基于雙波長指紋圖譜和含量測定的經(jīng)典名方百合地黃湯物質(zhì)基準(zhǔn)的質(zhì)量評價(jià)研究

狄志彪，劉洋，劉峰，許剛，劉琪琪，姜盛楠，王春柳，李曄*，張紅*（.陜西省中醫(yī)藥研究院，西安 7000；.陜西步長制藥有限公司，西安 70075；.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 7000）

百合地黃湯來源于東漢張仲景所著的《金匱要略》，由“百合七枚（擘），生地黃汁一升組成”[1]，原書中該方主要治療百合病，原書言“百合病未經(jīng)吐、下、發(fā)汗誤治，病程雖長，而病情仍如初期，具備首條癥狀，病機(jī)為心肺陰虛內(nèi)熱者，主用百合地黃湯，潤養(yǎng)心肺、涼血清熱、兼能滋腎”?，F(xiàn)代研究表明百合地黃湯具有良好抗抑郁、抗焦慮、調(diào)節(jié)亞健康狀態(tài)、改善睡眠癥狀等作用[2-6]。

隨著中醫(yī)藥行業(yè)的發(fā)展，國家中醫(yī)藥管理局發(fā)布了《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》[7]，百合地黃湯被收錄于此。經(jīng)典名方的研究主要包括物質(zhì)基準(zhǔn)的研究和制劑方面的研究，而物質(zhì)基準(zhǔn)的研究規(guī)定[8]除成型工藝外，其他制備方法應(yīng)當(dāng)與古代醫(yī)籍記載基本一致，因此，如何建立完善的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和制備工藝是亟待解決的關(guān)鍵問題。目前，對百合地黃湯的研究大多數(shù)集中在藥理方面和臨床應(yīng)用方面，其中對治療失眠、抗抑郁臨床療效及作用機(jī)制等方面的研究較多[9-11]。但有關(guān)百合地黃湯質(zhì)量控制的研究較少，周菲等[12]雖研究了百合地黃湯物質(zhì)基準(zhǔn)，但其未嚴(yán)格按照古籍所記載進(jìn)行研究。本研究遵循《金匱要略》《國家藥監(jiān)局綜合司公開征求古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑及其物質(zhì)基準(zhǔn)申報(bào)資料要求（征求意見稿）意見》中有關(guān)物質(zhì)基準(zhǔn)的規(guī)定[13]以及相關(guān)文獻(xiàn)資料[14-18]，最終確定處方組成以及煎煮工藝對百合地黃湯物質(zhì)基準(zhǔn)進(jìn)行研究，并選用HPLC-DAD色譜儀建立了百合地黃湯物質(zhì)基準(zhǔn)的雙波長指紋圖譜，同時(shí)對其中3 種化學(xué)成分進(jìn)行了含量測定，旨在為經(jīng)典名方百合地黃湯物質(zhì)基準(zhǔn)及其制劑開發(fā)的質(zhì)量評價(jià)體系提供依據(jù)。

1 材料

1.1 試藥

對照品：梓醇（純度：99.6%，中國食品藥品檢定研究院，批號：110808-201711）；地黃苷D（純度：99.3%，批號：L21O10Y100752）、益母草苷（純度：98.0%，批號：L10A6Y2298）（上海源葉生物科技有限公司）。純凈水（娃哈哈食品有限公司）；乙腈、甲醇為色譜純（Fisher Scientific）；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；HR1871 榨汁機(jī)（飛利浦）；SQP 型萬分之一天平、SQP 型十萬分之一天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；KH-300D 型超聲清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

1.3 藥材

百合地黃湯處方中藥材均來源于道地產(chǎn)區(qū)，地黃采自河南省焦作市，百合采自湖南省邵陽市隆回縣，分別購買不同地區(qū)，不同時(shí)間段采摘的藥材，經(jīng)孟雪助理研究員鑒定藥材分別為玄參科植物地黃Rehmannia glutinosaLibosch 的新鮮塊根和百合科植物百合LiLium browniivar.viridulum的肉質(zhì)鱗葉，各藥材產(chǎn)地和信息見表1，將各批次的單味藥隨機(jī)組合為15 批百合地黃湯基準(zhǔn)S1 ～S15。

表1 百合地黃湯組方中藥材產(chǎn)地信息Tab 1 Origin information of Baihe Dihuang decoction

2 方法與結(jié)果

2.1 百合地黃湯物質(zhì)基準(zhǔn)的制備

按照上述隨機(jī)組合的S1 ～S15，共15 批次的百合地黃湯組方。根據(jù)《金匱要略》中百合地黃湯的煎煮工藝，將120 g 鮮百合洗凈并加入400 mL 純凈水，浸泡10 h，過濾，濾液棄去，藥材中再加入400 mL 水，煎煮至約為200 mL，趁熱濾過，并向?yàn)V液中加入鮮地黃汁200 mL（鮮地黃直接榨汁取汁），共煎至約為300 mL，并將煎煮液選用冷凍干燥法干燥，即得百合地黃湯物質(zhì)基準(zhǔn)。

2.2 百合地黃湯物質(zhì)基準(zhǔn)指紋圖譜的建立

2.2.1 供試品溶液的制備

① 樣品溶液的制備：精密稱取制得的百合地黃湯物質(zhì)基準(zhǔn)適量（相當(dāng)于1 mL 百合地黃湯），加流動(dòng)相（0.1%磷酸水溶液∶乙腈＝99∶1）溶解，并定容至10 mL 量瓶中，搖勻，經(jīng)0.45 μm 的濾膜過濾，即得供試品溶液。

② 地黃陰性樣品制備：將鮮百合洗凈并加入400 mL 純凈水，浸泡10 h，過濾，濾液棄去，藥材中再加入400 mL 純凈水，煎煮至約為200 mL，趁熱濾過，濾液中加入純凈水200 mL，共煎至約為300 mL，即得地黃陰性樣品煎液。取上述液體1 mL，置于10 mL 量瓶中，加流動(dòng)相（0.1%磷酸水溶液∶乙腈＝99∶1），定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm 的濾膜過濾，即得。

③ 百合陰性樣品制備：取200 mL 純凈水，并加入鮮地黃汁200 mL，共煎至約為300 mL，即得百合陰性樣品煎液。取上述液體1 mL，置于10 mL 量瓶中，加流動(dòng)相（0.1%磷酸水溶液∶乙腈＝99∶1），定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm 的濾膜過濾，即得。

2.2.2 對照品溶液的制備 取梓醇、地黃苷D、益母草苷對照品適量，精密稱定，加流動(dòng)相溶液（0.1%磷酸水溶液∶乙腈＝99∶1）分別制成相應(yīng)濃度的對照品溶液，并吸取相應(yīng)的各對照品溶液配制成含梓醇797.796 μg·mL－1、地黃苷D 95.924 μg·mL－1、益母草苷131.908 μg·mL－1的混合對照品溶液，經(jīng)0.45 μm 的濾膜過濾，即得。

2.2.3 色譜條件 采用Kromasil 100-5-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測波長203、320 nm；流速0.7 mL·min－1；柱溫35℃；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.10%磷酸水溶液（B）；進(jìn)樣量10 μL；梯度洗脫（0 ～20 min，2.0%A；20 ～60 min，2.0% ～20.0%A；60 ～70 min，20.0 ～40.0%A；70 ～80 min，40.0%～90.0%A）。

2.2.4 精密度試驗(yàn) 稱取百合地黃湯物質(zhì)基準(zhǔn)（S3）適量（相當(dāng)于1 mL 百合地黃湯），精密稱定，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 針，記錄各色譜圖，在203 nm 時(shí)，以地黃苷D 峰為參比峰，計(jì)算各共有峰相對保留時(shí)間RSD均小于0.10%，相對峰面積RSD均小于1.0%，在320 nm 時(shí)，以峰2 為參比峰，計(jì)算各共有峰相對保留時(shí)間RSD均小于0.10%，相對峰面積RSD均小于2.0%，表明該儀器精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 稱取百合地黃湯物質(zhì)基準(zhǔn)（S3）適量（相當(dāng)于1 mL 百合地黃湯），精密稱定，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在0、3、6、11、16、23 h 后進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，在203 nm 時(shí)，以地黃苷D 峰為參比峰，計(jì)算各共有峰相對保留時(shí)間RSD均小于0.10%，相對峰面積RSD均小于1.0%，在320 nm 時(shí)，以峰2 為參比峰，計(jì)算各共有峰相對保留時(shí)間RSD均小于0.10%，相對峰面積RSD均小于2.5%，表明供試品溶液在23 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取百合地黃湯物質(zhì)基準(zhǔn)（S3）適量（相當(dāng)于1 mL 百合地黃湯），精密稱定（共6 份），按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，在203 nm 時(shí)，以地黃苷D 峰為參比峰，計(jì)算各共有峰相對保留時(shí)間RSD均小于0.10%，相對峰面積RSD均小于5.0%，在320 nm 時(shí)，以峰2 為參比峰，計(jì)算各共有峰相對保留時(shí)間RSD均小于0.10%，相對峰面積RSD均小于4.0%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.2.7 雙波長指紋圖譜的建立及共有峰歸屬 取15 批百合地黃湯物質(zhì)基準(zhǔn)供試品溶液進(jìn)樣分析，分別記錄203 nm、320 nm 下的各色譜圖。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012 版）”軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，指紋圖譜1：當(dāng)波長為203 nm 時(shí)，以S1 的圖譜為參照圖譜，進(jìn)行多點(diǎn)校正和全譜峰匹配，確定共有峰16 個(gè)，并通過與混合對照品溶液對比，指認(rèn)出其中3 種化學(xué)成分，分別為梓醇（峰1）、地黃苷D（峰5）和益母草苷（峰8），見圖1。匹配后的15 批樣品色譜圖，見圖2。對各樣品進(jìn)行相似度評價(jià)，S1 ～S15 樣品與對照圖譜的相似度分別為0.993、0.990、0.994、0.993、0.995、0.996、0.995、0.996、0.994、0.997、0.997、0.997、0.991、0.991、0.990，對樣品中共有峰進(jìn)行藥材歸屬，其中峰2、峰9 來源于鮮百合，峰1、3 ～8、10 ～16 均來源于鮮地黃汁，見圖3。指紋圖譜2：當(dāng)波長為320 nm 時(shí)，以S1的圖譜為參照圖譜，進(jìn)行多點(diǎn)校正和全譜峰匹配，確定共有峰有9 個(gè)，對樣品中共有峰進(jìn)行歸屬，其中峰2、4、6、9 來源于鮮地黃汁，峰1、3、5、7 ～8 均來源于鮮百合，見圖4，匹配后的15批樣品色譜圖，見圖5。對各樣品進(jìn)行相似度評價(jià)，S1 ～S15 樣品與對照圖譜的相似度分別為0.987、0.990、0.995、0.976、0.970、0.973、0.988、0.994、0.989、0.995、0.984、0.986、0.991、0.992、0.993。

圖1 混合對照品HPLC 圖（203 nm）Fig 1 HPLC diagram of mixed reference substance （203 nm）

圖2 15 批百合地黃湯物質(zhì)基準(zhǔn)的指紋圖譜（203 nm）Fig 2 Fingerprints of 15 batches of primary standard of Baihe Dihuang decoction（203 nm）

圖3 百合地黃湯物質(zhì)基準(zhǔn)指紋圖譜共有峰歸屬（203 nm）Fig 3 Attribution peak fingerprint of characteristic peak of primary standard of Baihe Dihuang decoction（203 nm）

圖4 百合地黃湯物質(zhì)基準(zhǔn)指紋圖譜共有峰歸屬（320 nm）Fig 4 Attribution peak fingerprint of characteristic peak of primary standard of Baihe Dihuang decoction（320 nm）

圖5 15 批百合地黃湯物質(zhì)基準(zhǔn)的指紋圖譜（320 nm）Fig 5 Fingerprints of 15 batches of primary standard of Baihe Dihuang decoction（320 nm）

2.3 百合地黃湯物質(zhì)基準(zhǔn)中化學(xué)成分的含量測定

2.3.1 色譜條件 采用Kromasil 100-5-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測波長203 nm；流速0.7 mL·min－1；柱溫35℃；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.10%磷酸水溶液（B）；進(jìn)樣量10 μL；梯度洗脫（0 ～20 min，2.0%A；20 ～60 min，2.0%～20.0%A；60 ～70 min，20.0 ～40.0%A；70 ～80 min，40.0%～90.0%A）。

2.3.2 線性關(guān)系 取梓醇、地黃苷D 和益母草苷對照品適量，精密稱定，加流動(dòng)相溶液分別制成梓醇797.796 μg·mL－1、地黃苷D 95.924 μg·mL－1和益母草苷131.908 μg·mL－1的混合對照品溶液，即得。

精密吸取上述混合對照品溶液適量，分別稀釋成質(zhì)量濃度為母液的1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32 的混合對照品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，并記錄色譜圖。以對照品溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），以峰面積值為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸，得到線性回歸方程為梓醇：Y＝8.6387X＋32.157（R2＝0.9999）、地黃苷D：Y＝6.1495X＋0.8544（R2＝1.000）、益母草苷：Y＝5.6197X＋2.5602（R2＝0.9999）， 結(jié)果表明梓醇、地黃苷D、益母草苷分別在24.931 ～797.796 μg·mL－1、2.998～95.924 μg·mL－1、4.122～131.908 μg·mL－1與峰面積線性關(guān)系良好。2.3.3 精密度試驗(yàn) 稱取百合地黃湯物質(zhì)基準(zhǔn)（S3）適量（相當(dāng)于1 mL 百合地黃湯），精密稱定，制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 針，記錄各色譜圖，以地黃苷D 峰為參比峰，計(jì)算各共有峰相對保留時(shí)間RSD均小于0.10%，相對峰面積RSD均小于1.0%，表明該儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 稱取百合地黃湯物質(zhì)基準(zhǔn)（S3）適量（相當(dāng)于1 mL 百合地黃湯），精密稱定，制備供試品溶液，分別于0、3、6、11、16、23 h 后進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，以地黃苷D 峰為參比峰，計(jì)算各共有峰相對保留時(shí)間RSD均小于0.10%，相對峰面積RSD均小于1.0%，表明供試品溶液在23 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取百合地黃湯物質(zhì)基準(zhǔn)（S3）適量（相當(dāng)于1 mL 百合地黃湯），精密稱定（共6 份），制備成供試品溶液，進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，以地黃苷D 峰為參比峰，計(jì)算各共有峰相對保留時(shí)間RSD均小于0.10%，相對峰面積RSD均小于5.0%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.3.6 加樣回收試驗(yàn) 稱取已知含量的百合地黃湯物質(zhì)基準(zhǔn)（S3）適量（相當(dāng)于1 mL 百合地黃湯），精密稱定，制備供試品溶液6 份，每組分別添加地梓醇對照品溶液（1164.32 μg·mL－1）、地黃苷D 對照品溶液（342.59 μg·mL－1）、益母草苷對照品溶液（659.54 μg·mL－1）適量，進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，計(jì)算各化合物的平均加樣回收率及RSD值。結(jié)果顯示梓醇低、中、高濃度的平均回收率分別為94.42%、94.15%、96.01%，RSD分別為0.44%、1.5%、1.6%，地黃苷D 低、中、高濃度的平均回收率分別為95.05%、95.80%、100.9%，RSD分別為1.7%、0.80%、4.3%， 益母草苷低、中、高濃度的平均回收率分別為104.4%、101.9%、101.8%，RSD分別為0.27%、1.5%、2.1%，結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確性良好。

2.3.7 指標(biāo)成分的含量測定 測定15 批次百合地黃湯物質(zhì)基準(zhǔn)的干膏得量，即百合地黃湯物質(zhì)基準(zhǔn)的質(zhì)量比對應(yīng)百合地黃湯體積的數(shù)值，結(jié)果見表2。

表2 15 批百合地黃湯物質(zhì)基準(zhǔn)含量測定結(jié)果Tab 2 Content of material reference in 15 batches of Baihe Dihuang decoction

根據(jù)含量測定結(jié)果可知，15 批百合地黃湯中梓醇、地黃苷D 和益母草苷的含量分別在36.2126 ～48.8442 mg·g－1、2.9734 ～4.8516 mg·g－1和3.6128 ～5.0232 mg·g－1。 根據(jù)國家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的《國家藥監(jiān)局綜合司公開征求古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑及其物質(zhì)基準(zhǔn)申報(bào)資料要求（征求意見稿）意見》[13]規(guī)定，物質(zhì)基準(zhǔn)中指標(biāo)性成分含量一般在均值的70%～130%，15 批次指標(biāo)成分含量均穩(wěn)定在均值70%～130%，無離散數(shù)據(jù)。

3 討論

本研究按照古籍記載，選用鮮百合和地黃汁（經(jīng)鮮地黃榨汁處理）入藥，同時(shí)結(jié)合國家中醫(yī)藥管理局發(fā)布的關(guān)于《古代經(jīng)典名方信息表（7首方劑）》中劑量換算關(guān)系及古代度量衡演變過程[19-20]，最終確定制備工藝為：將鮮百合洗凈并加入400 mL 純凈水，浸泡10 h，過濾，濾液棄去，藥材中再加入400 mL 純凈水，煎煮至約為200 mL，趁熱濾過，收集濾液并加入200 mL 鮮地黃汁，共煎至約為300 mL，即得。

為提高百合地黃湯物質(zhì)基準(zhǔn)的質(zhì)量控制研究，本文建立了HPLC 的雙波長指紋圖譜，分析處方中特征化學(xué)成分的藥材來源。相比單波長指紋圖譜控制生產(chǎn)過程中的質(zhì)量，雙波長指紋圖譜不但對處方的工藝進(jìn)行了質(zhì)量控制，而且可以準(zhǔn)確的控制生產(chǎn)過程中原藥材的質(zhì)量，進(jìn)而提高了生產(chǎn)效率和質(zhì)量控制的效率。試驗(yàn)中選用HPLC-DAD高效液相色譜儀對樣品進(jìn)行了200 ～400 nm 全波長掃描。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)波長為203 nm 時(shí)共有峰數(shù)目最多，共有16 個(gè)，通過對共有峰歸屬其中14個(gè)來源于鮮地黃汁，2 個(gè)來源于鮮百合藥材；當(dāng)波長為320 nm 時(shí)，共有峰有9 個(gè)，其中5 個(gè)來源于鮮百合藥材，4 個(gè)來源于鮮地黃汁。在203 nm和320 nm 雙波長下建立的指紋圖譜，可以更加準(zhǔn)確、全面地監(jiān)控物質(zhì)基準(zhǔn)在生產(chǎn)過程中的質(zhì)量。同時(shí)試驗(yàn)還對其中3 種化合物進(jìn)行了含量測定，分別為梓醇、地黃苷D 和益母草苷，以提高百合地黃湯物質(zhì)基準(zhǔn)的質(zhì)量的控制，以便更好地生產(chǎn)出合格、放心的產(chǎn)品。建立的雙波長指紋圖譜和多種化學(xué)成分的含量測定，為百合地黃湯物質(zhì)基準(zhǔn)的質(zhì)量控制和復(fù)方制劑的制劑開發(fā)提供了可靠的質(zhì)量控制方法，該方法穩(wěn)定性和重現(xiàn)性均較好。