薄葉卷柏內(nèi)生真菌Clonostachys rogersoniana次生代謝產(chǎn)物研究

彭偉偉，曠敏，許立，鄭雨婷，桑子煥，秦思雨，鄒振興*（1.中南大學(xué)湘雅藥學(xué)院，長沙 410013；2.慢病診療小分子藥物發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)化湖南省重點實驗室，長沙 410013）

內(nèi)生真菌普遍存在于植物的內(nèi)部組織中[1]。常見的內(nèi)生真菌有助于植物克服非生物因素（高溫和鹽度、干旱、金屬毒性和光）以及生物因素（草食動物、昆蟲、線蟲和病原體）的有害影響以更好地生存[2]。在植物內(nèi)生真菌和植物宿主的共生環(huán)境中，內(nèi)生真菌一方面從植物宿主吸收自己所需的營養(yǎng)物質(zhì)，另一方面在代謝過程中產(chǎn)生一系列活性物質(zhì)促進(jìn)植物生長發(fā)育，使植物宿主抵抗外界不利影響[3]。這些次生代謝產(chǎn)物在醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)應(yīng)用等方面有極大的價值[4]。然而，許多內(nèi)生真菌種群在這方面仍未被研究，這意味著植物內(nèi)生真菌仍然是值得我們繼續(xù)探索，為尋找結(jié)構(gòu)新穎、活性顯著的天然產(chǎn)物的資源寶庫。

薄葉卷柏（Selaginella delicatula）為卷柏科卷柏屬植物，具有活血調(diào)血、清熱解毒等功效。目前從該屬植物中分離得到的化學(xué)成分超過300個[5]，結(jié)構(gòu)類型涉及雙黃酮類[6]、木脂素類、生物堿類以及炔酚類[7]等，部分化合物表現(xiàn)出良好的生物活性，如細(xì)胞毒活性[8]、抗炎活性[9]、抗菌活性[10]以及抗氧化作用[11]等。然而目前針對該科屬植物內(nèi)生真菌的研究鮮有報道。課題組前期從薄葉卷柏根部分離篩選得到一株具有較好抗菌活性的內(nèi)生真菌，經(jīng)過ITS 鑒定該菌株為Clonostachys rogersoniana，其大米發(fā)酵粗提物對Staphylococcus aureus和MRSA（methicillinresistantStaphylococcus aureus）有較好的抑制活性（MIC值均為1 mg·mL－1）。為了挖掘Clonostachys rogersoniana的抗菌活性代謝產(chǎn)物，本研究進(jìn)一步對其進(jìn)行放大發(fā)酵，運用多種現(xiàn)代色譜和光譜技術(shù)，從中分離鑒定得到11 個單體化合物（結(jié)構(gòu)式見圖1）。

圖1 化合物1 ～11 的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig 1 Chemical structures of compounds 1 ～11

1 材料

Agilent 1290 型高效液相色譜-Agilent 6500 series Q-TOF 質(zhì)譜聯(lián)用儀、Agilent 1100 半制備型液相色譜儀（美國安捷倫公司）；Bruker AV-400/AV-500/AV-600 型核磁共振儀（德國Bruker 公司）；Agela Innoval ODS-2 半制備色譜柱（10 mm×250 mm，10 μm）；安東帕旋光儀MCP 500（奧地利安東帕有限公司）；SQP 電子分析天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；Sephadex LH-20 葡聚糖凝膠（美國GE 公司）；ODS 反相C18填料（日本YMC 公司）；80 ～100 目、200 ～300 目柱層析硅膠（青島海洋化工有限公司）；EYELAN-1100S-W旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本東京理化器械株式會社）；所用試劑均為分析純?？咕鷮嶒炈玫募?xì)菌材料（Staphylococcus aureusATCC29213，Enterobacter faecalisATCC29212，Pseudomonas aeruginosaATCC27853 和Escherichia coliATCC25922）由中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院提供。萬古霉素（批號：V871983，規(guī)格：250 mg）、硫酸阿米卡星（批號：A837351，規(guī)格：1 g）（上海麥克林生化科技有限公司）。

薄葉卷柏植株于2019年采摘自湖南省常德市石門縣壺瓶山，由湘雅藥學(xué)院徐康平副教授鑒定為卷柏屬植物薄葉卷柏（Selaginella delicatula）。該實驗菌株分離自薄葉卷柏根部，委托擎科生物有限公司進(jìn)行ITS 測序，鑒定為粉紅螺旋聚孢霉（Clonostachys rogersoniana）。目前菌種保存于中南大學(xué)湘雅藥學(xué)院天然藥物化學(xué)教研室（菌種保存編號為Clonostachys rogersonianaBYJB-1）。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌株培養(yǎng)與發(fā)酵

將目標(biāo)菌株接種至液體培養(yǎng)基中，置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)搖床5 d（180 r·min－1，28℃），得到種子液，將種子液接種到500 mL 錐形瓶內(nèi)（每瓶加入200 g 大米，200 mL 超純水，于121 ℃高壓蒸汽滅菌25 min 并冷卻至室溫），于28℃恒溫條件下靜置培養(yǎng)28 d。

2.2 發(fā)酵產(chǎn)物的分離純化

Clonostachys rogersoniana的大米發(fā)酵物用乙酸乙酯浸提，提取3 次，每次2 d。合并提取液減壓濃縮得到浸膏32 g，浸膏經(jīng)硅膠柱層析（200 ～300 目），依次用石油醚-乙酸乙酯（1∶0、10∶1、5∶1、2∶1、1∶1、0∶1）、 乙酸乙酯-甲醇（100∶1 ～0∶1）梯度洗脫得到5個組分（Fr.1 ～Fr.5）。Fr.2（6.5 g）經(jīng)反相柱層析，以甲醇-水（5∶95 ～100∶0）梯度洗脫得到8 個組分（Fr.2-1 ～Fr.2-8）。Fr.2-7 經(jīng)過反復(fù)重結(jié)晶純化得到化合物10（20.7 mg）。Fr.2-8 經(jīng)過反復(fù)重結(jié)晶純化得到化合物11（5.6 mg）。Fr.2-5 經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠柱層析，半制備型高效液相色譜（20%～50%乙腈洗脫30 min，2 mL·min－1）純化得到化合物9（29.8 mg）。Fr.2-2 經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠柱層析，半制備型高效液相色譜（20%～30%乙腈洗脫40 min，2 mL·min－1）純化得到化合物5（8.0 mg）、6（12.3 mg）、7（13.2 mg）和8（9.4 mg）。Fr.3（3.5 g）經(jīng)反相柱層析，以甲醇-水（5∶95 ～100∶0）梯度洗脫得到6 個組分（Fr.3-1 ～Fr.3-6）。Fr.3-2 經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析，半制備型高效液相色譜（15%～25%乙腈洗脫30 min，2 mL·min－1）純化得到化合物1（4.7 mg）。Fr.3-3經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠柱層析，半制備型高效液相色譜（25%～35%乙腈洗脫30 min，2 mL·min－1）純化得到化合物2（4.1 mg）、3（4.6 mg）和4（6.2 mg）。

2.3 結(jié)構(gòu)確證

化合物1：白色粉末（甲醇），易溶于甲醇。HR-ESI-MS 顯示m/z176.0715 [M ＋H]＋，提示分子式為：C10H9NO2（calcd.for C10H10NO2，176.0712）。1H-NMR（500 MHz，DMSO-d6）δH：10.77（1H，s，-COOH），7.55（1H，d，J＝8.0 Hz，H-4），7.31（1H，d，J＝8.0 Hz，H-7），7.19（1H，s，H-2），7.02（1H，t，J＝7.0 Hz，H-6），6.93（1H，t，J＝7.0 Hz，H-5），3.44（2H，s，H-8）；13C-NMR（125 MHz，DMSO-d6）δC：118.3（C-2），128.3（C-3），111.3（C-3a），119.6（C-4），120.1（C-5），123.7（C-6），111.5（C-7），136.5（C-7a），34.9（C-8），178.9（C-9）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報道基本一致，故鑒定為indole-3-acetic acid。

化合物2：黃色油狀液體（甲醇），易溶于二氯甲烷和甲醇。HR-ESI-MS 顯示m/z203.1176 [M ＋H]＋，提示分子式為：C12H14N2O（calcd.for C12H15N2O，203.1184）。1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δH：10.80（1H，s，H-1），7.93（1H，s，H-12），7.54（1H，d，J＝7.8 Hz，H-4），7.32（1H，d，J＝7.8 Hz，H-7），7.14（1H，s，H-2），7.06（1H，t，J＝7.2 Hz，H-6），6.97（1H，t，J＝7.2 Hz，H-5），3.30（2H，t，J＝7.8 Hz，H-11），2.80（2H，t，J＝7.8 Hz，H-10），1.80（3H，s，H-14）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δC：121.4（C-2），112.3（C-3），118.7（C-4），118.7（C-5），123.0（C-6），111.8（C-7），136.7（C-8），127.7（C-9），25.7（C-10），39.9（C-11），169.5（C-13），23.2（C-14）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報道基本一致，故鑒定為N-acetyltryptamine。

化合物3：黃色油狀液體（甲醇），易溶于二氯甲烷和甲醇。HR-ESI-MS 顯示m/z231.1135 [M ＋H]＋，提示分子式為：C13H14N2O2（calcd.for C13H15N2O2，231.1134）。 － 108°（c0.3，MeOH）。1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δH：11.02（1H，s，-COOH），7.43（1H，d，J＝7.8 Hz，H-4），7.32（1H，d，J＝7.8 Hz，H-7），7.07（1H，t，J＝7.8 Hz，H-6），6.99（1H，t，J＝7.8 Hz，H-5），3.54（1H，dd，J＝4.8，12 Hz，H-8a），3.11（1H，dd，J＝4.8，12 Hz，H-8b），4.45（1H，q，J＝6.6 Hz，H-11），2.73（1H，t，J＝12 Hz，H-9），1.58（3H，d，J＝6.6 Hz，H-12）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δC：133.5（C-2），107.4（C-3），126.7（C-3a），118.4（C-4），119.2（C-5），121.7（C-6），111.6（C-7），136.8（C-7a），24.1（C-8），58.3（C-9），49.5（C-11），17.9（C-12），169.5（-COOH）。 以上NMR 及旋光數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報道基本一致，故鑒定為（1S，3S）-1-methyl-2，3，4，9-tetrahydro-1H-pyrido[3，4-b]indole-3-carboxylic acid。

化合物4：黃色油狀液體（甲醇），易溶于二氯甲烷和甲醇。HR-ESI-MS 顯示m/z231.1139 [M ＋H]＋，提示分子式為：C13H14N2O2（calcd.for C13H15N2O2，231.1134）。 － 75°（c0.3，MeOH）。1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δH：11.02（1H，s，-COOH），7.43（1H，d，J＝7.8 Hz，H-4），7.32（1H，d，J＝7.8 Hz，H-7），7.07（1H，t，J＝7.8 Hz，H-6），6.99（1H，t，J＝7.8 Hz，H-5），3.54（1H，dd，J＝4.8，12 Hz，H-8a），3.11（1H，dd，J＝4.8，12 Hz，H-8b），4.45（1H，q，J＝6.6 Hz，H-11），2.73（1H，t，J＝12 Hz，H-9），1.58（3H，d，J＝6.6 Hz，H-12）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δC：133.5（C-2），107.4（C-3），126.7（C-3a），118.4（C-4），119.2（C-5），121.7（C-6），111.6（C-7），136.8（C-7a），24.1（C-8），53.4（C-9），46.7（C-11），17.9（C-12），170.5（-COOH）。 以上NMR 及旋光數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報道基本一致，故鑒定為（1R，3S）-1-methyl-2，3，4，9-tetrahydro-1H-pyrido[3，4-b]indole-3-carboxylic acid。

化合物5：白色粉末（甲醇），易溶于甲醇。HR-ESI-MS 顯示m/z167.0708 [M ＋H]＋，提示分子式為：C9H10O3（calcd.for C9H11O3，167.0708）。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δH：9.34（1H，s，-COOH），7.05（2H，d，J＝8.4 Hz，H-2，6），6.71（2H，d，J＝8.4 Hz，H-3，5），3.60（3H，s，-OCH3），3.53（2H，s，H-7）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δC：130.7（C-1），124.9（C-2/6），115.6（C-3/5），156.7（C-4），39.8（C-7），172.5（C-8），52.0（-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報道基本一致，故鑒定為4-methoxyphenylacetic acid。

化合物6：白色粉末（甲醇），易溶于甲醇。HR-ESI-MS 顯 示m/z139.0386 [M ＋H]＋，提示分子式為：C7H6O3（calcd.for C7H7O3，139.0395）。1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δH：7.78（2H，d，J＝8.4 Hz，H-3/5），6.79（2H，d，J＝7.8 Hz，H-2/6）。通過高分辨質(zhì)譜分析，和對照品進(jìn)行TLC 分析，以及和文獻(xiàn)[17]氫譜數(shù)據(jù)對比，判斷化合物6 為4-hydroxybenzoic acid。

化合物7：白色粉末（甲醇），易溶于甲醇。HR-ESI-MS 顯示m/z111.0442 [M ＋H]＋，提示分子式為：C6H6O2（calcd.for C6H7O2，111.0446）。1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δH：7.04（2H，d，J＝8.0 Hz，H-3/5），6.69（2H，d，J＝7.6 Hz，H-2/6）。通過高分辨質(zhì)譜分析，和對照品進(jìn)行TLC 分析，以及和文獻(xiàn)[18]氫譜數(shù)據(jù)對比，判斷化合物7 為hydroquinone。

化合物8：白色粉末（甲醇），易溶于甲醇。HR-ESI-MS 顯示m/z153.0549 [M ＋H]＋，175.0365 [M ＋Na]＋，170.0813 [M ＋NH4]＋， 提示分子式為：C8H8O3（calcd.for C8H9O3，153.0552，C8H8O3Na，175.0371，C8H8O3NH4，170.0812）。1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δH：7.04（2H，d，J＝8.4 Hz，H-3/5），6.77（2H，d，J＝8.0 Hz，H-2/6），3.44（2H，s，H-7）。通過高分辨質(zhì)譜分析、與對照品進(jìn)行TLC 對比分析以及與文獻(xiàn)[19]氫譜數(shù)據(jù)對比分析，判斷化合物8 為4-hydroxyphenylacetic acid?；衔?：白色粉末（甲醇），易溶于甲醇。HRESI-MS 顯示m/z285.1349 [M ＋H]＋，提示分子式為：C14H20O6（calcd.for C14H21O6，285.1338）。＋103°（c0.1，MeOH）。1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δH：6.67（1H，dd，J＝4.2，15.6 Hz，H-12），6.48（1H，dd，J＝8.4，15.6 Hz，H-4），5.92（1H，dd，J＝1.2，16.2 Hz，H-5），5.78（1H，dd，J＝1.8，16.2 Hz，H-13），5.69（1H，d，J＝6.0 Hz，3-OH），5.05（1H，d，J＝4.6 Hz，11-OH），5.02（1H，m，H-2），4.72（1H，m，H-11），4.46（1H，m，H-3），3.96（1H，m，H-8），1.82（1H，m，H-10a），1.57（1H，m，H-10b），1.44（2H，m，H-9），1.33（3H，d，J＝6.6 Hz，H-15），1.13（3H，d，J＝6.6 Hz，H-16）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δC：71.2（C-2），74.8（C-3），147.5（C-4），123.4（C-5），164.7（C-6），69.1（C-8），25.6（C-9），28.1（C-10），68.1（C-11），152.8（C-12），119.9（C-13），164.9（C-14），17.5（C-15），17.2（C-16）。以上NMR 及旋光數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]報道基本一致，故鑒定為clonostachydiol。

化合物10：白色粉末（甲醇），易溶于甲醇。HR-ESI-MS 顯示m/z317.2686 [M ＋H]＋，提示分子式為：C18H36O4（calcd.for C18H37O4，317.2692）。1H-NMR（500 MHz，DMSO-d6）δH：0.86（3H，t，J＝7.0 Hz，H-15），1.20～1.27（s，-CH2-），1.51（2H，m，H-3），2.28（2H，t，J＝7.5 Hz，H-2），3.36（1H，m，H-3'b），3.62（1H，m，H-3'a），3.90（1H，m，H-1'b），4.03（1H，m，H-1'a），4.61（1H，m，H-2'）；13C-NMR（125 MHz，DMSO-d6）δC：172.9（C-1），33.5（C-2），24.4（C-3），28.5（C-4），28.7（C-5），28.9（C-6），29.0（C-7），29.0（C-8），29.0（C-9），29.1（C-10），29.3（C-11），32.3（C-12），32.3（C-13），22.1（C-14），13.9（C-15），65.5（C-1'），69.31（C-2'），62.6（C-3'）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]報道基本一致，故鑒定為2，3-dihydroxypropyl pentadecanoate。

化合物11：白色粉末（甲醇），易溶于二氯甲烷和甲醇。HR-ESI-MS 顯示m/z577.4462 [M ＋H]＋， 提示分子式為：C35H60O6（calcd.for C35H61O6，577.4468）。1H-NMR（500 MHz，DMSO-d6）δH：0.66（3H，s，H-18），0.80（3H，d，J＝6.5 Hz，H-26），0.81（3H，d，J＝6.5 Hz，H-27），0.83（3H，t，J＝8.3 Hz，H-29），0.90（1H，m，H-9），0.92（3H，m，H-21），0.96（1H，m，H-24），1.03（1H，m，H-14），1.06（1H，m，H-22a），1.07（3H，s，H-19），1.04（1H，m，H-15a），1.09（1H，m，H-1a），1.12（1H，m，H-17），1.15（2H，m，H-23），1.19（1H，m，H-12a），1.21（2H，m，H-28），1.24（1H，m，H-16a），1.32（1H，m，H-22b），1.34（1H，m，H-20），1.43（1H，m，H-8），1.45（2H，m，H-11），1.53（1H，m，H-7a），1.57（1H，m，H-15b），1.59（1H，m，H-2a），1.64（1H，m，H-25），1.83（1H，m，H-16b），1.88（1H，m，H-1b），1.90（1H，m，H-2b），1.95（1H，m，H-7b），2.00（1H，m，H-12b），2.24（1H，m，H-4a），2.39（1H，m，H-4b），3.22（1H，t，J＝8.3 Hz，H-20），3.27（1H，m，H-50），3.35（1H，m，H-40），3.38（1H，m，H-30），3.57（1H，m，H-3），3.70（1H，dd，J＝12.0，5.1 Hz，H-6a），3.81（1H，dd，J＝12.0，2.6 Hz，H-6b），4.38（1H，d，J＝7.8 Hz，H-10），5.36（1H，m，H-6）；13C-NMR（125 MHz，DMSO-d6）δC：36.8（C-1），29.3（C-2），76.8（C-3），38.1（C-4），140.5（C-5），121.2（C-6），31.4（C-7），31.4（C-8），49.6（C-9），36.2（C-10），20.6（C-11），38.3（C-12），41.9（C-13），56.2（C-14），23.9（C-15），27.8（C-16），55.4（C-17），11.7（C-18），19.1（C-19），35.5（C-20），18.6（C-21），33.3（C-22），25.4（C-23），45.1（C-24），28.7（C-25），19.7（C-26），18.9（C-27），22.6（C-28），11.8（C-29），100.8（C-1'），73.51（C-2'），76.8（C-3'），70.1（C-4'），76.8（C-5'），61.1（C-6'）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22]報道基本一致，故鑒定為daucosterol。

2.4 抗菌活性評價

根據(jù)美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（CLSI）的M07-A9 方案，采用微量肉湯稀釋法[23]測定單體化合物對4 種常見的臨床致病菌（Staphylococcus aureus、Enterobacter faecalis、Pseudomonas aeruginosa和Escherichia coli）的體外抗菌活性。從新鮮的瓊脂平板中選擇3 ～5 個形態(tài)相同的供試菌菌落，轉(zhuǎn)移到MHB（Mueller-Hinton Broth）培養(yǎng)基中，在225 r·min－1的搖瓶中以37℃的溫度培養(yǎng)，使細(xì)菌懸浮液 ≥ 0.5 麥克法蘭標(biāo)準(zhǔn)的濁度。對所制得的細(xì)菌懸浮液用含0.1 mg·mL－1刃天青的MHB 培養(yǎng)液稀釋至約1×106CFU·mL－1菌液。用生物級DMSO 溶解單體化合物，配成母液質(zhì)量濃度為1024 μg·mL－1。第一孔取25 μL 的母液，再取75 μL 肉湯，兩者混勻至第一孔質(zhì)量濃度為256 μg·mL－1；第二至第七孔依次從上一孔取50 μL 混合液和50 μL 肉湯逐級稀釋至質(zhì)量濃度為128、64、32、16、8、4 μg·mL－1，最后一孔加入肉湯50 μL，再向每一孔加入50 μL 菌液；最終每一孔質(zhì)量濃度依次為128、64、32、16、8、4、2、0 μg·mL－1。同時設(shè)置萬古霉素和硫酸阿米卡星為陽性對照，以DMSO 為溶劑對照。每組設(shè)3 次重復(fù)。96 孔培養(yǎng)板放置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 ～24 h。

抑菌實驗結(jié)果顯示化合物3 和4 對Staphylococcus aureus具有中等抑制活性（MIC值分別為16 和8 μg·mL－1）?；衔? ～11 在最大質(zhì)量濃度128 μg·mL－1下對Enterobacter faecalis、Pseudomonas aeruginosa和Escherichia coli均未顯示出抑菌活性。

3 討論

本文對薄葉卷柏內(nèi)生真菌Clonostachys rogersoniana大米發(fā)酵物開展了較為系統(tǒng)的化學(xué)成分研究，共分離得到11 個化合物，包括4 個生物堿（1 ～4），4 個酚酸類化合物（5 ～8），1 個大環(huán)內(nèi)酯（9），1 個脂肪酸類化合物（10）以及1 個甾體化合物（11）。對于化合物10，目前我們僅確定其平面結(jié)構(gòu)?？咕鷮嶒灲Y(jié)果顯示化合物3 和4 對Staphylococcus aureus具有中等抑制活性。本研究結(jié)果不僅豐富了菌株Clonostachys rogersoniana的化學(xué)成分多樣性，亦為薄葉卷柏內(nèi)生真菌的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了一定的實驗依據(jù)。