脫苦荷葉茶發(fā)酵菌種篩選及工藝優(yōu)化

林 媛，邱松林

(1.福建生物工程職業(yè)技術(shù)學院， 福建 福州 350007;2.廈門海洋職業(yè)技術(shù)學院， 福建 廈門 361012)

荷葉為睡蓮科蓮屬植物蓮NelumbonuciferaGaertn的葉片，其味苦、性平，具有減肥、抗氧化、抗腫瘤、清熱解暑等功效[1]。國內(nèi)外研究表明，荷葉中含有多種功效成分，包括黃酮、生物堿、有機酸以及揮發(fā)油[2-4]等，在我國衛(wèi)生部監(jiān)發(fā)的(2002)第51號文件中，荷葉被列入“既是食品又是藥品”的名單中，其在食藥兩方面均廣泛的應用前景。但因荷葉中含有槲皮素[5]和單寧[4]等苦澀味物質(zhì)，目前荷葉飲料常用β-環(huán)狀糊精、蜂蜜和白砂糖等[6-8]作為苦澀味的掩蓋劑，其效果并不令人滿意，因此市面上少有荷葉飲料類產(chǎn)品。

食用菌發(fā)酵茶是將食(藥)用真菌接種至茶葉或其他食(藥)用植物制成的培養(yǎng)基上，在發(fā)酵過程中，通過優(yōu)化培養(yǎng)基配比，可以獲得具有較高保健價值的新型食用菌發(fā)酵茶，通過發(fā)酵過程的代謝作用使茶葉或葉片發(fā)生深度的良性生理生化變化，從而改善茶葉的口感和品質(zhì)[9]。靈芝Ganodermalucidum又名靈芝草、丹芝、仙草等，它含有活性肽、多糖、堿基、核酸以及人體所必需的多種微量元素、酶和生物堿等生物活性物質(zhì)[10-11]；現(xiàn)代醫(yī)學研究證明，靈芝具有提高人體免疫力、輔助調(diào)節(jié)血壓血脂、強化造血功能、防癌抗癌、鎮(zhèn)痛和延緩細胞衰老等功能[12-14]。猴頭菇Hericiumerinaceus是齒菌科、猴頭菇屬真菌[15]，國外研究發(fā)現(xiàn)，猴頭菇含有多種人體必需的營養(yǎng)元素、豐富的多酚和黃酮類物質(zhì)[16-17]，具有清除自由基[18]、消炎[19]、抗菌[20-21]和殺死癌細胞[13]等作用，可用于治療消化不良、胃炎、胃潰瘍等消化系統(tǒng)疾病。金針菇Flammulinavelutipes又名金菇、智力菇等，含有豐富的多糖、蛋白質(zhì)及多種微量元素，營養(yǎng)價值高[22]，現(xiàn)代醫(yī)學研究表明，金針菇多糖是其主要的功能物質(zhì)，具有保肝、護肝、抗腫瘤和改善記憶力等功能活性[23-24]。夏麗飛等[25]研究發(fā)現(xiàn)，粗老曬青茶經(jīng)白參菌發(fā)酵后，色澤、香氣和滋味等品質(zhì)均明顯提高；楊茜茜[26]從9株靈芝菌種中篩選最適宜雪梨發(fā)酵菌種，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鹿角靈芝能顯著提高雪梨汁的品質(zhì)，是雪梨汁發(fā)酵的最適菌種；楊金鳳等[27]以秀珍菇、香菇、雪玉松茸和靈芝4種食用菌作為酸棗葉茶的發(fā)酵菌種，研究結(jié)果表明發(fā)酵能夠有效地改善茶的組分, 改變茶的口感，其中靈芝為酸棗葉發(fā)酵茶的最佳菌種。本試驗選用靈芝、猴頭菇和金針菇作為荷葉茶發(fā)酵的菌種，通過對比菌絲生長速度，以及發(fā)酵后苦澀味物質(zhì)槲皮素含量和單寧含量的變化，選出最適于脫苦荷葉茶發(fā)酵的菌種，為荷葉發(fā)酵茶的深加工提供方法和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

靈芝、猴頭菇和金針菇菌種(福建農(nóng)林大學菌草研究所)；荷葉(福建建蓮生物科技有限公司)；槲皮素、單寧標準品(酷爾化學科技北京有限公司)；甲醇、Folin-Denis顯色劑、Na2CO3溶液(分析純、市售)等。

1.2 主要儀器與設備

Essentia LC-16高效液相色譜儀(島津儀器蘇州有限公司)、752型紫外分光光度計(上海奧普勒儀器有限公司)、DW-86L58超低溫冰箱(浙江和利超低溫技術(shù)有限公司)、SJIA-5FE真空冷凍干燥箱(寧波市雙嘉儀器有限公司)、SP150生化培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設備有限公司)、FS-UC2030GL超聲萃取器(杭州泛索能超聲科技有限公司)等。

1.3 試驗方法

1.3.1工藝流程 荷葉茶制作工藝流程見圖1。

圖1 荷葉茶制工藝流程

1.3.2菌種的活化與培養(yǎng) 分別取靈芝、猴頭菇和金針菇3種菌種母種0.5 cm2接種到PDA斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為(28±1)℃，時間為8～10 d，菌絲長滿培養(yǎng)基即完成活化培養(yǎng)；將活化斜面菌種用10 mL無菌水沖洗，再接種至150 mL液體培養(yǎng)基中，在28℃恒溫旋轉(zhuǎn)式搖床中培養(yǎng)，振蕩頻率為150 r·min-1，待菌絲長滿培養(yǎng)基時停止培養(yǎng), 得到液體菌種。

1.3.3荷葉茶的預處理 參照陳秋香等[28]的方法，將新鮮荷葉經(jīng)切碎、殺青、碾磨和干燥等工序制成荷葉茶；將干燥荷葉茶和蒸餾水按2∶1的比例充分混合，靜置30 min，待荷葉茶充分吸水后，稱取60 g裝入寬口瓶中，用高壓蒸汽滅菌后冷卻備用。

1.3.4發(fā)酵菌種的篩選 取靈芝、猴頭菌和金針菇發(fā)酵液各10 mL分別接入預處理的荷葉茶中，每個菌種做3個重復組，在溫度為(28±1)℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天同一時間測量菌絲生長的長度，數(shù)值精確到0.01 cm，待菌絲長滿寬口瓶后，參照劉雅頎等[29]的方法測量單寧和槲皮素的含量，通過對比菌絲的生長速度和荷葉茶中苦澀味代表物質(zhì)(單寧和槲皮素)含量的下降程度，來篩選荷葉發(fā)酵茶的最適發(fā)酵菌種。

1.3.5荷葉茶發(fā)酵工藝優(yōu)化 荷葉發(fā)酵茶添加了發(fā)酵菌種后，不同發(fā)酵工藝對其品質(zhì)產(chǎn)生較大的影響，本試驗通過設置不同添加量、發(fā)酵時間和溫度來發(fā)酵菌種，并通過正交試驗得出荷葉發(fā)酵茶的最佳發(fā)酵工藝。荷葉發(fā)酵茶的因素與水平表見表1。

表1 荷葉茶發(fā)酵工藝因素與水平

1.3.6荷葉茶感官差別評價 將制好的荷葉發(fā)酵茶與市售的荷葉茶通過差別試驗方法中的選擇試驗法進行感官檢驗，從3個或3個以上的產(chǎn)品當中選擇最喜歡或最不喜歡的樣品，經(jīng)過試驗、計算、統(tǒng)計分析得出樣品之間是否有差別。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌種對荷葉茶發(fā)酵的影響

2.1.1不同菌種對荷葉茶發(fā)酵速度的影響 由圖2可知，靈芝菌絲在荷葉茶中的生長速度最快，顯著優(yōu)于其他菌種菌絲的生長速度。 其中第5 d時，靈芝菌絲長度比剛接種時增加了8.03 cm，猴頭菇菌絲增加了3.12 cm，金針菇菌絲此時未見增長；靈芝菌絲增長速度與其他兩種菌絲達到極顯著差異(P<0.01)。在第8 d時，靈芝菌絲已長滿寬口瓶；猴頭菇和金針菇菌絲在11 d時，長滿寬口瓶。

圖2 不同菌種菌絲生長情況

2.1.2不同菌種對荷葉茶中槲皮素和單寧含量的影響 由圖3可知，荷葉茶槲皮素和單寧的初始含量分別為4.90‰和為7.43%，經(jīng)過3種菌種的發(fā)酵，其槲皮素的含量均有降低，單寧的含量均顯著降低；說明經(jīng)過發(fā)酵，菌種在生長過程中，消耗了部分槲皮素，同時降解了單寧，從而使荷葉發(fā)酵茶脫苦除澀的效果較為明顯。其中，經(jīng)過靈芝發(fā)酵的荷葉茶，其槲皮素和單寧的含量分別降低了18.37%(P<0.05)和79.54%(P<0.01)，說明靈芝菌絲對荷葉發(fā)酵茶的脫苦除澀效果最為明顯。綜合3種菌絲在荷葉茶中的生長速度，確認靈芝為荷葉茶的最適合發(fā)酵菌種。

圖3 不同菌種對荷葉茶中槲皮素和單寧含量的影響

2.2 荷葉茶發(fā)酵工藝的優(yōu)化

由表2可知，在發(fā)酵過程中，接種量和發(fā)酵時間對荷葉茶槲皮素和單寧的含量都有較大的影響；而發(fā)酵溫度在一定范圍之內(nèi)，對槲皮素和單寧含量的影響均較小。其中，接種量對槲皮素和單寧含量的影響最大，這說明菌絲生長過程中分解了這兩種苦澀味物質(zhì)；當接種量達到15.0 mL時，發(fā)酵荷葉茶中槲皮素和單寧含量最低。當發(fā)酵時間為8 d時，槲皮素和單寧含量達到最低值。發(fā)酵溫度為(28±1)℃時，槲皮素含量最低，發(fā)酵溫度為(26±1)℃和(28±1)℃時，單寧含量均為最低，兩者間無顯著差異(P>0.05)。因此，靈芝發(fā)酵荷葉茶的最佳工藝為接種量15.0 mL、發(fā)酵時間為8 d、發(fā)酵溫度為(28±1)℃。

表2 荷葉茶發(fā)酵工藝正交試驗分析

2.3 荷葉茶的差別試驗

將制得荷葉發(fā)酵茶A與市售的其他兩種荷葉茶X和Y通過差別試驗方法中的選擇試驗法進行比較[30]。邀請50位感官品鑒員對3種產(chǎn)品進行感官鑒別，每位感官品鑒員選出1個自己認為最好的荷葉茶，經(jīng)過數(shù)學統(tǒng)計分析后，從而判定本試驗的荷葉發(fā)酵茶的感官效果。

評價結(jié)果為：認為本試驗發(fā)酵茶產(chǎn)品A感官最好的人數(shù)為31人，認為市售荷葉茶X感官最好的人數(shù)為11人，認為市售荷葉茶Y感官最好的人數(shù)為8人，合計50份試驗結(jié)果。

判斷3種荷葉茶有無顯著性差別，采用選擇試驗法進行差別試驗后進行數(shù)學統(tǒng)計分析，用公式求其計算值：

其中：m為樣品種數(shù)，n為有效評價數(shù)，xi為品鑒中最喜歡某個樣品的人數(shù)。

本試驗中n=50,m=3,x1=31,x2=11,x3=8將其代入公式可得：

自由度f=m-1=2，α=1%

查x2分布表[30]知：x2(3,1%)=11.34

從統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)可以得出，本試驗結(jié)論為當α=1%，3種商品存在顯著性差異。即當α=1%，用本試驗方法制作的發(fā)酵荷葉茶與市售的荷葉茶有顯著性差別，且喜歡本試驗產(chǎn)品的人數(shù)最多。

3 討論與結(jié)論

采用靈芝、猴頭菇和金針菇3種菌種對荷葉茶進行脫苦除澀發(fā)酵，經(jīng)對比發(fā)現(xiàn)，靈芝菌絲在荷葉茶中的生長速度最快(P<0.05)，苦澀物質(zhì)槲皮素和單寧含量下降最為顯著(P<0.05)，因此，選擇靈芝菌絲作為荷葉茶發(fā)酵的最佳菌絲。設置不同菌絲添加量、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度來進行荷葉茶發(fā)酵工藝正交試驗，結(jié)果表明，隨著發(fā)酵時間的延長，接種量的增大，槲皮素的含量也逐漸降低；其可能原因是在菌絲接種后，隨著發(fā)酵的進行，一方面靈芝菌絲生長過程中不斷消耗槲皮素這類黃酮類物質(zhì)，另一方面，槲皮素含有酚羥基，也會自行氧化使含量降低，這與楊金鳳[27]等的研究結(jié)果一致；同時，隨著發(fā)酵的進行，單寧含量也明顯下降，其原因可能有3個：第一，被菌絲作為底物部分分解；第二，單寧屬于酚類化合物，酚類易與糖產(chǎn)生化學反應，使其含量進一步降低；第三，單寧氧化產(chǎn)生多種分解產(chǎn)物，這與紅葡萄酒中單寧分解產(chǎn)物一樣，可以豐富荷葉茶的口感和層次。將制得的荷葉發(fā)酵茶與市售兩種荷葉茶采用選擇法進行差別試驗，結(jié)果表明，制得的荷葉發(fā)酵茶在口感上顯著優(yōu)于市售荷葉茶(α=1%)。因此確定荷葉發(fā)酵茶的最佳工藝為靈芝菌絲接種量15.0 mL，發(fā)酵時間8 d，發(fā)酵溫度(28±1)℃。