中藥炮制輔料膽汁質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

劉小鳴，王瑞生，任躍紅，張振凌，石延榜

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450008；3.河南省中藥特色炮制技術(shù)工程研究中心，河南 鄭州 450008；4.暨南大學(xué)，廣東 廣州 510000）

膽汁作為中醫(yī)傳統(tǒng)用藥，種類繁多，不僅可以單用，還是中藥炮制常用液體輔料之一。膽汁作為藥用輔料最早見(jiàn)于宋代《小兒藥證直訣》中牛膽汁制南星“臘月釀牛膽，陰干百日”[1]。通過(guò)查閱資料可知，中藥炮制輔料用膽汁主要為牛、豬、羊的新鮮膽囊汁[2]。膽汁性味苦寒，藥物與膽汁共制后，可增強(qiáng)藥物清肝明目、利膽通便的作用，且能降低藥物的毒性和燥性，從而達(dá)到“減毒增效”的目的。作為常用液體輔料，膽汁用量較大，但目前尚無(wú)規(guī)范的膽汁輔料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可供參考。僅1953年版《中華人民共和國(guó)藥典》[3]收載了牛膽汁浸膏，但在后來(lái)的藥典中并未沿用；1977年版《中華人民共和國(guó)藥典》[4]首次收載膽南星；1985年版《中華人民共和國(guó)藥典》[5]修訂了膽南星的用量和功能主治，并沿用至今，未見(jiàn)其他膽汁炮制品種[6]；2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》[7]僅在“人工牛黃”項(xiàng)下規(guī)定了其原料之一“牛膽粉”的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，未見(jiàn)炮制輔料用膽汁的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收錄。因此，膽汁輔料使用時(shí)無(wú)法可依，部分飲片生產(chǎn)企業(yè)使用的膽汁輔料質(zhì)量參差不齊，膽汁炮制飲片合格率無(wú)法保證，不利于中藥飲片的質(zhì)量管控，影響其臨床療效。因此，急需制訂科學(xué)合理的膽汁輔料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為膽汁和膽汁炮制品種的監(jiān)督管理和臨床規(guī)范化使用提供依據(jù)[8]。

本研究以中藥炮制輔料用膽汁為研究對(duì)象，收集不同批次的牛、豬、羊膽汁，對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量分析，包括性狀、理化和薄層鑒別，異性膽汁、相對(duì)密度、異性有機(jī)物和水分檢查及總膽酸含量測(cè)定，制訂膽汁輔料標(biāo)準(zhǔn)。此外，本研究采用膽汁發(fā)酵天南星，按照2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》對(duì)膽南星飲片進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，從而評(píng)價(jià)輔料膽汁質(zhì)量，旨在研究制訂膽汁質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為膽汁制中藥飲片臨床應(yīng)用的安全性和有效性提供依據(jù)，同時(shí)為中藥飲片炮制輔料膽汁質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 BCD-636WD11HPA型冰箱（海信容聲冰箱有限公司）；1200型冷藏柜（廣翔制冷設(shè)備有限公司）；BSA224S-CW型十萬(wàn)分之一分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；KQ-500DV型數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ATS4型全自動(dòng)薄層點(diǎn)樣儀（瑞士卡瑪公司）；DHG-9076A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；ZHPW-70型臺(tái)式恒溫振蕩培養(yǎng)箱、HWS-250型恒溫恒濕培養(yǎng)箱（天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司）；HH-S.6S型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州市華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司）；B1-233型生物顯微鏡（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）；UV-3200S型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；UPT-Ⅱ-10T型優(yōu)普系列超純水器（成都超純科技有限公司）；114B型搖擺式高速中藥粉碎機(jī)（瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司）。

1.2 試劑 膽酸對(duì)照品（批號(hào)：T16J8Q28663，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%）、牛磺膽酸鈉對(duì)照品（批號(hào)：M02J9E52008，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%）、牛膽粉對(duì)照藥材（批號(hào)：K04D11B133100，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%）均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；豬膽粉對(duì)照藥材（批號(hào)：V6NB-SRDE，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%）、羊膽粉對(duì)照藥材（批號(hào)：ZJWJ-WXA8，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；硅膠G板（批號(hào)：20190307）、磷鉬酸（批號(hào)：20020916，分析純）均購(gòu)自青島海洋化工有限公司；硫酸（批號(hào)：20190521）、甲苯（批號(hào)：20090603）均購(gòu)自煙臺(tái)市雙雙化工有限公司；甲醇（批號(hào)：20201110，分析純）、冰醋酸（批號(hào)：20160822，分析純）、無(wú)水乙醇（批號(hào)：20200525，分析純）、95%乙醇（批號(hào)：20200525，分析純）、正丁醇（批號(hào)：20190415，分析純）均購(gòu)自天津市富宇精細(xì)化工有限公司；高活性干酵母粉（批號(hào)：12000813）購(gòu)自安琪酵母股份有限公司；糠醛（批號(hào)：C11893179，分析純）購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；水為蒸餾水由實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)制備。

1.3 材料 共收集牛膽15批、豬膽3批、山羊膽3批。天南星、虎掌南星各1批，具體樣品信息見(jiàn)表1。牛膽、豬膽、羊膽樣品均儲(chǔ)存于0 ℃以下的冰箱中。使用時(shí)取出膽囊，待其解凍完全，用潔凈的剪刀剪破膽囊擠出膽汁，倒入燒杯中使用。儲(chǔ)存時(shí)用保鮮膜封口放入冷藏柜中。

表1 膽汁和天南星樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀鑒別 運(yùn)用人體感官對(duì)21批膽汁樣品進(jìn)行鑒別，如用眼看、鼻聞、口嘗、手摸等方法。觀察所收集的膽汁樣品實(shí)際情況，參照各省市標(biāo)準(zhǔn)、規(guī)范，總結(jié)樣品的性狀特征。（見(jiàn)表2）試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)膽汁的顏色隨時(shí)間的變化可能有些許差異，根據(jù)觀察擬描述中藥炮制輔料用膽汁的性狀為：具有一定黏度的棕黃色至黃綠色或至綠褐色、半透明液體，氣微腥，味極苦。

表2 膽汁樣品性狀鑒別結(jié)果

2.2 理化鑒別 膽汁中含有大量膽汁酸，主要活性成分為膽酸類[9]。參照《遼寧省中藥材標(biāo)準(zhǔn)第二冊(cè)（2019年版）》[10]及文獻(xiàn)[11]中對(duì)牛膽汁的理化鑒別方式（Pettenkofer氏呈色反應(yīng)和Gregory-Pettenkofer氏反應(yīng)）進(jìn)行鑒別。取樣品5 mL置于試管中，滴加新制1%糠醛水溶液3～4滴，沿管壁慢慢加入1 mL濃硫酸，觀察現(xiàn)象；繼續(xù)滴加2 mL濃硫酸并充分振搖，觀察現(xiàn)象并拍照記錄。取樣品1滴置于帶塞試管中，加新制1%糠醛水溶液0.5 mL，再加45%硫酸溶液6 mL，振搖后于75 ℃水浴中加熱30 min。Pettenkofer氏呈色反應(yīng)結(jié)果顯示，沿管壁加入1 mL濃硫酸后試管上層均出現(xiàn)黃色絮狀物，下層顯紫色；繼續(xù)滴加2 mL濃硫酸并充分振搖，溶液均顯紫紅色，證明膽汁樣品中均含有膽汁酸類成分。Gregory-Pettenkofer氏反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示溶液均顯深藍(lán)色，證明膽汁樣品中均含有膽酸。

2.3 薄層鑒別 參照《遼寧省中藥材標(biāo)準(zhǔn)第二冊(cè)（2019年版）》[10]中對(duì)牛膽汁的薄層鑒別方法，以牛膽粉、豬膽粉、羊膽粉對(duì)照藥材以及膽酸對(duì)照品、?；悄懰徕c對(duì)照品作為對(duì)照，對(duì)3種膽汁分別進(jìn)行鑒別。取膽汁樣品各1 mL，分別置錐形瓶中，加甲醇15 mL，超聲處理40 min使其充分溶解，靜置，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。另精密稱取牛膽粉、豬膽粉、羊膽粉對(duì)照藥材，按照與供試品溶液制備相同的方法制成每1 mL含5 mg對(duì)照藥材的對(duì)照藥材溶液。再精密稱取膽酸對(duì)照品、?；悄懰徕c對(duì)照品，按照與供試品溶液制備相同的方法分別制成每1 mL含1 mg對(duì)照品的對(duì)照品溶液。15批牛膽汁以牛膽粉對(duì)照藥材、膽酸、?；悄懰徕c為對(duì)照；3批豬膽汁以豬膽粉對(duì)照藥材、膽酸對(duì)照品為對(duì)照；3批羊膽汁以羊膽粉對(duì)照藥材、膽酸對(duì)照品、牛磺膽酸鈉對(duì)照品為對(duì)照；吸取上述溶液各3 μL，分別點(diǎn)于3個(gè)不同的硅膠G薄層板上，以甲苯-冰醋酸-水（10∶10∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%磷鉬酸乙醇溶液，在105 ℃加熱約5 min至斑點(diǎn)顯色清晰。日光下觀察薄層色譜，發(fā)現(xiàn)15批牛膽汁供試品色譜中，均與牛膽粉對(duì)照藥材、膽酸對(duì)照品、牛磺膽酸鈉對(duì)照品在相同位置顯示相同的斑點(diǎn)；3批豬膽汁供試品色譜中，均與豬膽粉對(duì)照藥材、膽酸對(duì)照品在相同位置顯示相同的斑點(diǎn)；3批羊膽汁供試品色譜中，均與羊膽粉對(duì)照藥材和膽酸對(duì)照品、牛磺膽酸鈉對(duì)照品在相同位置顯示相同的斑點(diǎn)。（見(jiàn)圖1～3）

圖1 牛膽汁薄層鑒別圖

圖2 豬膽汁薄層鑒別圖

圖3 羊膽汁薄層鑒別圖

2.4 牛膽汁中的豬膽汁鑒別 2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》[7]規(guī)定膽南星的輔料用膽汁仍是牛膽汁、羊膽汁或豬膽汁，且3種膽汁輔料的應(yīng)用在各省市中藥飲片炮制規(guī)范中也未加以區(qū)分，但經(jīng)過(guò)市場(chǎng)調(diào)研，在實(shí)際生產(chǎn)中由于牛膽汁較稀有，常常被混入劣質(zhì)豬膽汁導(dǎo)致輔料質(zhì)量參差不齊、飲片質(zhì)價(jià)不一[12]。因此，在使用單一來(lái)源的膽汁輔料時(shí)建議區(qū)分開(kāi)來(lái)，可采用簡(jiǎn)單快速的薄層鑒別方法進(jìn)行豬膽汁檢查以保證牛膽汁的質(zhì)量。以豬膽粉和牛膽粉為對(duì)照藥材，按與供試品溶液制備相同的方法制成每1 mL含5 mg的對(duì)照藥材溶液。采用“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液并鑒別。日光下觀察薄層色譜，發(fā)現(xiàn)15批牛膽汁供試品色譜中，均與牛膽粉對(duì)照藥材在相同位置顯示相同顏色的斑點(diǎn)；豬膽粉對(duì)照藥材顯示的某些斑點(diǎn)并未在供試品的相同位置出現(xiàn)，說(shuō)明該15批牛膽汁中無(wú)豬膽汁摻雜。（見(jiàn)圖4）

圖4 豬膽汁檢查薄層色譜圖

2.5 相對(duì)密度檢查 由于純物質(zhì)的相對(duì)密度在特定條件下不改變，因此測(cè)定膽汁樣品的相對(duì)密度可在一定程度上反映藥品的純雜程度。參照2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》四部相對(duì)密度測(cè)定法（通則0601）比重瓶法測(cè)定室溫下膽汁的相對(duì)密度，結(jié)果見(jiàn)表3，相對(duì)密度在1.020～1.043的范圍內(nèi)。根據(jù)結(jié)果建議膽汁相對(duì)密度不得低于1.020。

2.6 異性有機(jī)物檢查 考慮到膽汁在收集加工過(guò)程中可能會(huì)存在人為增重而摻入其他異性雜質(zhì)如植物組織、動(dòng)物組織或淀粉等的汁液而影響膽汁的質(zhì)量，故設(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì)膽汁樣品進(jìn)行異性有機(jī)物檢查。取本品2 mL，離心，傾去上清液，取不溶物做成水裝片，置顯微鏡下觀察。膽汁樣品離心后的不溶物水裝片顯微觀察少見(jiàn)有圓形或橢圓形脂肪粒，并未見(jiàn)其他植物、動(dòng)物組織或淀粉粒等，證明膽汁樣品中均無(wú)異性有機(jī)物摻入。（見(jiàn)圖5）

圖5 膽汁異性有機(jī)物檢查脂肪粒顯微特征圖（×100）

2.7 水分檢查 按照2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》四部水分測(cè)定法（通則0832第二法）對(duì)21批膽汁進(jìn)行水分測(cè)定并據(jù)此制訂膽汁輔料的水分限度。水分含量為86.53%～94.00%。根據(jù)結(jié)果建議膽汁水分不得超過(guò)94.00%。（見(jiàn)表3）

表3 膽汁樣品水分、相對(duì)密度、膽酸含量測(cè)定結(jié)果

2.8 膽酸含量測(cè)定 膽汁酸及其鹽類是膽汁的主要有效成分，其中膽酸具有很強(qiáng)的生物活性，因此對(duì)膽汁輔料中的總膽酸含量進(jìn)行測(cè)定可對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行有效控制，保證臨床用藥的有效性。因膽汁中的膽汁酸及其鹽類化合物具有甾體的母核結(jié)構(gòu)，能與顯色劑產(chǎn)生穩(wěn)定的顏色反應(yīng)，顯色產(chǎn)物在紫外-可見(jiàn)光區(qū)有選擇性吸收[13-14]，因此，采用紫外-可見(jiàn)分光光度法對(duì)膽汁樣品中的總膽酸進(jìn)行含量測(cè)定。

2.8.1 供試品溶液的制備 精密吸取膽汁樣品0.25 mL，置50 mL量瓶中，加60%冰醋酸溶液適量，超聲處理5 min，用60%冰醋酸溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液，得供試品溶液。

2.8.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取膽酸對(duì)照品5.0mg，置10mL容量瓶中，加60%冰醋酸溶液使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含膽酸0.5 mg的對(duì)照品溶液。

2.8.3 方法學(xué)考察

2.8.3.1 線性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分別置具塞試管中，各管加入60%冰醋酸溶液稀釋成1.0 mL，再分別加新制1%糠醛水溶液1.0 mL，搖勻，在冰浴中放置5 min，精密加入10∶13的硫酸水溶液13 mL，混勻，在70 ℃水浴中加熱10 min，迅速移至冰浴中，放置2 min，以相應(yīng)的試劑為空白，照紫外-可見(jiàn)分光光度法，在605 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，濃度（X）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得膽酸回歸方程Y=1.419 6X+0.003 7，R2=0.999 5。結(jié)果表明膽酸在0.100 32～0.501 60 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。膽酸標(biāo)準(zhǔn)品線性關(guān)系測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 膽酸對(duì)照品吸光度-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.8.3.2 精密度試驗(yàn) 取質(zhì)量濃度為0.501 60 mg/mL的膽酸對(duì)照品溶液，測(cè)定其在605 nm處的吸光度，重復(fù)6次。結(jié)果表明膽酸的平均吸光度值為0.723，RSD為0.15%，表明儀器精密度良好。

2.8.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 選取N1號(hào)牛膽汁樣品，按“2.8.1”方法制備，將其在室溫下分別放置0、1、2、4、6、8 h，依次測(cè)定吸收度，結(jié)果不同時(shí)間吸光度的RSD為0.55%，表明供試品溶液在室溫下8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 隨機(jī)精密吸取N1號(hào)牛膽汁樣品6份，按“2.8.1”方法制備，分別測(cè)定吸光度。結(jié)果表明N1號(hào)牛膽汁所含膽酸平均含量為49.12 mg/mL，RSD為0.79%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取膽酸對(duì)照品一定量，置容量瓶中，加60%冰醋酸溶液使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含膽酸1 mg的對(duì)照品溶液；精密吸取已知含量的膽汁樣品6份，分為3組，按80%、100%和120%的比例分別加入膽酸對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為1 mg/mL）一定量，按上述測(cè)定樣品吸光度方法測(cè)定，計(jì)算含量，按公式（1）計(jì)算回收率。結(jié)果表明樣品中膽酸的平均加樣回收率為101.19%，RSD為1.78%，表明加樣回收率良好，該方法可靠。

2.8.4 膽酸含量測(cè)定 精密吸取膽汁樣品一定量，置50 mL量瓶中，加60%冰醋酸溶液適量，超聲處理5 min，用60%冰醋酸溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液各1 mL，分別置甲、乙兩個(gè)具塞試管中，于甲管中加新制1%糠醛水溶液1 mL，乙管中加水1 mL作空白，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法，自“在冰浴中放置5 min”起，依法測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中含膽酸的濃度，計(jì)算，即得。結(jié)果表明膽酸含量為5.20～75.16 mg/mL。按最低含量的90%計(jì)算，建議膽汁中總膽汁酸含量以膽酸計(jì)不得低于4.68mg/mL。（見(jiàn)表3）

2.9 膽汁發(fā)酵南星方法 2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定膽南星的原料為制天南星細(xì)粉和牛膽汁、羊膽汁、豬膽汁，或?yàn)樯炷闲羌?xì)粉與牛膽汁、羊膽汁、豬膽汁[7]。本試驗(yàn)選擇后者，設(shè)計(jì)以傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)為基礎(chǔ)，對(duì)天南星和虎掌南星分別進(jìn)行發(fā)酵，按照2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》對(duì)成品進(jìn)行鑒別，從而評(píng)價(jià)膽汁樣品質(zhì)量。膽南星發(fā)酵工藝如下：將天南星、虎掌南星冷水泡至透心，切薄片，60 ℃烘干制成粗粉，加入2%酵母粉、40%牛膽汁混勻，置淺盤中平鋪，放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱，溫度32 ℃，濕度75%，發(fā)酵至表面長(zhǎng)滿菌絲，取出，隔水蒸1～2 h，取出，切塊，置60 ℃烘箱中烘干，取出，制成粗粉，重復(fù)發(fā)酵2次，烘干即得膽南星成品。

2.9.1 性狀鑒別 膽南星成品為不規(guī)則塊狀，棕黑色，質(zhì)硬，氣微腥，味苦。

2.9.2 顯微鑒別 膽南星粉末呈淡黃棕色，水合氯醛透化片可見(jiàn)類圓形薄壁細(xì)胞，內(nèi)部充滿糊化淀粉粒；草酸鈣針晶束、螺紋導(dǎo)管和環(huán)紋導(dǎo)管多見(jiàn)。（見(jiàn)圖7）

圖7 膽南星粉末顯微鑒別特征圖 （×400）

2.9.3 理化鑒別 取成品粉末各0.2 g，加水5 mL，搖勻，濾過(guò)，取濾液2 mL置試管中，加新制1%糠醛水溶液0.5 mL，沿管壁加硫酸2 mL，兩液接界處即顯棕紅色環(huán)。

3 討論

對(duì)于中藥炮制輔料用牛膽汁的來(lái)源，目前在各地方標(biāo)準(zhǔn)、規(guī)范中規(guī)定不同，且在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中也無(wú)統(tǒng)一規(guī)定。在飲片炮制中，常因地取材。目前牛膽汁的主要來(lái)源為牛科動(dòng)物黃牛Bos taurus domesticus Gmelin或水牛Bubalus bubalis L.的膽汁。有文獻(xiàn)報(bào)道[15-16]指出，黃牛和水牛的膽汁化學(xué)成分指紋特征極其相似，其相對(duì)含量差異甚微。本試驗(yàn)收集了15批黃牛膽汁進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，具有一定的代表性。膽汁的性狀是根據(jù)收集到的樣品實(shí)際情況，進(jìn)行觀察與描述，與其他省份性狀描述大體一致。膽汁多為棕黃色或黃綠色，少部分牛膽汁為綠褐色或暗褐色；棕黃色或棕褐色的牛膽汁較黏稠，其試驗(yàn)結(jié)果顯示無(wú)水乙醇浸出物和有效成分膽酸的含量較高。此外，由于膽汁作為中藥炮制輔料直接以液體形式入藥，用于中藥飲片的膽汁制，以達(dá)到使某些中藥“減毒增效”的目的。因此，在制訂其輔料標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，不再單獨(dú)規(guī)定其性味與歸經(jīng)、功能與主治。

本試驗(yàn)重點(diǎn)研究了膽汁的鑒別、檢查與含量測(cè)定項(xiàng)。使用專屬性較強(qiáng)的薄層色譜法分別對(duì)膽汁進(jìn)行薄層鑒別，對(duì)辨別膽汁的來(lái)源有重要意義。有文獻(xiàn)研究[17-18]表明，新鮮膽汁制得的膽粉中主要含結(jié)合型膽汁酸類成分，如?；悄懰?、甘氨膽酸，僅有少量的膽酸和去氧膽酸成分，故增加膽粉對(duì)照藥材作為對(duì)照顯然較合適?！哆|寧省中藥材標(biāo)準(zhǔn)第二冊(cè)（2019年版）》中探索牛膽汁的薄層鑒別方法表明去氧膽酸的斑點(diǎn)只在剛剛顯色時(shí)可以見(jiàn)到，放置后變?yōu)槟：磺寤蛳?，因此本研究選用膽酸對(duì)照品和?；悄懰徕c對(duì)照品作為參照來(lái)鑒別樣品的真?zhèn)?。在檢查項(xiàng)中，設(shè)定的具體檢查項(xiàng)目有“牛膽汁中的豬膽汁”“相對(duì)密度”“異性有機(jī)物”“水分”的檢查，可有效控制膽汁的摻假現(xiàn)象。

膽汁中所含膽汁酸類成分的含量和種類較多，膽酸是其主要活性成分之一[19]。測(cè)定膽汁中膽酸含量的方法有紫外-可見(jiàn)分光光度法、比色法、薄層色譜掃描法、HPLC-UV、HPLCELSD、液質(zhì)聯(lián)用法等[20-23]。但由于不同動(dòng)物膽汁中膽酸的存在方式不同，故本試驗(yàn)采用較為簡(jiǎn)便、快速的紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定其總膽酸的含量，進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果證明該方法可行，可信度好。3種膽汁所含膽酸含量差別較大，以牛膽汁最多、羊膽汁次之、豬膽汁最少，為古人多用牛膽汁這一做法提供一定的科學(xué)依據(jù)。結(jié)合本研究結(jié)果，建議在膽汁中藥炮制輔料來(lái)源分級(jí)研究時(shí)將牛膽汁作為一級(jí)，豬膽汁、羊膽汁可作為統(tǒng)貨或再細(xì)分為二級(jí)、三級(jí)。關(guān)于膽汁作為中藥炮制輔料的用法用量，《中華人民共和國(guó)藥典》和各省市中藥飲片炮制規(guī)范中的規(guī)定均不統(tǒng)一。本試驗(yàn)參考相關(guān)資料結(jié)合課題組研究經(jīng)驗(yàn)采用發(fā)酵工藝制備膽南星，發(fā)酵原料選擇《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定原料天南星和虎掌南星，發(fā)酵原料配比為1∶1.2，周期為19 d。經(jīng)檢驗(yàn)，成品質(zhì)量符合2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定，表明膽汁樣品質(zhì)量合格。