公雞通過人工授精后進(jìn)一步傳給母雞及其后代。這可以解釋為什么某些雞群在分別對(duì)公雞和母雞的血漿做病毒分離為陰性前提下再次進(jìn)行人工授精后其雛雞仍出現(xiàn)了一定比例的ALV陽性。

針對(duì)上述發(fā)現(xiàn)的血液和精液中ALV感染狀態(tài)的不對(duì)應(yīng)性，我們推測(cè)，ALV感染公雞形成病毒血癥后，在特定的時(shí)期為了躲避機(jī)體免疫系統(tǒng)等壓力，某些ALV進(jìn)入到了免疫細(xì)胞較少的精囊中，而血液中卻檢測(cè)不到ALV。類似的現(xiàn)象已經(jīng)在與ALV高度相似的人類逆轉(zhuǎn)錄病毒人免疫缺陷病毒(HIV)中被廣泛報(bào)道和關(guān)注，大量研究表明“狡猾”的HIV會(huì)隱藏在某些藥物或免疫系統(tǒng)不易達(dá)到的器官或組織中進(jìn)行逃逸。最熟知的就是HIV可在人睪丸中隱藏起來，大量臨床實(shí)踐表明，即使在大量使用藥物后病人血液中HIV為陰性前提下在其精液中仍可檢測(cè)到HIV[13-14]。HIV利用了動(dòng)物機(jī)體的關(guān)鍵保護(hù)機(jī)制——免疫豁免，即某些特定部位如眼睛，就是免疫豁免區(qū)之一，是為了避免炎癥對(duì)眼睛和視力的損害。產(chǎn)生精子的睪丸也是重要的免疫豁免區(qū)，是病原微生物天然的避難所，病原微生物會(huì)隨著精液躲藏在睪丸中，以躲避機(jī)體免疫系統(tǒng)和藥物的攻擊。作為研究逆轉(zhuǎn)錄病毒的重要病毒模型，本研究在生產(chǎn)中觀察到的現(xiàn)象無疑為解釋上述科學(xué)設(shè)想提供了一種佐證。

本研究通過大量樣品調(diào)查顯示在多個(gè)黃羽肉雞種公雞中存在ALV的感染并在此過程中進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)公雞血液和精液中ALV感染狀態(tài)具有不吻合性，這提示我們要重視對(duì)種公雞的凈化，并且在實(shí)施公雞凈化時(shí)單純依靠血漿病毒分離結(jié)果或者單純依靠精液病毒分離結(jié)果淘汰感染公雞都是不全面的，對(duì)公雞血漿和精液同時(shí)實(shí)施檢測(cè)和淘汰有助于加速ALV的凈化進(jìn)程。