潰結(jié)灌腸液Ⅱ改善潰瘍性結(jié)腸炎菌群結(jié)構(gòu)和炎癥機制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩查及實驗驗證*

陳 鵬，馬嘉澤，張加敏，胡俊杰，李萬里，程議樂，李曉柳，丁 康

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京中醫(yī)院，江蘇 南京 210000）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種發(fā)病機制尚不明確的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，主要臨床癥狀為反復(fù)發(fā)作或持續(xù)的腹瀉、腹痛、黏液血便伴里急后重等[1]。由于本病病程遷延難愈，癥狀反復(fù)發(fā)作，且目前為止仍無根治的藥物和方法，約30%的UC患者需行全結(jié)直腸切除術(shù)，具有很高的致殘率，給患者家庭及社會造成嚴重的經(jīng)濟壓力及醫(yī)療負擔(dān)[2-3]。中醫(yī)學(xué)通過辨證論治、整體觀念特色相結(jié)合治療UC，具有療效確切、作用范圍廣泛、副作用小等優(yōu)點，在誘導(dǎo)緩解、防止疾病復(fù)發(fā)、提高患者生活質(zhì)量等方面有明顯的優(yōu)勢[4-5]。近年來，越來越多的文獻開始報道UC與腸道菌群的關(guān)系，腸道菌群失衡在UC發(fā)生發(fā)展過程中的啟動和促進作用已達成共識[6]。許多天然藥物的化學(xué)成分（如酚酸類化合物）均可通過調(diào)節(jié)腸道菌群、炎癥因子緩解UC[7]。研究也發(fā)現(xiàn)對不同證型的UC患者辨證使用中藥復(fù)方均能夠有效調(diào)節(jié)腸道菌群失衡，修復(fù)腸道黏膜損傷[8]。

潰結(jié)灌腸液是國家級非物質(zhì)文化遺產(chǎn)“丁氏中醫(yī)診療法”的重要組成部分，作為南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京中醫(yī)院院內(nèi)中藥復(fù)方制劑，其療效確切[9-10]。潰結(jié)灌腸液Ⅱ由原方去除輕粉化裁而來，前期的臨床研究和基礎(chǔ)研究證明該藥治療UC療效明確，與潰結(jié)灌腸液原方相當(dāng)[11-12]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于系統(tǒng)生物學(xué)、基因組學(xué)、蛋白組學(xué)等學(xué)科理論，運用高通量組學(xué)數(shù)據(jù)分析、計算機模擬及網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫檢索等技術(shù)，揭示藥物-基因-靶點-疾病相互作用的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的整體性、系統(tǒng)性和綜合性與中藥多成分、多靶點、整體性的特點具有高度的相似性[13-14]。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩查潰結(jié)灌腸液Ⅱ改善UC菌群結(jié)構(gòu)及炎癥的主要成分和靶點，并以小鼠為研究對象，探究潰結(jié)灌腸液Ⅱ?qū)ζ暇厶橇蛩徕c鹽（DSS）造模小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)和炎癥因子的調(diào)節(jié)作用，從菌群平衡角度闡明其治療UC的機制及現(xiàn)代生物學(xué)內(nèi)涵。

1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩查潰結(jié)灌腸液Ⅱ改善UC菌群結(jié)構(gòu)和炎癥的主要活性成分和關(guān)鍵靶點

1.1 潰結(jié)灌腸液Ⅱ主要活性成分及作用靶點的搜集和校正利用TCMSP數(shù)據(jù)庫分別收集金銀花、地榆、白及、乳香、沒藥的主要活性成分，以Caco-2細胞滲透性≥-0.4、口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18為篩選條件[15-16]。對于人工牛黃、海螵蛸、珍珠粉、煅石膏、煅爐甘石5味動物或礦物類中藥，查閱相關(guān)文獻補充遺漏的有效成分。然后通過TCMSP數(shù)據(jù)庫和PubChem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得其2D分子結(jié)構(gòu)，利用Swiss Target Prediction 平臺（http://www.swisstargetprediction.ch/）預(yù)測主要化學(xué)成分作用的靶點。最后使用Uniprot數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）進行靶點信息比對和基因名稱校正。

1.2 UC的疾病靶點檢索和蛋白互相作用網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction network，PPI）的構(gòu)建 利用GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索UC和腸道菌群失衡相關(guān)疾病的靶點。將UC及腸道菌群失衡疾病靶點與藥物主要成分作用的靶蛋白取交集，用R軟件制作韋恩圖。將藥物成分-疾病交集基因數(shù)據(jù)上傳至String數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org）中構(gòu)建PPI圖。分別導(dǎo)出TSV文件，上傳至Cytoscape3.7.1，計算各主要蛋白之間的互作次數(shù)，并據(jù)此找到關(guān)鍵基因。

1.3 GO功能富集與KEGG通路富集分析 將上述交集基因數(shù)據(jù)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫（http://metascape.org）進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，并利用R軟件作圖。

1.4 活性成分-靶點-富集通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將潰結(jié)灌腸液Ⅱ的主要藥物成分、疾病交集基因、富集通路數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.7.1軟件，制作“活性成分-靶點-富集通路”網(wǎng)絡(luò)圖，并通過網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)分析得出關(guān)鍵化學(xué)成分。

2 動物實驗驗證

2.1 實驗動物 36只C57BL/6J雄性小鼠，SPF級，體質(zhì)量18～22 g，由杭州醫(yī)學(xué)院提供。動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（浙）2019-0002。飼養(yǎng)條件：室溫（22±2）℃，濕度50%～60%，明暗周期12 h，實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，可自由獲取食物和水。實驗經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗倫理委員會批準，實驗過程中對動物的操作和處理均嚴格按照南京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會有關(guān)章程進行，倫理批件號：202109A034。

2.2 藥物與試劑 葡聚糖硫酸鈉鹽（dextran sulfate sodium，DSS）（批號：60316ES60）購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；三氯甲烷（氯仿）（批號：10006818）購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；異丙醇（批號：1011101）購自上海申博化工有限公司；DEPC水（批號：R0021）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；RNA isolater Total RNA Extraction Reagent（批號：R401-01）、HiScript III RT SuperMix for qPCR（批號：R323）均購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

2.3 主要儀器 KZ-II型高速組織研磨儀（武漢塞維爾生物科技有限公司）；Micro 21R型高速冷凍離心機（賽默飛世爾科技有限公司）；DM500型光學(xué)顯微鏡（德國徠卡顯微系統(tǒng)）；CFX Connect熒光定量PCR儀（美國伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）。

2.4 造模與分組 使用DSS誘導(dǎo)構(gòu)建小鼠UC疾病模型[17]。采用隨機數(shù)字表法選取10只小鼠作為空白對照組，空白對照組小鼠自由飲水，其余26只小鼠均自由飲用5%葡聚糖硫酸鈉鹽（DSS）溶液7 d，監(jiān)測小鼠體質(zhì)量、糞便狀態(tài)和便血情況，評估小鼠疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI），小鼠出現(xiàn)腹瀉、便血、體質(zhì)量減輕等癥狀可視為UC急性期模型復(fù)制成功。造模死亡小鼠1只，造模成功率96.15%（25/26）。將造模成功小鼠按隨機數(shù)字表法選取10只小鼠作為給藥組，剩余15只小鼠作為模型對照組。

2.5 實驗給藥 根據(jù)非標(biāo)準體質(zhì)量動物的校正系數(shù)表[18]，人與22 g非標(biāo)準小鼠換算系數(shù)約為11.95，折算小鼠潰結(jié)灌腸液Ⅱ用量為4.2 g/kg。造模第5天時造模組小鼠體質(zhì)量明顯低于空白對照組（P＜0.05），視為UC急性期模型造模成功。從造模第6天起，給藥組小鼠給予4.2 g/kg潰結(jié)灌腸液Ⅱ灌腸，空白對照組和模型對照組小鼠給予等量生理鹽水灌腸，1次/d，連續(xù)灌腸5 d。給藥期間，模型對照組小鼠死亡2只。

2.6 觀察指標(biāo)

2.6.1 一般情況觀察 在整個研究過程中每日觀察、記錄各組小鼠一般情況及體質(zhì)量變化，一般情況主要包括精神狀態(tài)、活動狀態(tài)、食欲、排便等。

2.6.2 16S rDNA測序分析小鼠腸道菌群變化 研究第11天采用頸椎脫臼法處死各組小鼠，剖腹取出小鼠結(jié)腸組織，用直尺測量結(jié)腸長度并拍照記錄。沿腸道縱行剖開整段結(jié)腸，并收取結(jié)腸內(nèi)容物，其余結(jié)腸組織凍存于-80 ℃冰箱中。用預(yù)冷的生理鹽水沖洗結(jié)腸，濾紙吸干水分，觀察結(jié)腸黏膜炎癥情況及潰瘍數(shù)量。挑選病變嚴重處的潰瘍及附近的結(jié)腸黏膜組織保存于4%中性甲醛溶液中24 h，然后進行常規(guī)脫水、石蠟包埋，制成4 μm厚切片，HE染色固定，顯微鏡下觀察結(jié)腸黏膜，并拍照記錄。由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成16S rDNA測序分析小鼠腸道菌群，結(jié)合測序結(jié)果分析找到各組間微生物菌群的差異。

2.6.3 PCR檢測腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）mRNA及白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）mRNA表達 取小鼠結(jié)腸組織適量，加入RNA isolater Total RNA完成勻漿，按說明書提取總RNA。通過分光光度計計算RNA濃度，滿意后取樣品5 μg，進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。再取待測樣品cDNA按說明書配制成總體積為20 μL的PCR反應(yīng)體系，按95 ℃預(yù)變性5 min，進入循環(huán)95 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，進行40個循環(huán)。以參照基因GAPDH作為標(biāo)準，采用2-△△Ct法進行相對定量分析，引物序列見表1。

表1 引物序列表

2.6.4 腸道菌群與關(guān)鍵靶點的相關(guān)性分析 利用heatmap圖通過相關(guān)性數(shù)值可視化展示菌群與炎癥因子之間的關(guān)系，評估腸道菌群與關(guān)鍵靶點之間的相關(guān)性。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法通過Graphpad Prism 8軟件進行處理，計量資料以“均數(shù)±標(biāo)準差”表示，符合正態(tài)分布者，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗，不符合正態(tài)分布者，采用秩和檢驗，對于重復(fù)測量的數(shù)據(jù)，采用重復(fù)測量方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 主要藥物成分及其作用靶點 通過TCMSP搜集潰結(jié)灌腸液Ⅱ中金銀花、地榆、白及、乳香、沒藥主要化學(xué)成分，以O(shè)B≥30%，DL≥0.18為篩選條件，獲得金銀花主要化學(xué)成分17個，地榆7個，白及7個，乳香8個，沒藥43個；通過文獻挖掘補充記錄海螵蛸[19-20]主要成分17個，珍珠粉[21]主要成分19個，人工牛黃[22]主要成分6個，煅石膏[23]主要成分1個，煅爐甘石[24]主要成分2個。將通過TCMSP、Swiss Target Prediction預(yù)測的相關(guān)靶點映射到Uniprot進行蛋白標(biāo)準化命名，最終去重后得到891個靶蛋白。

3.2 蛋白互相作用網(wǎng)絡(luò) 通過R軟件將潰結(jié)灌腸液Ⅱ主要成分作用的891個靶蛋白和GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索的4 837個UC基因、87個腸道菌群失衡基因取交集，得到23個共有靶點。（見圖1）將23個共有靶點上傳至String數(shù)據(jù)庫進行靶點間的蛋白互作分析，物種選擇人類，置信度設(shè)定為＞0.4，隱藏沒有互作關(guān)系的靶蛋白，構(gòu)建PPI圖。（見圖2）基因蛋白互相作用網(wǎng)絡(luò)包含23個節(jié)點、132條邊，平均度值（Degree）為11.5。1個節(jié)點Degree代表與該節(jié)點相連的邊的條數(shù)，具體見表2。

圖1 潰結(jié)灌腸液Ⅱ與UC及腸道菌群失衡基因交集靶點韋恩圖

圖2 潰結(jié)灌腸液Ⅱ與UC 及腸道菌群失衡基因交集靶點PPI 圖

表2 交集靶點度值表

3.3 GO分析和KEGG分析 將上述23個交集基因數(shù)據(jù)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫，進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，并利用R軟件作圖。（見圖3～4）圖3中縱軸表示GO名稱，橫軸表示富集數(shù)量，綠色為分子功能，橙色為細胞組分，藍色為生物過程。在生物過程中，細胞因子產(chǎn)生的正向調(diào)節(jié)、血管生成的調(diào)節(jié)、血管發(fā)育的調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、對外部刺激反應(yīng)的正向調(diào)節(jié)等顯著富集；在分子功能中，細胞因子受體結(jié)合、受體配體活性、生長因子受體結(jié)合、細胞黏附分子結(jié)合、抗氧化活性等顯著富集；在細胞組分中，膜側(cè)、質(zhì)膜外側(cè)、內(nèi)吞囊泡、細胞頂端、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物等顯著富集。圖4中縱軸表示通路名稱，橫軸表示富集因子，氣泡顏色表示富集顯著性，氣泡大小表示富集數(shù)量。通過KEGG分析顯示，炎癥性腸病、IL-17信號通路、Th17細胞分化、TNF信號通路、NF-κB信號通路、Toll樣受體信號通路、C型凝集素受體信號通路、NOD樣受體信號通路、趨化因子信號通路、致病性大腸桿菌感染、沙門氏菌感染、志賀氏菌病等顯著富集。

圖3 潰結(jié)灌腸液Ⅱ與UC及腸道菌群失衡基因交集靶點GO分析

圖4 潰結(jié)灌腸液Ⅱ與UC 及腸道菌群失衡基因交集靶點KEGG 分析

3.4 活性成分-靶點-富集通路網(wǎng)絡(luò) 通過Cytoscape3.7.1軟件構(gòu)建活性成分-靶點-富集通路網(wǎng)絡(luò)，見圖5。圖中節(jié)點的大小表示Degree值。外圈正六邊形52個為獨有活性成分，內(nèi)圈正六邊形4個為共有化學(xué)成分，箭形20個為選取P＜0.05的富集通路，菱形23個為共有靶點。網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)分析得出各節(jié)點Degree值，前5的化學(xué)成分為槲皮素（quercetin）、β-谷甾醇（betasitosterol）、山奈酚（kaempferol）、木犀草素（luteolin）、豆甾醇（stigmasterol）。

圖5 活性成分-靶點-富集通路網(wǎng)絡(luò)圖

3.5 各組小鼠一般情況 實驗期間，空白對照組小鼠飲食、大便、精神狀態(tài)等一般情況均未見明顯異常。模型對照組和給藥組小鼠均逐漸出現(xiàn)精神萎靡、行動遲緩、腹瀉、便血、食欲減退等不適。

3.6 各組小鼠相對體質(zhì)量比較 以D0時小鼠體質(zhì)量為基礎(chǔ)體質(zhì)量，相對體質(zhì)量=當(dāng)天測量體質(zhì)量（g）/基礎(chǔ)體質(zhì)量（g）×100。造模前各組小鼠體質(zhì)量比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。造模第5天時造模組小鼠相對體質(zhì)量明顯低于空白對照組（P＜0.05），視為UC急性期模型造模成功。空白對照組小鼠在不同時間點相對體質(zhì)量變化比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），不存在時間效應(yīng)；模型對照組小鼠在造模開始后體質(zhì)量持續(xù)降低，于造模第10天達到最低值，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；給藥組小鼠在造模第7天前體質(zhì)量持續(xù)下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），造模第7天后體質(zhì)量逐漸上下波動，存在時間效應(yīng)。各組小鼠相對體質(zhì)量總體比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），即存在分組效應(yīng)；模型對照組小鼠在造模第5天后相對體質(zhì)量均低于空白對照組（P＜0.05）；給藥組小鼠在造模第8天后相對體質(zhì)量均高于模型對照組（P＜0.05）；時間因素與分組因素存在交互效應(yīng)（P＜0.05）。（見表3、圖6）

表3 各組小鼠相對體質(zhì)量比較 （±s）

表3 各組小鼠相對體質(zhì)量比較 （±s）

注:F時間主效應(yīng)=30.395，P時間主效應(yīng)=0.000；F分組主效應(yīng)=36.388，P分組主效應(yīng)=0.000；F交互效應(yīng)=7.224，P交互效應(yīng)=0.000；與空白對照組比較，aP＜0.05；與模型對照組比較，bP＜0.05

組別動物數(shù)（只） D0D1D2D3D4D5D6D7D8D9D10FP空白對照組10100±0.00 100.73±2.15 100.46±1.09 100.9±2.32 100.84±2.53 100.98±2.94 102.08±2.59 102.22±2.54 103.32±2.55 105.32±2.96 106.25±2.78 1.901 0.102模型對照組13100±0.00 102.52±1.45 102.23±1.21 101.41±1.54 100.99±1.82 95.89±2.01a 95.66±2.48a 90.71±3.61a 87.42±4.98a 83.67±4.89a 82.18±5.67a 26.331 0.000給藥組10100±0.00 103.01±1.48 101.41±2.76 101.32±2.14 101.12±1.71 96.35±2.60 95.57±2.0990.61±3.32 92.55±4.20b 90.78±6.00b 92.23±6.79b 25.445 0.000 F 5.0922.7490.2020.04713.45525.11944.42242.29258.44256.487 P 0.0120.0800.8180.9550.0000.0000.0000.0000.0000.000

圖6 體質(zhì)量交互效應(yīng)輪廓圖

3.7 各組小鼠結(jié)腸長度比較 模型對照組小鼠結(jié)腸長度明顯短于空白對照組（P＜0.05），給藥組小鼠結(jié)腸長度明顯長于模型對照組（P＜0.05）。（見圖7）

圖7 各組小鼠結(jié)腸長度比較 （±s）

3.8 各組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化情況 空白對照組小鼠結(jié)腸黏膜、腺體及隱窩結(jié)構(gòu)完整，無明顯炎癥細胞浸潤；模型對照組小鼠結(jié)腸黏膜損傷明顯，未見隱窩，存在大量炎癥細胞浸潤；給藥組小鼠結(jié)腸黏膜腺體及隱窩結(jié)構(gòu)清晰，伴少許炎癥細胞浸潤。（見圖8）

圖8 各組小鼠結(jié)腸黏膜組織病理改變情況（HE，×40）

3.9 各組小鼠結(jié)腸黏膜TNF-α mRNA、IL-1β mRNA相對表達量比較 模型對照組小鼠結(jié)腸黏膜TNF-α mRNA、IL-1β mRNA相對表達量均明顯高于空白對照組（P＜0.05）；給藥組小鼠結(jié)腸黏膜TNF-α mRNA、IL-1β mRNA相對表達量明顯低于模型對照組（P＜0.05）。（見圖9）

圖9 各組小鼠結(jié)腸黏膜TNF-α mRNA、IL-1β mRNA相對表達量比較 （±s）

3.10 小鼠腸道菌群變化情況 本研究中18個糞便樣本被用于16S rDNA測序，群落組成分析在不同分類學(xué)水平上統(tǒng)計各樣本的物種豐度，通過群落柱形圖直觀反映群落組成。由圖10可知，門水平下小鼠腸道菌群集中在厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）、脫硫桿菌門（Desulfobacterota）、疣微菌門（Verrucomicrobiota）、放線菌門（Actinobacteria）、梭桿菌門（Fusobacteriota）。與空白對照組比較，模型對照組變形菌門（0.05%→9.31%）、脫硫桿菌門（0.003%→2.72%）及梭桿菌門（0.00%→2.06%）豐度明顯降低（P＜0.01）；厚壁菌門（75.87%→55.46%）及疣微菌門（2.38%→0.14%）豐度明顯升高（P＜0.01）。潰結(jié)灌腸液Ⅱ干預(yù)后，給藥組小鼠腸道脫硫桿菌門（2.72%→1.51%）豐度降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而變形菌門（9.31%→1.13%）、梭桿菌門（2.06%→0.03%）豐度較模型組明顯降低；給藥組厚壁菌門（55.46%→68.61%）豐度增高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；給藥組疣微菌門（0.14%→0.54%）豐度較模型組明顯增高（P＜0.05）。（見圖11～12）結(jié)果提示潰結(jié)灌腸液Ⅱ能夠逆轉(zhuǎn)DSS誘導(dǎo)的UC小鼠模型腸道菌群結(jié)構(gòu)異常改變。

圖10 各組小鼠腸道菌群門水平表達水平

圖11 模型對照組和空白對照組小鼠腸道菌群門水平差異表達情況

圖12 模型對照組和給藥組小鼠腸道菌群門水平表達情況

與空白對照組比較，屬水平模型對照組小鼠腸道菌群中Clostridium_sensu_stricto_1（8.30%→22.33%）、Alistipe（s1.49%→16.81%）、擬桿菌屬（Bacteroides）（2.07%→10.94%）、大腸桿菌-志賀菌屬（Escherichia-Shigella）（0.003%→7.49%）、真桿菌屬（Eubacterium_fissicatena_group）（0.02%→3.27%）、Romboutsia（0.01%→2.10%）、脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）（0.003%→2.72%）、梭桿菌屬（Fusobacterium）（0%→2.06%）豐度明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）；螺旋桿菌屬（Turicibacter）（19.13%→6.05%）、norank_f__Muribaculaceae（17.06%→0.2%）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）（13.87%→2.52%）、norank_f__norank_o__Clostridia_UCG-014（8.56%→0.63%）、瘤胃球菌科未分類屬（unclassified_f__Ruminococcaceae）（5.98%→1.10%）、阿克曼菌屬（Akkermansia）（2.38%→0.14%）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）（1.75%→0.03%）豐度明顯降低（P＜0.01）。潰結(jié)灌腸液Ⅱ干預(yù)后，給藥組小鼠腸道大腸桿菌-志賀菌屬（Escherichia-Shigella）（7.49%→0.37%）、Fusobacterium（2.06%→0.03%）、UCG-005（0.52%→0.26%）、Clostridium_innocuum_group（0.47%→0.06%）、摩根氏菌屬（Morganella）（0.21%→0%）豐度明顯降低（P＜0.01）；乳酸桿菌屬（Lactobacillus）（2.52%→8.88%）、norank_f_Muribaculaceae（0.2%→3.47%）、瘤胃球菌科未分類屬（norank_f__Ruminococcaceae）（0.56%→1.57%）、Colidextribacter（0.41%→1.57%）、阿克曼菌屬（Akkermansia）（0.14%→0.54%）、毛螺菌科UCG-006屬（Lachnospiraceae_UCG-006）（0.09%→0.26%）、Anaeroplasma（0.02%→0.23%）、unclassified_c__Bacilli（0.05%→0.17%）、norank_f__norank_o_RF39（0.02%→0.18%）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）（0.03%→0.16%）豐度明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。（見圖13～15）結(jié)果提示潰結(jié)灌腸液Ⅱ可能是通過增加益生菌乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、norank_f__Muribaculaceae、阿克曼菌屬（Akkermansia）豐度、降低致病菌大腸桿菌-志賀菌屬（Escherichia-Shigella）、梭桿菌屬（Fusobacterium）豐度發(fā)揮治療作用。

圖13 各組小鼠腸道菌群屬水平表達情況

圖14 空白對照組和模型對照組小鼠腸道菌群屬水平表達情況

圖15 模型對照組和給藥組小鼠腸道菌群屬水平表達情況

進一步分析乳酸桿菌（Lactobacillus）、norank_f__Muribaculaceae、阿克曼菌屬（Akkermansia）、大腸桿菌-志賀菌屬（Escherichia-Shigella）、梭桿菌屬（Fusobacterium）等在小鼠腸道種水平變化情況，模型對照組小鼠uncultured_bacterium_g__norank_f__Muribaculaceae（17.06%→0.20%）、約氏乳桿菌（Lactobacillus_johnsonii）（10.18%→1.30%）、羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus_reuteri（2.01%→0.56%）、阿克曼菌（Akkermansia muciniphila）（2.38%→0.14%）豐度明顯降低（P＜0.01或P＜0.05），大腸桿菌（Escherichia_coli）（0.003%→7.49%）、潰瘍梭桿菌（Fusobacterium_ulcerans）（0%→2.06%）豐度明顯升高（P＜0.01）。潰結(jié)灌腸液Ⅱ干預(yù)后，給藥組小鼠腸道大腸桿菌（Escherichia_coli）（7.49%→0.37%）、潰瘍梭桿菌（Fusobacterium_ulcerans）（2.06%→0.03%）豐度明顯降低（P＜0.05），約氏乳桿菌（Lactobacillus_johnsonii）（1.30%→5.27%）、羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus_reuteri）（0.56%→2.14%）、uncultured_bacterium_g__norank_f__Muribaculaceae（0.2%→3.47%）、阿克曼菌（Akkermansia muciniphila）（0.14%→0.54%）豐度明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。（見圖16～17）

圖16 空白對照組和模型對照組小鼠腸道菌群種水平表達情況

圖17 模型對照組和給藥組小鼠腸道菌群種水平表達情況

3.11 小鼠腸道菌群與炎癥因子TNF-α、IL-1β相關(guān)性分析 小鼠腸道菌群在種水平uncultured_bacterium_g_norank_f__Muribaculaceae、約氏乳桿菌（Lactobacillus_johnsonii）、羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus_reuteri）、阿克曼菌（Akkermansia muciniphila）等益生菌豐度變化與TNF-α mRNA、IL-1β mRNA表達呈負相關(guān)；大腸桿菌（Escherichia_coli）、潰瘍梭桿菌（Fusobacterium_ulcerans）等致病菌豐度變化與TNF-αmRNA、IL-1β mRNA表達呈正相關(guān)。（見圖18）結(jié)果提示潰結(jié)灌腸液Ⅱ可能是通過增加益生菌uncultured_bacterium_g__norank_f__Muribaculaceae、約氏乳桿菌（Lactobacillus_johnsonii）、羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus_reuteri）、阿克曼菌（Akkermansia muciniphila）豐度、降低大腸桿菌（Escherichia_coli）、潰瘍梭桿菌（Fusobacterium_ulcerans）豐度，從而抑制TNF-α mRNA、IL-1β mRNA表達來降低炎癥反應(yīng)。

圖18 小鼠腸道菌群與關(guān)鍵炎癥因子TNF-α、IL-1β相關(guān)性分析

4 討論

中醫(yī)學(xué)并無“潰瘍性結(jié)腸炎”的病名記載，但其諸多臨床癥狀如腹痛、腹瀉、里急后重、黏液膿血便可散見于中醫(yī)古籍“腸澼”“飧泄”“下利”“痢疾”等疾病的相關(guān)論述中。本課題組總結(jié)“丁氏中醫(yī)診療法”代表傳人丁澤民教授學(xué)術(shù)思想和丁義江教授臨床經(jīng)驗，認為本病病位在大腸，表現(xiàn)為大腸“內(nèi)瘍”[25]。腸道是人體最龐大的微生態(tài)系統(tǒng)，健康個體的腸道菌群主要由擬桿菌門、厚壁菌門、放線菌門和變形菌門構(gòu)成，而環(huán)境、飲食及藥物等諸多因素都會引起腸道菌群的數(shù)量、種類、比例等一系列變化，造成腸道菌群失衡[26]。盡管腸道菌群失衡與UC發(fā)病因果關(guān)系尚無定論，但腸道菌群失衡是UC的顯著特征，主要體現(xiàn)在腸道菌群均度、豐度及多樣性的減少。

由于本病發(fā)病部位靠近體表，肛門最常受累，外用給藥方便，為中藥灌腸法提供了便利。中藥灌腸法在繼承中醫(yī)傳統(tǒng)外治法“導(dǎo)法”和中醫(yī)特色“辨證論治”思想的基礎(chǔ)上，憑借其簡效廉及安全性高的特點而應(yīng)用廣泛[27-28]。自1963年施漢章首用《景岳全書》玉關(guān)丸保留灌腸治療慢性潰瘍性結(jié)腸炎1例，此后中藥煎劑灌腸開始普遍用于治療本病。2017年《潰瘍性結(jié)腸炎中醫(yī)診療專家共識意見》肯定了中藥灌腸法治療UC的關(guān)鍵作用，并強調(diào)無論是直腸型、左半結(jié)腸型亦或廣泛結(jié)腸型UC均可采用中藥灌腸治療。

本研究顯示潰結(jié)灌腸液Ⅱ主要活性成分127個，改善UC菌群結(jié)構(gòu)及炎癥的關(guān)鍵活性成分中槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、木犀草素（luteolin）為天然黃酮類化合物，β-谷甾醇（beta-sitosterol）、豆甾醇（stigmasterol）為植物甾醇類化合物。HONG Z等[29]實驗表明槲皮素能通過減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)DSS誘導(dǎo)的腸炎小鼠腸道厚壁菌門的異常減少及變形菌門的異常增加，來發(fā)揮保護作用。QU Y F等[30]研究發(fā)現(xiàn)山奈酚能通過提高DSS誘導(dǎo)UC模型小鼠腸道厚壁菌門與擬桿菌門的比例，重塑腸道菌群來抑制脂多糖誘導(dǎo)的TLR4-NF-κB信號傳導(dǎo)，從而增加緊密蛋白ZO-1、occludin和claudin-1的水平，恢復(fù)腸黏膜屏障的完整性。LI B L等[31]報告了木犀草素干預(yù)能增加UC大鼠腸道擬桿菌屬和芽孢桿菌屬豐度，顯著緩解結(jié)腸損傷，抑制炎癥反應(yīng)。經(jīng)木犀草素處理后，腸道微生物群的結(jié)構(gòu)和組成也發(fā)生了改變。DING K等[32]指出β-谷甾醇能顯著上調(diào)DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎腸上皮細胞多種抗菌肽的表達水平，這些抗菌肽又能夠有效抑制炎癥反應(yīng)及傷寒沙門氏菌的生長，且該化合物具有低毒性特征。馮思敏等[33]比較了β-谷甾醇和豆甾醇對小鼠急性結(jié)腸炎的治療效果，發(fā)現(xiàn)豆甾醇在緩解癥狀、抑制炎癥方面效果優(yōu)于β-谷甾醇。

本研究中功能和通路富集分析提示腸道菌群失衡是UC免疫應(yīng)答異常的關(guān)鍵因素。富含微生物的腸道作為人體最大的內(nèi)分泌和免疫器官在應(yīng)激中起著重要的作用，尤其是氧化應(yīng)激反應(yīng)[34]。腸道菌群失調(diào)的相關(guān)疾病也往往與氧化應(yīng)激有關(guān)，腸道菌群的紊亂可能導(dǎo)致腸道活性氧自由基的過度生物利用，產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)[35-36]。在正常情況下，活性氧自由基具有殺菌作用，且參與腸道防御功能。但過量的活性氧自由基會打破機體調(diào)節(jié)氧化還原平衡的內(nèi)源性防御系統(tǒng)[37]。另外氧化應(yīng)激反應(yīng)還會觸發(fā)脂質(zhì)過氧化的鏈式反應(yīng)，造成DNA的損傷及蛋白質(zhì)的異常表達，刺激促炎性細胞因子產(chǎn)生，使結(jié)腸炎癥損傷不斷放大，導(dǎo)致結(jié)腸黏膜損害，甚至致癌[38]?；钚匝踝杂苫€能夠促進跨膜蛋白occludin的酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)緊密連接的完整性，導(dǎo)致ZO-1的解離，增加腸黏膜屏障細胞旁通透性[39]。腸黏膜機械屏障的損傷使得腸道內(nèi)的細菌及其代謝產(chǎn)物脂多糖能以跨細胞轉(zhuǎn)運的方式或自由通過細胞間隙的方式越過腸黏膜屏障入侵黏膜固有層，造成細菌移位[40]。細菌移位激活黏膜固有層的中性粒細胞，誘導(dǎo)黏膜發(fā)生異常炎癥反應(yīng)，和UC的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[41]。UC患者腸道有益共生菌的減少和機會致病菌的增多是菌群結(jié)構(gòu)失衡最典型的表現(xiàn)。先天免疫激活過程中，結(jié)腸上皮細胞與腸道黏膜中的細菌保持動態(tài)平衡的關(guān)系?；诩毦乖目焖僮R別Toll樣受體（Toll-like receptors，TLR）及NOD樣受體（NOD-like receptor,NLR），腸道中的細菌能刺激結(jié)腸上皮細胞和腸道淋巴組織發(fā)生局部和系統(tǒng)免疫應(yīng)答。在正常的腸道中，調(diào)節(jié)性T淋巴細胞能對腸道共生菌進行特異地識別并相互作用，從而維持著黏膜免疫的穩(wěn)態(tài)[42]。而募集于腸黏膜的淋巴細胞接受抗原刺激活化后分泌炎癥介質(zhì)，啟動炎癥反應(yīng)；另一方面致病菌活躍也會被固有免疫細胞識別、吞噬，誘發(fā)效應(yīng)性T細胞過度增殖，如輔助性T淋巴細胞Th17導(dǎo)致UC腸道黏膜炎癥發(fā)生介導(dǎo)免疫損傷[43]。

通過對23個靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)進行拓撲分析，TNF、IL-1β等靶點是潰結(jié)灌腸液Ⅱ改善UC菌群結(jié)構(gòu)及炎癥的關(guān)鍵靶點。TNF是巨噬細胞和單核細胞在急性炎癥過程中產(chǎn)生的炎癥細胞因子，參與炎癥、凋亡、淋巴細胞刺激和免疫細胞功能激活[44]。TNF可能通過活化NF-κB或AP-1轉(zhuǎn)錄因子來增強相關(guān)靶基因的表達，導(dǎo)致炎癥細胞在炎癥部位的聚集增多，進而啟動細胞毒性、凋亡和急性期反應(yīng)等過程來介導(dǎo)腸黏膜損傷[45]。目前TNF抑制劑已經(jīng)廣泛應(yīng)用于炎癥性腸病的治療，與傳統(tǒng)藥物相比取得了較好的治療效果[46]。IL-1β在UC受累黏膜中表達顯著高于未受累黏膜，且治療后IL-1β的含量明顯下降[47]。IL-1β在受累腸道能夠促進抗原提呈細胞的抗原表達，吸引中性粒細胞，引起IL-6、TNF-α等炎癥介質(zhì)釋放，使得炎癥細胞在受累腸道炎癥部位聚集[48-49]。為了驗證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果，本研究采用DSS誘導(dǎo)構(gòu)建UC小鼠模型。實驗結(jié)果表明潰結(jié)灌腸液Ⅱ能夠顯著改善小鼠體質(zhì)量減輕，減輕結(jié)腸長度縮短，促進腸黏膜愈合，減少炎癥細胞浸潤，抑制腸黏膜IL-1β和TNF-α的mRNA表達，提示潰結(jié)灌腸液Ⅱ治療DSS誘導(dǎo)UC模型小鼠療效顯著。

本研究通過16S rDNA測序發(fā)現(xiàn)潰結(jié)灌腸液Ⅱ能夠逆轉(zhuǎn)DSS誘導(dǎo)的UC模型小鼠腸道變形菌門、梭桿菌門及疣微菌門的異常改變，可能是通過增加益生菌約氏乳桿菌（Lactobacillus_johnsonii）、羅伊優(yōu)化桿菌（Lactobacillus_reuteri）、阿克曼菌曼菌（Akkermansia muciniphila）、uncultured_bacter ium_g_norank_f__Muribaculaceae豐度，降低致病菌大腸桿菌（Escherichia_coli）、潰瘍梭桿菌（Fusobacterium_ulcerans）豐度發(fā)揮治療作用。許多研究報告了UC患者和DSS誘導(dǎo)UC模型小鼠腸道菌群厚壁菌門數(shù)量減少及變形菌門數(shù)量增加的現(xiàn)象，這與我們的研究結(jié)果是一致的[50-51]。疣微菌門是1987年首次被發(fā)現(xiàn)，至1997年才被劃出一門的新細菌；在人類腸道黏液層中，其代表菌為阿克曼菌科阿克曼菌屬阿克曼菌（Akkermansia muciniphila，Akk）。Akk菌是疣微菌門的優(yōu)勢菌群，約占83%。進一步分析種水平發(fā)現(xiàn)本研究中給藥組和模型對照組在門水平的顯著差異即是潰結(jié)灌腸液Ⅱ干預(yù)后小鼠腸道阿克曼菌增長造成的，恰恰也是驗證了這一點。QU S W等[52]研究發(fā)現(xiàn)阿克曼菌能夠通過激活NLRP3緩解DSS誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎。乳桿菌屬在食物中廣泛分布，為一類能夠通過發(fā)酵產(chǎn)生乳酸的革蘭氏陽性菌，包括100多個種和亞種，如羅伊氏乳桿菌、約氏乳桿菌等[53]。本研究中潰結(jié)灌腸液Ⅱ能夠顯著增加小鼠腸道種水平羅伊氏乳桿菌、約氏乳桿菌豐度，這與DONG L等[54]研究結(jié)果相同。伊氏乳桿菌及約氏乳桿菌能夠抑制促炎基因表達和恢復(fù)小鼠腸道微生物群，恢復(fù)緊密連接完整性，從而發(fā)揮抗炎作用[55-56]。KRISHNA M等[57]發(fā)現(xiàn)小鼠母體分娩前及哺乳期補充羅伊氏乳桿菌和約氏乳桿菌可改變小鼠腸道微生物群，并保護雌性后代免受實驗性結(jié)腸炎的影響，為圍產(chǎn)期利用益生菌對抗UC的發(fā)展?jié)摿Φ於嘶A(chǔ)。Muribaculaceae在維持腸黏液層屏障功能中具有積極作用[58]。大腸桿菌屬志賀氏菌屬主要通過破壞腸黏膜通透性，增加出血發(fā)揮致病作用。本研究中DSS誘導(dǎo)UC小鼠模型腸道中大腸桿菌屬-志賀氏菌屬大腸桿菌豐度顯著增加。大腸桿菌能夠在易感宿主的腸道中長期定殖，分泌α-溶血素促進UC的發(fā)展，引發(fā)樹突狀細胞的死亡，刺激促炎細胞因子TNF-α、IL-6和IL-23的表達，損傷緊密連接蛋白occludin，破壞Caco-2細胞中的緊密連接，增加屏障通透性[59]。梭桿菌屬定殖于人體口腔和腸黏膜，具有侵襲、黏附及促炎的致病特性，與UC及UC相關(guān)的結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[60]。DUBROVSKY A等[61]從熱帶地區(qū)患者潰瘍中分離出了梭桿菌屬潰瘍梭桿菌，本研究取得了和DUBROVSKY A等[61]類似的結(jié)果，潰瘍梭桿菌在UC患者腸道中顯著增加，而飲食干預(yù)或藥物干預(yù)能夠降低潰瘍梭桿菌豐度，提示潰瘍梭桿菌可作為治療UC的潛在靶點。

綜上所述，潰結(jié)灌腸液Ⅱ治療UC療效顯著，可能通過增加益生菌約氏乳桿菌（Lactobacillus_johnsonii）、羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus_reuteri）、阿克曼菌（Akkermansia muciniphila）、uncultured_bacterium_g__norank_f__Muribaculaceae豐度，減少致病菌大腸桿菌（Escherichia_coli）、潰瘍梭桿菌（Fusobacterium_ulcerans）豐度，抑制TNF-α mRNA、IL-1β mRNA表達來降低腸道炎癥反應(yīng)。