蒲公英提取物對白念珠菌的抑制作用及機制研究

楊建婷，梁引庫，王全華*（.兵器工業(yè)五二一醫(yī)院藥劑科，西安 70065；.陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 73000）

臨床上真菌感染性疾病不斷增多，白念珠菌（又稱白假絲酵母菌）是最常見的一種條件致病性真菌病原體，定植于人體的各個部位，其生長主要受宿主免疫力、壓力、微生物菌落和其他因素的影響[1]。隨著真菌耐藥性不斷升高且日益嚴(yán)重，開發(fā)新型抗白念珠菌的植物藥成為近些年來的研究熱點[2]。我國科學(xué)家經(jīng)過幾十年的探索，發(fā)現(xiàn)許多中草藥具有抗真菌作用，對白念珠菌有抑制作用的中藥有決明子、苦參、黃芩、烏梅等[3]。中草藥活性成分抗白念珠菌的作用機制是通過破壞菌體的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)的形態(tài)和結(jié)構(gòu)而達到抗真菌作用[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，蒲公英提取物對金黃色葡萄球菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌和大腸埃希菌等均有不同程度的抑制作用[5]。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，通過水提、醇提、超聲提取法等分別提取出蒲公英多糖、黃酮和酚酸等，利用平板打孔法研究各活性成分對沙門菌、痢疾桿菌、大腸埃希菌、葡萄球菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果，結(jié)果顯示不同提取方法對四種菌的抑制作用不同[6]。本文在蒲公英提取物對細(xì)菌抑菌作用的研究基礎(chǔ)上，研究其對真菌的抑制作用，以白念珠菌為研究對象，從最低抑菌濃度（MIC）、掃描電鏡（SEM）、抑菌動力學(xué)、細(xì)胞膜通透性和對細(xì)胞壁葡聚糖合成的影響五個方面，研究蒲公英提取物對白念珠菌的抑制作用及機制，旨在從植物中尋找抗真菌藥物，為開發(fā)廣譜、高效、低毒的抗真菌藥物提供參考。

1 材料

1.1 菌株

白念珠菌（Candida albicans，C.albicans，批號：ATCC10231，該菌株凍干菌種由陜西理工大學(xué)陜西省資源生物重點實驗室菌種保藏中心提供），－80℃低溫冰箱凍存，實驗前復(fù)蘇傳代使用。

1.2 試藥

氫氧化鈉、濃鹽酸（37%）、無水乙醇、戊二醛、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、氯化鉀（天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；吐溫80（Tween 80）、二甲基亞砜（DMSO）（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；氯霉素（上海瑞楚生物科技有限公司）；葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂粉（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；溴化鉀（PIKE，光譜純，北京英萊克科技發(fā)展有限公司）；蒲公英全草（漢中市中藥材市場，經(jīng)陜西理工大學(xué)吳三橋教授鑒定為菊科植物蒲公英）。

1.3 儀器

紫外分光光度計UV250（日本島津）；電熱恒溫培養(yǎng)箱DHP-9162（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；立式壓力蒸汽滅菌鍋LDZX-50KBS（上海申安醫(yī)療器械廠）；臺式高速離心機TGL-20（湖南湘儀儀器開發(fā)有限公司）；超低溫冰箱－80℃DW-86L338J（青島海爾特種電冰柜有限公司）；超凈工作臺SW-CJ-1F（蘇州凈化有限公司）；低溫冷凍干燥機SJIA-10N（寧波市雙嘉儀器有限公司）；掃描電子顯微鏡JSM-6390LV（日本電子公司）；紅外光譜儀FT-IR（美國Nicolette 公司）；真空干燥箱XMTD-8222（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）。

2 方法

2.1 蒲公英活性成分的提取分離與純化

蒲公英有效成分根據(jù)圖1 工藝路線進行提取。提取樣品Ⅰ經(jīng)干燥后密封凍存。

圖1 蒲公英活性成分的分離純化工藝路線Fig 1 Extraction and purification of active ingredients in dandelion

2.2 液相色譜分析條件

色譜柱：DiKMA Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：1.0 mL·min－1；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。乙腈為流動相A，0.1%甲酸水溶液為流動相B，使用梯度洗脫（0 ～10 min 92% B；10 ～24 min，92% →86%B；24 ～35 min，86%→77%B；35 ～56 min，77%→76%B；56 ～60 min，76%→68%B）[7]。

2.3 MIC 測定

將活化后的白念珠菌單菌落接種于沙式液體培養(yǎng)基，37℃、200 r·min－1培養(yǎng)12 h，用沙式液體培養(yǎng)基將菌液濃度調(diào)至1×107CFU·mL－1，配制280 mg·mL－1蒲公英樣品Ⅰ母液，備用。分別向裝有2 mL 沙式培養(yǎng)基的試管中加入蒲公英樣品Ⅰ，使培養(yǎng)基中蒲公英樣品Ⅰ最終質(zhì)量濃度為0、4.0、8.0、16.0、32.0、48.0、64.0 mg·mL－1，以0 mg·mL－1作為對照，按5%（V/V）接入備用菌液，分別于37℃、200 r·min－1培養(yǎng)24 h，用分光光度計測A600nm值。與前一濃度相比較，當(dāng)A600nm下降≥95%時的樣品的濃度即為蒲公英樣品Ⅰ的MIC[8]。每組設(shè)置3 個平行。

2.4 SEM

用1×107CFU·mL－1菌液配制280 mg·mL－1蒲公英樣品Ⅰ母液，備用。取2 mL 懸浮菌體，分別加入蒲公英樣品Ⅰ母液，使溶液中蒲公英樣品Ⅰ最終濃度為0、0.5、1、2×MIC，以0×MIC作為對照，分別于37℃、200 r·min－1培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)至5 h 時，取1 mL 的菌體樣品，4℃、8000 r·min－1離心6 min，PBS（pH 5.8）洗滌2 次。加入2.5%戊二醛過夜固定，使用呈梯度濃度的乙醇溶液（50%、60%、70%、80%、90%）重懸浸泡10 min，于4℃、8000 r·min－1離心6 min；乙醇重懸浸泡10 min，4℃、8000 r·min－1離心6 min，2 次，脫水，用真空冷凍干燥機干燥12 h。鍍金后上SEM 觀察[9]。每組設(shè)置3 個平行。

2.5 抑菌動力學(xué)分析

用1×107CFU·mL－1菌液配制280 mg·mL－1蒲公英樣品Ⅰ母液，備用。分別向裝有4 mL 沙式液體培養(yǎng)基的試管中加入蒲公英樣品Ⅰ，使培養(yǎng)基中蒲公英樣品Ⅰ最終濃度為0、1、3×MIC，以0×MIC作為空白對照，按5%（V/V）接入備用菌液，分別于37℃、200 r·min－1培養(yǎng)，每隔3 h 取樣200 μL，測其A600nm值。每組設(shè)置3 個平行。按式1 計算白念珠菌存活率和抑菌率[10-11]。

式1：存活率（%）＝A600nm（加入抗菌樣的吸光度）/A600nm（未加入抗菌樣的吸光度）×100%。

2.6 核酸吸光度法研究細(xì)胞膜通透性

按照“2.3”項下方法培養(yǎng)白念珠菌，將菌液于6000 r·min－1離心10 min，收集菌體，pH 5.8 PBS 洗3 次。用含0.01% Tween 80 的pH 5.8 PBS懸浮菌體，調(diào)整為1×109CFU·mL－1。分別向裝有2.5 mL 懸浮菌體的10 mL 試管中加入蒲公英樣品Ⅰ，使溶液中蒲公英樣品Ⅰ最終濃度為0、0.5、1、2×MIC，以0×MIC作為空白對照，37℃、200 r·min－1培養(yǎng)，分別于0、1、2、4、6 h 取樣200 μL，6000 r·min－1離心10 min 后測上清液A260nm值[12]。每組設(shè)置3 個平行。

2.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析使用SPSS 22.0、Origin 8.0 軟件，物質(zhì)結(jié)構(gòu)式繪制使用ChemDraw 軟件，圖片處理使用Photoshops 5.0。數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)評估，使用單因素方差分析（ANOVA）來比較差異組，P＜0.05 代表差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 蒲公英抑菌成分的分離及鑒定

HPLC 分析蒲公英樣品Ⅰ組分（見圖2），發(fā)現(xiàn)該組分在280 nm 處主要有8 種化合物，其保留時間依次為21.5、27.9、30.3、37.2、38.9、39.8、44.7 和66.2 min，相對百分含量分別為11.45%、3.96%、10.48%、34.24%、3.91%、11.80%、3.65%和4.21%。經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)峰1、峰2、峰3、峰4、峰5 和峰6 依次被初步確定為4-香豆酸、阿魏酸、槲皮素戊糖苷、3，5-二-O-咖啡?？崴帷?，5-二-O-咖啡酰奎寧酸和木犀草素，而峰7 和峰8為未知化合物。

圖2 蒲公英樣品Ⅰ的HPLC 色譜圖Fig 2 HPLC chromatogram of dandelion sampleⅠ

3.2 MIC 的測定

結(jié)果表明隨著蒲公英樣品Ⅰ質(zhì)量濃度增加，白念珠菌A600nm逐漸下降，在32.0 mg·mL－1時，菌液A600nm為對照的0.048%，吸光值下降幅度達95%。表明蒲公英提取物對白念珠菌的抑制率可達95%，且隨著濃度增加，菌液A600nm下降幅度均大于95%。表明蒲公英提取物對白念珠菌的MIC值為32.0 mg·mL－1。

3.3 SEM 分析

SEM 觀察發(fā)現(xiàn)，對照組處理5 h 后，白念珠菌結(jié)構(gòu)完整，外觀飽滿，菌體成近乎橢圓形，表面光滑，折光性好（見圖3A ～C）。0.5×MIC樣品Ⅰ作用5 h 后的白念珠菌細(xì)胞表面基本和空白對照組一樣，但表面變得粗糙，折光性減弱（見圖3D ～F）。1.0×MIC樣品Ⅰ處理白念珠菌5 h后，多數(shù)白念珠菌細(xì)胞不再呈現(xiàn)橢球形，結(jié)構(gòu)基本完整，但表面有褶皺，部分菌體出現(xiàn)凹陷。表面比較粗糙，細(xì)胞體積開始縮?。ㄒ妶D3G ～I）。2.0×MIC樣品Ⅰ處理白念珠菌 5 h 后，全部白念珠菌細(xì)胞不再呈現(xiàn)橢球形，細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)不規(guī)則，細(xì)胞明顯縮小，表面褶皺且極度粗糙，部分菌體出現(xiàn)嚴(yán)重凹陷，細(xì)胞膜破損，導(dǎo)致內(nèi)容物外泄（見圖3K、L）；圖3J 顯示，全部白念珠菌細(xì)胞明顯縮小，表面褶皺、嚴(yán)重凹陷及細(xì)胞膜破損在圖片上不甚明顯，考慮是菌體細(xì)胞明顯縮小，在放大2000 倍時菌體形態(tài)變化掃描電鏡不能顯示出顯著性差異。綜上可知，樣品Ⅰ能夠使細(xì)胞體積縮小，結(jié)構(gòu)不對稱并且表面形成褶皺，從而破壞白念珠菌的正常形態(tài)。其原因可能是由于細(xì)胞內(nèi)容物的大量外泄使得白念珠菌細(xì)胞壁、細(xì)胞膜凹陷，形成褶皺。

圖3 白念珠菌的SEM 圖像Fig 3 SEM images of C.albicans

3.4 抑菌動力學(xué)分析

微生物生長包括四個時期：緩慢期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期。樣品Ⅰ對白念珠菌生長周期的抑制可根據(jù)生長曲線中的指數(shù)期進行分析。白念珠菌對數(shù)生長期的動力學(xué)方程可表示為[13]：

其中，μ是生長速率，N為t時刻的微生物數(shù)量。

假設(shè)微生物的比生長速率為一個常數(shù)，

抑菌動力學(xué)是通過繪制白念珠菌的抑制生長曲線來研究抗菌性能。樣品Ⅰ對白念珠菌生長曲線的影響如圖4 所示，由圖4 可知，空白對照組的菌體生長狀態(tài)良好，當(dāng)加入樣品Ⅰ后，菌液的光密度值降低，表明樣品Ⅰ對白念珠菌有較好的抑制作用。當(dāng)樣品Ⅰ濃度為1.0×MIC時A600nm隨時間有明顯變化，樣品濃度為3.0×MIC時A600nm變化不大，表明白念珠菌生長受到嚴(yán)重抑制，樣品Ⅰ對白念珠菌的抑菌作用增強。分析樣品Ⅰ對白念珠菌生長速率及白念珠菌的抑制率發(fā)現(xiàn)（見表1），正常情況下白念珠菌的比生長速率為0.05，分別加入1.0×MIC和 3.0×MIC的樣品Ⅰ后，其生長速率則分別減小到0.02 和0.00，加入3.0×MIC樣品Ⅰ后白念珠菌基本不生長，其抑制率達到了97.13%。由此可知樣品Ⅰ對白念珠菌的抑制作用主要是作用于其對數(shù)期的生長，使白念珠菌的生長速度大幅度的降低，而抗菌效果取決于樣品Ⅰ的濃度和作用時間[10]。

圖4 三種濃度的樣品Ⅰ對白念珠菌的抑菌曲線Fig 4 Antibacterial curves of three concentrations of sampleⅠ on C.albicans

表1 C.albicans 在不同濃度樣品Ⅰ中的抑制率及比生長速率(對數(shù)生長期)Tab 1 Inhibition rate and growth rate of C.albicans in different concentrations of sampleⅠ(logarithmic growth phase)

3.5 細(xì)胞膜通透性分析

正常情況下，完整的細(xì)胞膜選擇性通透，會阻擋胞內(nèi)大分子物質(zhì)外流。而當(dāng)導(dǎo)致膜損傷的殺菌劑存在時，殺菌劑會破壞細(xì)胞膜，本來不能透過細(xì)胞膜的具有紫外吸收的核酸類物質(zhì)便泄漏到培養(yǎng)液中，導(dǎo)致培養(yǎng)液在260 nm 處的吸光度值增大。因此，通過測定培養(yǎng)液260 nm 處的吸光度值能夠預(yù)測菌體細(xì)胞膜的完整性。由圖5 可知，空白對照組（0×MIC）的培養(yǎng)液在260 nm 波長的紫外吸光值隨著培養(yǎng)時間的增加逐漸增大，表明白念珠菌在培養(yǎng)過程中伴隨細(xì)胞膜破壞，菌體的死亡。分別加入0、0.5、1.0、2.0×MIC的樣品Ⅰ后，培養(yǎng)液的紫外吸收值也隨著培養(yǎng)時間的增加而增大，且都表現(xiàn)出在同一時間高于對照組的現(xiàn)象，且有些達到了顯著水平。這表明蒲公英樣品Ⅰ損壞了白念珠菌細(xì)胞膜，導(dǎo)致膜的通透性增加，進而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

圖5 三種濃度的樣品Ⅰ對白念珠菌細(xì)胞膜通透性的影響Fig 5 Influence of samplesⅠ at three concentrations on cell permeability of C.albicans

4 討論

白念珠菌細(xì)胞壁的主要成分是己糖或氨基己糖，對于維持細(xì)胞形態(tài)和胞內(nèi)高滲狀態(tài)起著重要作用。白念珠菌細(xì)胞膜主要由磷脂類、鞘脂類和麥角甾醇等組分構(gòu)成，是一種滲透屏障，是小分子和信號傳導(dǎo)的通路，并為各種功能蛋白提供基質(zhì)結(jié)構(gòu)。細(xì)胞壁和細(xì)胞膜對完成胞內(nèi)外物資交換、營養(yǎng)物質(zhì)吸收和生物合成等方面起重要作用，這些結(jié)構(gòu)一旦被破壞，其功能作用喪失，將導(dǎo)致真菌細(xì)胞死亡[14]?？拐婢幬锏淖饔脵C制包括作用于真菌細(xì)胞膜中甾醇合成、作用于真菌細(xì)胞壁合成、作用于核酸合成，其實質(zhì)都是破壞菌體的超微結(jié)構(gòu)。本文研究發(fā)現(xiàn)蒲公英提取物可以破壞白念珠菌的細(xì)胞膜，可能是其抗真菌活性的抑菌機制。但是，對中藥抗白念珠菌作用機制的研究，不應(yīng)該只局限于電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化和對白念珠菌的宏觀影響上，應(yīng)從分子水平上探討中藥活性成分是如何作用于這些細(xì)胞結(jié)構(gòu)并使其發(fā)生改變，尤其是對生物膜主要成分合成酶的影響，分離酶基因從基因?qū)用娼沂局兴幙拐婢饔脵C制。

White 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，白念珠菌在受到外界環(huán)境的抑制時，其編碼目標(biāo)酶ERG11基因會發(fā)生改變改變，而細(xì)胞外排泵基因CDR1、CDR2和MDR1會過表達進而菌體死亡。Denning[16]研究發(fā)現(xiàn)，從溶菌芽孢桿菌C3 分離得到的酰胺B（ATB）可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，ATB 通過抑制細(xì)胞G2/M 期細(xì)胞周期停滯的微管蛋白聚合而發(fā)揮作用的。表面活性劑對白念珠菌的作用，主要是對菌絲發(fā)育、細(xì)胞膜形態(tài)有強烈的影響，這種影響與肌動蛋白骨架的異常組織和隨后的菌絲相關(guān)因子的極化轉(zhuǎn)運缺陷有關(guān)[17]。細(xì)胞壁β-葡聚糖在白念珠菌生長過程中起到了重要作用[18-19]?？ú捶覂敉ㄟ^抑制白念珠菌細(xì)胞壁β-葡聚糖的合成，從而達到抑制白念珠菌增長的目的[20]。本研究分析了樣品Ⅰ對白念珠菌的MIC值為32.0 mg·mL－1。抑菌動力學(xué)方程分析發(fā)現(xiàn)樣品Ⅰ對白念珠菌的抑制作用主要是作用于其指數(shù)生長期。樣品Ⅰ可破壞白念珠菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞表面凹陷，形成褶皺。細(xì)胞膜通透性分析發(fā)現(xiàn)，樣品Ⅰ導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物外泄。這進一步表明蒲公英提取物是通過作用于白念珠菌細(xì)胞的細(xì)胞壁，通過破壞細(xì)胞壁進而導(dǎo)致內(nèi)容外泄而引起細(xì)胞凋亡的。

雖然在中藥抗白念珠菌的研究方法和作用機制方面已經(jīng)取得了不少進展，但仍然存在諸多未知領(lǐng)域，需要進一步深入探討，為真菌疾病的治療提供新的選擇。