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    美麗薄子木內(nèi)生真菌Rhytidhysteron sp.BZM-9化學(xué)成分研究

    2022-11-15 06:46:34張莎曠敏彭偉偉鄭雨婷許立曾廣源鄒振興中南大學(xué)湘雅藥學(xué)院長(zhǎng)沙410013慢病診療小分子藥物發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)化湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)沙410013
    中南藥學(xué) 2022年9期
    關(guān)鍵詞:易溶柱層析內(nèi)生

    張莎,曠敏,彭偉偉,鄭雨婷,許立,曾廣源,鄒振興*(1.中南大學(xué)湘雅藥學(xué)院,長(zhǎng)沙 410013;2.慢病診療小分子藥物發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)化湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長(zhǎng)沙 410013)

    植物內(nèi)生真菌是天然產(chǎn)物的重要資源,它們棲息在宿主植物的不同器官、組織內(nèi),對(duì)宿主植物本身不會(huì)引起任何疾病[1]。從微生物,尤其是植物內(nèi)生真菌和海洋微生物中尋找和發(fā)現(xiàn)活性新穎的先導(dǎo)化合物已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)[2-3]。近年來(lái),內(nèi)生真菌產(chǎn)生的多種生物活性代謝物具有重要的社會(huì)經(jīng)濟(jì)價(jià)值,在農(nóng)業(yè)(作為生物肥料/生物刺激劑)和環(huán)境(生物修復(fù))中被廣泛應(yīng)用[2]。

    美麗薄子木(Leptospermum brachyandrum)為桃金娘科(Myrtaceae)魚(yú)柳梅屬(Leptospermum)小喬木或灌木,原產(chǎn)于澳大利亞。由于其觀賞及藥用價(jià)值引入我國(guó),目前在廣東、廣西等地廣泛種植。研究顯示,桃金娘科植株富含精油及間苯三酚類成分,具有較好的抗菌活性[4-8]。但目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于該科植物美麗薄子木的化學(xué)成分及其內(nèi)生真菌的研究鮮少。課題組前期通過(guò)組織分離法從美麗薄子木植物中分離出一株內(nèi)生真菌,經(jīng)ITS測(cè)序鑒定為Rhytidhysteronsp.BZM-9。經(jīng)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn),目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于該屬真菌的化學(xué)成分研究較少,僅報(bào)道幾個(gè)色原酮[9]及螺二萘成分[10-12]。因此,為了進(jìn)一步探明其化學(xué)多樣性,本文利用現(xiàn)代色譜及光譜技術(shù)從中分離鑒定出15 個(gè)化合物(見(jiàn)圖1),并對(duì)部分化合物進(jìn)行了抗菌和細(xì)胞毒活性評(píng)價(jià)。

    圖1 化合物1 ~15 的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig 1 Structures of compounds 1 ~15

    1 材料

    Bruker AV-400/AV-500/AV-600 型核磁共振儀(德國(guó)Bruker 公司);Agilent 1290 UPLC-6545 accurate mass Q-TOF 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、Agilent 1200 型分析高效液相色譜儀、Agilent 1100 型半制備型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent 科技公司);YMC-pack ODS-A 色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);YMC-pack ODS-A 色譜柱(250 mm×10 mm,10 μm);C18反相硅膠(40 ~75 μm,日本Kasugai);硅膠(60 ~100 目,200 ~300 目,青島海洋化工有限公司);Sephadex LH-20 凝膠(德國(guó)Healthcare Uppsala Swedeb);所用試劑均為分析純。

    HepG2 和SMMC-7721 肝癌細(xì)胞(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心);實(shí)驗(yàn)菌株MRSA(Methicillin-resistantStaphylococcus aureus)及Escherichia coli來(lái)自廣東省微生物培養(yǎng)中心。

    實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)菌株分離自美麗薄子木枝葉,美麗薄子木枝葉于2016年9月采自中國(guó)科學(xué)院華南植物園,由華南植物園王發(fā)國(guó)副研究員鑒定。該真菌由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司經(jīng)ITS 序列分析鑒定為Rhytidhysteronsp.BZM-9,目前該樣品標(biāo)本保存于中南大學(xué)湘雅藥學(xué)院天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

    2 菌株的發(fā)酵、萃取及其代謝產(chǎn)物的分離

    用接種環(huán)挑取適量菌絲接種至裝有200 mL PDB 的三角瓶中,在恒溫培養(yǎng)搖床中培養(yǎng)5 d(28℃,130 r·min-1),制備得到種子液。將種子液接種至無(wú)菌大米培養(yǎng)基中,共培養(yǎng)60 瓶,室溫下靜態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)30 d,得到固體發(fā)酵物。發(fā)酵完成后用乙酸乙酯將大米發(fā)酵物萃取3 次,將有機(jī)溶劑減壓蒸發(fā)獲得粗提物浸膏(50 g)。

    乙酸乙酯浸膏經(jīng)硅膠柱層析,采用PE-EAMeOH(100∶0∶0 ~0∶0∶100)梯度洗脫,得到10 個(gè)組分(Fr.A ~Fr.J)。Fr.F 再經(jīng)硅膠柱層析,以CH2Cl2-MeOH(100∶0 ~0∶100)梯度洗脫,得到8 個(gè)組分(Fr.F-1 ~Fr.F-8)。Fr.F-3 經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析及Pre-HPLC 得到化合物1(20.3 mg)、2(15.8 mg)、7(3.5 mg)、8(5.8 mg)和9(10.3 mg)。Fr.F-4 經(jīng)Sephadex LH-20 柱層析,甲醇洗脫,得到4 個(gè)組分(Fr.F-4-1 ~Fr.F-4-4)。Fr.F-4-2 依次經(jīng)硅膠柱層析、Pre-HPLC 得到化合物3(7.3 mg)、4(2 mg)、5(6.6 mg)和6(1.6 mg)。Fr.F-5 經(jīng)ODS 柱層析,采用MeOHH2O(20∶80 ~100∶0)梯度洗脫,得到8 個(gè)組分(Fr.F-1 ~Fr.F-8)。Fr.F-2 經(jīng)Pre-HPLC 得到化合物14(2.1 mg)。Fr.F-3 依次經(jīng)硅膠柱層析、Pre-HPLC 得化合物10(5.4 mg)。

    Fr.E 經(jīng)ODS 柱層析,采用MeOH-H2O(20∶80~100∶0)梯度洗脫,得到8 個(gè)組分(Fr.E-1 ~Fr.E-8)。Fr.E-5 經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析,再通過(guò)Pre-HPLC得到化合物11(2.3 mg)和13(3.5 mg);Fr.E-6 依次經(jīng)硅膠柱層析、Pre-HPLC 得到化合物12(8.5 mg);Fr.E-7 經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析得到化合物15。

    3 結(jié)構(gòu)鑒定

    化合物1:白色無(wú)定型粉末,易溶于甲醇和二甲基亞砜(DMSO),HR-ESI-MSm/z:259.0608 [M+H]+。1H-NMR(600 MHz,CD3OD)δ:7.24(1H,d,J=2.4 Hz,H-6),6.69(1H,d,J=3.0 Hz,H-5'),6.60(1H,d,J=3.0 Hz,H-3'),6.35(1H,d,J=2.4 Hz,H-4),2.75(3H,s,6'-CH3)。13C-NMR(150 MHz,CD3OD)δ:140.0(C-1),98.9(C-2),166.2(C-3),102.2(C-4),166.9(C-5),105.8(C-6),167.6(C-7),111.0(C-1'),154.5(C-2'),102.7(C-3'),159.9(C-4'),118.6(C-5'),139.8(C-6'),25.9(6'-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[13]基本一致,化合物1 鑒定為alternariol。

    化合物2:褐色固體,易溶于甲醇和DMSO,HR-ESI-MSm/z:275.0555 [M +H]+。1H-NMR(600 MHz,CD3OD)δ:7.23(1H,d,J=1.8 Hz,H-9),6.68(1H,s,H-2),6.35(1H,d,J=1.8 Hz,H-7),2.66(3H,s,H-10)。13C-NMR(150 MHz,CD3OD)δ:126.9(C-1),116.3(C-2),146.3(C-3),130.9(C-4),141.3(C-4a),164.8(C-5a),97.5(C-6),100.6(C-7),165.0(C-8),104.2(C-9),139.1(C-9a),109.8(C-9b),23.9(C-10),165.4(C-11)。 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[14]基本一致,化合物2 鑒定為porric acid E。

    化合物3:黃色固體,易溶于甲醇和DMSO,HR-ESI-MSm/z:223.0987 [M +H]+。1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:6.39(1H,s,H-4),1.97(3H,s,H-11),1.89(1H,m,H-8a),1.80(1H,m,H-8b),1.48(3H,s,H-10),0.64(3H,t,J=7.2 Hz,H-9)。13C-NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:169.3(C-1),86.6(C-3),99.5(C-4),163.2(C-5),111.4(C-6),155.2(C-7),153.5(C-3a),103.5(C-7a),32.5(C-8),8.6(C-9),26.2(C-10),8.1(C-11)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[15]基本一致,化合物3 鑒定為3-ethyl-5,7-dihydroxy-3,6-dimethylphthalide。

    化合物4:白色針狀晶體,易溶于甲醇和DMSO,HR-ESI-MSm/z:209.0814 [M +H]+。1H-NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ:5.20(2H,s,H-3),3.85(3H,s,H-10),2.09(3H,s,H-9),2.06(3H,s,H-8)。13C-NMR(125 MHz,DMSO-d6)δ:169.2(C-1),68.5(C-3),113.7(C-4),162.4(C-5),118.4(C-6),155.8(C-7),147.3(C-3a),107.4(C-7a),11.8(C-8),9.6(C-9),62.4(C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[16]基本一致,化合物4 鑒定為5-羥基-7-甲氧基-4,6-二甲基-2-苯并呋喃酮。

    化合物5:黃色固體,易溶于甲醇和DMSO,HR-ESI-MSm/z:223.0626 [M +H]+。1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:10.18(1H,s,H-10),5.35(2H,s,H-3),3.92(3H,s,H-9),2.01(3H,s,H-8)。13H-NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:172.5(C-1),70.1(C-3),114.8(C-4),168.5(C-5),121.0(C-6),160.9(C-7),152.5(C-3a),104.9(C-7a),9.2(C-8),61.8(C-9),190.6(C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[17]基本一致,化合物5 鑒定為6-formyl-7-hydroxy-5-methoxy-4-methylphalide。

    化合物6:黃色固體,易溶于甲醇和DMSO,HR-ESI-MSm/z:223.0626 [M +H]+。1H-NMR(600 MHz,CD3OD)δ:6.91(1H,s,H-7),5.22(2H,s,H-3),3.87(3H,s,H-9),2.16(3H,s,H-8)。13C-NMR(150 MHz,CD3OD)δ:172.8(C-1),68.3(C-3),150.0(C-4),120.2(C-5),161.1(C-6),96.8(C-7),123.5(C-3a),126.9(C-7a),7.9(C-8),55.0(C-9)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[18]基本一致,化合物6 鑒定為4-hydroxy-6-methoxy-5-methylphthalide。

    化合物7:白色固體,易溶于甲醇和DMSO,HR-ESI-MSm/z:271.0582 [M +Na]+。1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:6.71(1H,d,J=2.4 Hz,H-6),6.65(1H,d,J=2.4 Hz,H-8),5.96(1H,s,H-3),4.03(2H,s,H-1'),3.55(3H,s,-OCH3),2.28(3H,s,H-9)。13C-NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:164.7(C-2),118.9(C-3),178.2(C-4),137.4(C-5),110.8(C-6),161.1(C-7),102.1(C-8),114.2(C-4a),159.5(C-8a),19.9(C-9),40.1(C-1'),171.6(C-2'),51.7(-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[19]基本一致,化合物7 鑒定為2-甲基-5-甲氧羰甲基-7-羥基色原酮。

    化合物8:白色固體,易溶于甲醇和DMSO,HR-ESI-MSm/z:235.0968 [M +H]+。1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:6.66(1H,d,J=2.4 Hz,H-8),6.62(1H,d,J=2.4 Hz,H-6),5.97(1H,s,H-3),4.03(1H,m,H-2'),2.65(3H,s,H-9),2.58(2H,m,H-1'),1.15(3H,d,J=6.4 Hz,H-3')。13C-NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:165.3(C-2),112.0(C-3),178.8(C-4),141.8(C-5),116.9(C-6),161.4(C-7),101.1(C-8),114.9(C-4a),159.6(C-8a),43.3(C-1'),64.5(C-2'),23.9(C-3'),22.9(5-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[20]基本一致,化合物8 鑒定為2-(2'-hydroxypropyl)-5-methyl-7-hydroxychromone。

    化合物9:白色固體,易溶于甲醇和DMSO,HR-ESI-MSm/z:213.0507 [M +H]+。1H-NMR(600 MHz,CD3OD)δ:6.64(1H,d,J=2.4 Hz,H-6),6.63(1H,d,J=2.4 Hz,H-8),6.00(1H,s,H-3),2.71(3H,s,H-10),2.32(3H,s,H-9)。13C-NMR(150 MHz,CD3OD)δ:166.7(C-2),115.6(C-3),182.1(C-4),163.2(C-5),118.1(C-6),143.7(C-7),101.7(C-8),111.4(C-4a),161.5(C-8a),19.9(C-9),23.2(C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[21]基本一致,化合物9 鑒定為altechromones A。

    化合物10:淺黃色固體,易溶于甲醇和DMSO,HR-ESI-MSm/z:193.0864 [M +H]+。1H-NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ:7.44(1H,dd,J=7.8,1.8 Hz,H-8),7.41(1H,t,J=7.8 Hz,H-7),7.28(1H,dd,J=7.8,1.8 Hz,H-6),5.10(1H,t,J=3.6 Hz,H-4),3.85(3H,s,-OCH3),2.96(1H,m,H-2a),2.41(1H,m,H-2b),2.11(2H,m,H-3)。13C-NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ:198.3(C-1),32.7(C-2),30.6(C-3),58.9(C-4),157.3(C-5),116.5(C-6),129.4(C-7),118.0(C-8),133.5(C-9),132.6(C-10),56.4(-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[22]基本一致,化合物10 鑒定為4-O-methylscleron。

    化合物11:淺黃色固體,易溶于甲醇和DMSO,HR-ESI-MSm/z:237.1121 [M +H]+。1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:6.18(1H,s,H-5),5.21(1H,m,H-2'),3.75(3H,s,H-8),1.95(3H,s,H-9),1.77(3H,s,H-4'),1.67(3H,d,J=6.4 Hz,H-3')。13C-NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:103.7(C-1),160.7(C-2),109.4(C-3),160.5(C-4),109.3(C-5),146.8(C-6),171.3(C-7),52.4(C-8),8.6(C-9),138.7(C-1'),120.6(C-2'),14.1(C-3'),18.7(C-4')。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[23]基本一致,化合物11 鑒定為pilobolusate。

    化合物12:深褐色固體,易溶于甲醇和DMSO,HR-ESI-MSm/z:179.1071 [M +H]+。1H-NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ:9.03(2H,br s,1/3-OH),6.32(2H,s,H-4,H-6),5.72(1H,q,J=6.5 Hz,H-2'),1.90(3H,s,H-3'),1.86(3H,s,H-4'),1.70(3H,d,J=6.5 Hz,H-7)。13C-NMR(125 MHz,DMSO-d6)δ:156.3(C-1),109.1(C-2),156.3(C-3),103.8(C-4),141.5(C-5),103.8(C-6),8.9(C-7),135.5(C-1'),120.6(C-2'),14.5(C-3'),15.7(C-4')。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[24]基本一致,化合物12 鑒定為aspergillusphenols A。

    化合物13:淡黃色固體,易溶于甲醇和DMSO,HR-ESI-MSm/z:183.0656 [M +H]+。1H-NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ:6.15(1H,d,J=2.4 Hz,H-4),6.14(1H,d,J=2.4 Hz,H-2),3.79(3H,s,-OCH3),2.27(3H,s,H-8)。13C-NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ:161.6(C-1),100.9(C-2),167.4(C-3),110.8(C-4),141.2(C-5),106.1(C-6),170.7(C-7),22.5(C-8),52.2(-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[25]基本一致,化合物13 鑒定為苔色酸甲酯。

    化合物14:黃色固體,易溶于甲醇和DMSO,HR-ESI-MSm/z:146.0401 [M +H]+。1H-NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ:12.14(1H,br s,-NH-),9.93(1H,s,H-10),8.29(1H,s,H-2),8.09(1H,d,J=7.8 Hz,H-4),7.52(1H,d,J=7.8 Hz,H-7),7.25(2H,m,H-5/6)。13C-NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ:139.0(C-2),118.6(C-3),123.9(C-4),122.6(C-5),120.8(C-6),112.9(C-7),137.5(C-8),124.6(C-9),185.5(C-10)。 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[26]基本一致,化合物14 鑒定為1H-indole-3-carboxaldehyde。

    化合物15:黃色固體,易溶于氯仿,HRESI-MSm/z:393.3153 [M +H]+。1H-NMR(500 MHz,CDCl3)δ:6.61(1H,d,J=9.5 Hz,H-7),6.02(1H,d,J=9.5 Hz,H-6),5.74(1H,s,H-4),5.24(2H,m,H-22/23),1.06(3H,d,J=6.5 Hz,H-21),1.00(3H,s,H-19),0.96(3H,s,H-18),0.93(3H,d,J=7.0 Hz,H-28),0.84(6H,d,J=6.5 Hz,H-26/27)。13C-NMR(125 MHz,CDCl3)δ:34.1(C-1/C-2),199.5(C-3),123.0(C-4),124.5(C-5),124.4(C-6),134.0(C-7),164.4(C-8),44.3(C-9),36.8(C-10),19.0(C-11),35.6(C-12),44.0(C-13),156.1(C-14),25.4(C-15),27.7(C-16),55.7(C-17),19.0(C-18),16.7(C-19),39.3(C-20),21.1(C-21),135.0(C-22),132.5(C-23),42.9(C-24),33.1(C-25),20.0(C-26),19.7(C-27),17.7(C-28)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[27]基本一致,化合物15 鑒定為ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one。

    4 生物活性測(cè)定

    4.1 抗腫瘤活性測(cè)定

    以阿霉素(上海愛(ài)研化工科技有限公司,批號(hào):AYCB1087)為陽(yáng)性對(duì)照,測(cè)試了化合物3~6和11 ~13 對(duì)兩種肝癌細(xì)胞(HepG2 和SMMC-7721)的增殖抑制活性。首先將HepG2和SMMC-7721 細(xì)胞株在含10%新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中,于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的兩種肝癌細(xì)胞,以1×104個(gè)細(xì)胞/孔接種于96 孔板,貼壁培養(yǎng)24 h 后。每孔分別加入2 μL 待測(cè)化合物,陰性對(duì)照組和空白組分別加入等體積DMSO 和培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h 后,再加入20 μL MTT 溶液,繼續(xù)孵育4 h。棄去上清液,每孔加入150 μL DMSO,結(jié)晶充分溶解后,用酶標(biāo)儀在490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度值,并計(jì)算IC50值。

    結(jié)果顯示,只有化合物12 對(duì)SMMC7721細(xì)胞顯示出較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性(IC50=0.338 μmol·L-1),其活性相當(dāng)于陽(yáng)性對(duì)照阿霉素(IC50=0.3 μmol·L-1),其余化合物在測(cè)試的最大濃度下(≥80 μmol·L-1)均未顯示出增殖抑制活性。

    4.2 抗菌活性測(cè)定

    以萬(wàn)古霉素(上海麥克林生化科技有限公司,批號(hào):V871983)為陽(yáng)性對(duì)照,參考美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(CLSI20150)標(biāo)準(zhǔn),采用96 孔板二倍稀釋法測(cè)試化合物3 ~6 和11 ~14對(duì)MRSA 及Escherichia coli的最低抑菌濃度(MIC)值。結(jié)果顯示,僅化合物12 對(duì)MRSA 顯示出較好的抑制活性(MIC=6.25 μg·mL-1),其余化合物在測(cè)試的最大質(zhì)量濃度下(≥ 50 μg·mL-1)對(duì)MRSA 及Escherichia coli均未顯示出抑制活性。

    5 結(jié)果與討論

    植物內(nèi)生真菌具有普遍性和多樣性,自然界幾乎所有的植物組織中均含有內(nèi)生真菌,其參與植物生長(zhǎng)過(guò)程中的重要環(huán)節(jié),不僅能代謝產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的代謝產(chǎn)物,自身還能生成許多活性代謝物,是活性先導(dǎo)化合物的重要來(lái)源。

    本研究從美麗薄子木植物內(nèi)生真菌Rhytidhysteronsp.BZM-9 乙酸乙酯提取物中共分離鑒定出15 個(gè)化合物,包括6 個(gè)酚酸類、4 個(gè)苯酞類、3 個(gè)色原酮、1 個(gè)吲哚生物堿及1 個(gè)甾體,以上所有化合物均為首次從該屬真菌中分離得到。活性測(cè)試結(jié)果顯示化合物12 可能為抗菌或抗腫瘤藥物開(kāi)發(fā)提供先導(dǎo)化合物。以上研究結(jié)果不僅豐富了Rhytidhysteron屬真菌化學(xué)成分多樣性,也為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)美麗薄子木內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物提供一定的研究基礎(chǔ)。

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