甘草飲片、水煎液、配方顆粒的UPLC指紋圖譜相關(guān)性研究

鐘文峰，張?zhí)m蘭，胡懿，施文婷，黎桃敏，彭杰寶，梁志毅（廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點實驗室，廣東 佛山 528244）

甘草在我國有“十方九草”之說，被稱為中草藥的國老[1]，為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.、脹果甘草Glycyrrhiza inflataBat.或光果甘草Glycyrrhiza glabraL.的干燥根和根莖。其性平，味甘，歸心、肺、脾、胃經(jīng)，具有補脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥的功效[2]?，F(xiàn)代研究表明，甘草主要含有三萜類、黃酮類、多糖類、香豆素類、二苯乙烯類等化學(xué)成分，具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫、肝臟保護、抗纖維化等多種藥理活性[3-7]。

甘草配方顆粒是由甘草飲片經(jīng)水提、濃縮、干燥、制粒等現(xiàn)代制劑技術(shù)制成的一種顆粒劑，具有易于攜帶、免煎易服、療效確切等優(yōu)點。甘草在各類復(fù)方配伍中較為常見，目前關(guān)于甘草化學(xué)成分和藥理作用的研究報道較多[3-8]，尚無甘草飲片與其相關(guān)制劑質(zhì)量相關(guān)性研究的報道。本研究采用UPLC 法分別建立甘草飲片、水煎液、配方顆粒的指紋圖譜，并比較三者UPLC 指紋圖譜之間的相關(guān)性和差異性，探討甘草配方顆粒制備過程中有效成分的量值傳遞情況，以期為其生產(chǎn)過程的質(zhì)量控制和臨床安全有效用藥提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1290 型超高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；XP26 型百萬分之一天平、ME204E 型萬分之一天平（瑞士METTLER TOLEDO 公司）；Milli-Q Direct 型超純水系統(tǒng)（德國Merck 公司）；SODA-12 型噴霧干燥儀（上海大川原干燥設(shè)備有限公司）；LGS20 型干法制粒機（南京迦南科技有限公司）；YRE-501 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；DLSB-5/20 型低溫冷卻液循環(huán)水泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

甘草苷（批號：111610-201908，純度：95.0%）、甘草酸銨（批號：110731-202021，純度：96.2%）（中國食品藥品檢定研究院），甘草素（批號：wkq18030505）、異甘草苷（批號：wkq18042008）、芹糖甘草苷（批號：wkq19021306）（純度≥98%，四川省維克奇生物科技有限公司）；乙腈、甲醇為色譜純（德國Merck 公司），磷酸為色譜純（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），水為超純水，其余試劑均為分析純。甘草藥材（編號S1 ～S15）經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師鑒定為正品，均為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根和根莖，其中S1 ～S8 來源于甘肅，S9 ～S15 來源于內(nèi)蒙古。甘草飲片（Y1 ～Y15）由15 批甘草藥材按照2020年版《中國藥典》一部甘草項下飲片炮制規(guī)定炮制[2]；甘草水煎液（T1 ～T15）由15 批甘草飲片按照《醫(yī)療機構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》的相關(guān)煎煮要求制備；甘草配方顆粒（P1 ～P15）由水煎液經(jīng)濃縮、干燥、制粒等步驟制得。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[9]

色譜柱：Acclaim RSLC 120 C18柱（100 mm×2.1 mm，2.2 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）梯度洗脫（0 ～1 min，5%～27%A；1 ～2 min，27%A；2 ～10 min，27% ～46%A；10 ～16 min，46% ～64%A；16 ～24 min，64% ～95%A；24 ～25 min，95%A）；柱溫：30℃；流速：0.3 mL·min－1；進樣體積：1 μL；檢測波長：237 nm。

2.2 混合對照品溶液的制備

取甘草苷、異甘草苷、芹糖甘草苷、甘草素、甘草酸銨對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 分別含81.700、76.930、76.930、107.310、136.191 μg 的混合對照品溶液（甘草酸重量＝甘草酸銨重量/1.0207）。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 甘草飲片供試品溶液 取甘草飲片粉末（過三號篩）約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，密塞，稱重，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，取出，放冷，再稱重，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.2 甘草水煎液供試品溶液 精密吸取混合均勻的甘草水煎液3 mL，置25 mL 量瓶中，加70%乙醇適量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，取出，放冷，用70%乙醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 甘草配方顆粒供試品溶液 取甘草配方顆粒，研細，取約0.1 g，精密稱定，照“2.3.1”項下方法制備，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性試驗 分別精密吸取空白溶劑、混合對照品溶液及供試品溶液，進樣測定，結(jié)果如圖1 所示，供試品溶液色譜在與對照品溶液色譜相應(yīng)的保留時間處具有相同的色譜峰，且空白溶劑無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 專屬性試驗UPLC 色譜圖Fig 1 UPLC chromatogram of specific test

2.4.2 精密度試驗 精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液，連續(xù)進樣6 次，計算得各成分峰面積的RSD均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取甘草飲片（編號Y1），精密稱定，按“2.3.1”項下方法制備供試品溶液，分別于制備0、4、8、12、24 h 后進樣測定，以3 號峰、6 號峰、10 號峰為參照峰，計算得各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗 取甘草飲片（編號Y1）6 份，精密稱定，按“2.3.1”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，以3 號峰、6 號峰、10 號峰為參照峰，計算得各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5 UPLC 指紋圖譜的建立與相似度評價

2.5.1 指紋圖譜的建立 分別取15 批甘草飲片、水煎液和配方顆粒樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，記錄色譜圖。采用國家藥典委員會頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012 版”對色譜圖進行匹配，形成共有模式圖，并分別建立對照指紋圖譜R1、R2、R3，見圖2 ～4。經(jīng)過比較分析后確定甘草飲片、水煎液、配方顆粒的UPLC 指紋圖譜基本一致，均有12 個共有峰。通過與對照品圖譜對比，確定2號峰為芹糖甘草苷，3 號峰為甘草苷，5 號峰為異甘草苷，6 號峰為甘草素，10 號峰為甘草酸。

圖2 15 批甘草飲片的UPLC 指紋圖譜堆疊圖Fig 2 UPLC fingerprints of 15 batches of licorice pieces

圖3 15 批甘草水煎液的UPLC 指紋圖譜堆疊圖Fig 3 UPLC fingerprints of 15 batches of licorice decoction

圖4 15 批甘草配方顆粒的UPLC 指紋圖譜堆疊圖Fig 4 UPLC fingerprints of 15 batches of licorice formula granules

2.5.2 相似度評價 將15 批甘草飲片、水煎液、配方顆粒UPLC 指紋圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012 版”軟件，計算各批次甘草飲片、水煎液、配方顆粒UPLC 指紋圖譜與其對照指紋圖譜的相似度，結(jié)果見表1。15 批甘草飲片、水煎液、配方顆粒UPLC 指紋圖譜與其相應(yīng)對照指紋圖譜（R1、R2、R3）的相似度均大于0.900，表明不同批次甘草飲片、水煎液、配方顆粒的主要化學(xué)成分組成基本一致，質(zhì)量較為穩(wěn)定。

表1 甘草飲片、水煎液和配方顆粒UPLC 指紋圖譜的相似度評價Tab 1 Similarity of licorice pieces，decoction and formula granules

2.5.3 對照指紋圖譜的比較 將15 批甘草飲片、水煎液和配方顆粒指紋圖譜生成的對照指紋圖譜R1、R2、R3 導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012 版”軟件，結(jié)果見表2、圖5。與甘草飲片相比，水煎液和配方顆粒的相似度分別為0.994 和0.993，水煎液和配方顆粒指紋圖譜相似度為1.000，表明甘草飲片、水煎液與配方顆粒成分基本一致，指紋圖譜相關(guān)性良好，在提取、濃縮、干燥、制粒過程中，其主要成分無明顯變化。

圖5 甘草飲片對照指紋圖譜（R1）、水煎液對照指紋圖譜（R2）和配方顆粒對照指紋圖譜（R3）Fig 5 Reference fingerprints of licorice pieces，decoction and formula granules by UPLC

表2 甘草飲片、水煎液、配方顆粒對照指紋圖譜的相似度評價Tab 2 Similarity of reference fingerprints of licorice pieces，decoction，formula granules

2.6 化學(xué)模式識別分析

2.6.1 共有峰相關(guān)性分析 采用SPSS 26.0 軟件，以15 批甘草飲片、水煎液和配方顆粒共45 個樣品各特征峰的“峰面積占比”值（各特征峰峰面積占特征峰總面積的比例）為變量進行皮爾遜相關(guān)性分析，結(jié)果見表3。甘草飲片、水煎液、配方顆粒12 個共有峰均具有極顯著的正相關(guān)性。

表3 甘草飲片、水煎液、配方顆粒指紋圖譜共有峰的相關(guān)性分析Tab 3 Correlation analysis of common peaks in fingerprints of licorice pieces，decoction and formula granules

2.6.2 熱圖聚類分析[10]以12 個共有峰的峰面積為變量，采用對數(shù)歸一化法，以Euclidean平方距離為度量標準，利用HemI 1.0 軟件對15 批甘草飲片、水煎液和配方顆粒UPLC 指紋圖譜進行熱圖和聚類分析，結(jié)果見圖6。熱圖聚類分析結(jié)果顯示，甘草飲片、水煎液和配方顆粒中化學(xué)成分組成一致，45 批樣品可聚為3類。Y1 ～Y3、Y5、T1、T3 ～T5、T9、P1、P2、P4、P5、P9 聚為一類，Y4、Y6 ～Y15、T2、T6 ～T8、T10 ～T15、P3、P6 ～P8、P10 ～P15 聚為一類，P3 單獨聚為一類。表明飲片、水煎液、配方顆粒三者之間無顯著性差異，且水煎液與配方顆粒的內(nèi)在成分含量更為接近。

圖6 甘草飲片、水煎液和配方顆粒UPLC 指紋圖譜熱圖聚類分析圖Fig 6 Heat map cluster analysis of UPLC fingerprint of licorice pieces，decoction and formula granules

2.6.3 主成分分析 采用SPSS 26.0 軟件，對15批甘草飲片、水煎液和配方顆粒共45 個樣品各特征峰峰面積的標準化值進行主成分分析，主成分結(jié)果以特征值＞1 為標準提取得到3 個主成分[11]，計算得特征值和方差貢獻率見表4，主成分因子載荷矩陣見表5。由結(jié)果可知，前3 個主成分累積貢獻率為82.807%，表明提取的3 個主成分能反映甘草指紋圖譜的大部分信息。主成分1 的特征值為6.205，方差貢獻率為51.705%，載荷較高的峰有峰1、芹糖甘草苷、甘草苷、異甘草苷、甘草素、峰7、峰8、峰9、甘草酸，表明這9 個峰主要反映主成分1 的信息；主成分2 的特征值為2.608，方差貢獻率為21.733%，載荷較高的峰有峰11，表明這個峰主要反映主成分2 的信息；成分3 的特征值為1.124，方差貢獻率為9.369%，載荷較高的峰有峰4、峰12，表明這2 個峰主要反映主成分3 的信息。由圖7 可知，甘草飲片與其他樣品距離較遠，表明甘草飲片水提液中的化學(xué)成分與飲片中的化學(xué)成分存在一定差異，這可能與溶劑極性有關(guān)；水煎液與配方顆粒樣品相互交錯，距離較小，表明甘草水煎液與配方顆粒之間差異較小[12]。

圖7 甘草飲片、水煎液和配方顆粒UPLC 指紋圖譜主成分得分圖Fig 7 PCA score plot of principal component analysis of UPLC fingerprint of licorice pieces，decoction and formula granules

表4 UPLC 指紋圖譜主成分分析特征值及方差貢獻率Tab 4 Eigenvalues and variance contribution rate of principal component analysis of UPLC fingerprint

表5 UPLC 指紋圖譜主成分因子載荷矩陣Tab 5 Principal component factor loading matrix of UPLC fingerprint

2.6.4 正交偏最小二乘判別分析[13]采用SIMCA 14.1 軟件，以15 批甘草飲片、水煎液和配方顆粒共45 個樣品各特征峰單位峰面積（峰面積與取樣量的比值）為變量進行正交偏最小二乘判別分析，結(jié)果見圖8 ～9。由模型參數(shù)可知，數(shù)據(jù)矩陣的解釋率參數(shù)R2X（cum）＝0.953，模型區(qū)分參數(shù)R2Y（cum）＝0.714，模型預(yù)測參數(shù)Q2＝0.609，均＞0.500，表明該數(shù)學(xué)模型穩(wěn)定可靠[14]。45 個樣品可分成3 類，以VIP 值＞1 為提取標準，得到甘草苷、芹糖甘草苷和峰12 是影響分類的主要標志性成分。

圖8 甘草飲片、水煎液和配方顆粒UPLC 指紋圖譜OPLS-DA 得分圖Fig 8 OPLS-DA score plot of UPLC fingerprint of licorice pieces，decoction and formula granules

3 討論

中藥配方顆粒是基于中藥現(xiàn)代化、國際化形勢下對傳統(tǒng)中藥飲片的一種補充[15]。首批160 個中藥配方顆粒國家標準經(jīng)國家藥品監(jiān)督管理局頒布，已于2021年11月1日正式實施，中藥配方顆粒國家標準的落地執(zhí)行將有助于實現(xiàn)安全性、有效性等多方面的整體質(zhì)量控制。目前關(guān)于中藥配方顆粒與其飲片、水煎液的對比研究，大多以單一成分的量值傳遞進行評價，無法全面反映其整體的質(zhì)量傳遞情況。中藥指紋圖譜技術(shù)是國際公認的中藥以及天然藥物質(zhì)量控制最為有效的手段，是評價中藥優(yōu)劣、真?zhèn)舞b別、質(zhì)量控制和譜效關(guān)系研究的有效方法。目前應(yīng)用指紋圖譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法評價中藥及其相關(guān)制劑質(zhì)量已成為行業(yè)研究熱點。

國家藥品監(jiān)督管理局頒布的甘草配方顆粒國家標準選用的藥材基原為甘草，因此，僅對基原為甘草的甘草飲片、水煎液、配方顆粒指紋圖譜相關(guān)性進行研究。研究結(jié)果表明，甘草飲片、水煎液、配方顆粒的HPLC 指紋圖譜均有12 個共有峰，其對照指紋圖譜間的相似度均大于0.99，且各共有峰均成顯著正相關(guān)，說明三者的化學(xué)組成基本一致。主成分分析和聚類分析均表明水煎液與配方顆粒的質(zhì)量更為相近，OPLS-DA 篩選出3 個導(dǎo)致三者質(zhì)量差異的標志性成分，其中峰12 未被指認，后期可采用高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對其進行分析?？傮w來說，甘草配方顆粒在其生產(chǎn)過程中，其主要成分并未發(fā)生明顯變化，飲片、水煎液、配方顆粒三者間的質(zhì)量基本一致。在配方顆粒國家標準研究中會對成品的穩(wěn)定性進行考察，且飲片在適宜條件下保存的質(zhì)量也較穩(wěn)定，故猜測飲片和配方顆粒放置一段時間后，甘草飲片、水煎液、配方顆粒的質(zhì)量基本不會發(fā)生變化，但還需后續(xù)進行實驗驗證。將指紋圖譜技術(shù)應(yīng)用于中藥配方顆粒的生產(chǎn)過程監(jiān)控，克服了單一成分信息量不全的缺點，能較全面地反映甘草飲片、水煎液和配方顆粒間的化學(xué)成分傳遞情況及其相關(guān)性和差異性，可為甘草配方顆粒的質(zhì)量控制及臨床使用提供參考。

圖9 甘草飲片、水煎液和配方顆粒UPLC 指紋圖譜VIP 值Fig 9 VIP of UPLC fingerprint of licorice pieces，decoction and formula granules