miR-34a基于AKT/mTOR通路對骨關(guān)節(jié)炎大鼠的影響及作用機制研究

周倫 丁源 呂洲

青島市市立醫(yī)院骨關(guān)節(jié)科，青島 266000

骨關(guān)節(jié)炎是常見的骨骼疾病，疼痛、僵硬等臨床特征嚴(yán)重影響關(guān)節(jié)的承重能力，我國有80%的患者出現(xiàn)關(guān)節(jié)活動受限，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量［1］。目前關(guān)于該病的研究表明，骨關(guān)節(jié)炎主要是由于細(xì)胞外基質(zhì)、關(guān)節(jié)軟骨的合成、降解紊亂所造成［2］。當(dāng)前基于微小RNA（miRNA）治療多種疾病已有大量研究，同時對于臨床具有較大的診斷、治療潛能，但治療骨關(guān)節(jié)炎的研究較少［3］。有研究表明，微小核糖核酸-34a（microRNA-34A，miR-34a）具有調(diào)控細(xì)胞周期和抗增殖能力，同時表達(dá)異常會引起細(xì)胞的凋亡、細(xì)胞周期停滯等現(xiàn)象［4］。蛋白激酶B（AKT）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路主要對于細(xì)胞的調(diào)控、自噬具有重要作用，其中通過抑制該通路可以改善機體的炎性反應(yīng)［5］。目前缺少通過AKT/mTOR 信號通路來調(diào)節(jié)miR-34a 對骨關(guān)節(jié)炎的干預(yù)效果研究?；诖耍疚闹荚谘芯縨iR-34a 基于AKT/mTOR通路對骨關(guān)節(jié)炎大鼠的影響及作用機制。

動物與材料

1、研究動物

研究時間為 2020 年 2 月至 2021 年 5 月。選取 43 只 6～9 周齡雄性SD 大鼠作前瞻性研究，體質(zhì)量200～250 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號SCXK（京）2017-0022，喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料，室溫（24±3）℃，相對濕度（48±7）%，12 h 光照交替。本次試驗操作均參照動物試驗倫理要求的相關(guān)規(guī)定，且經(jīng)青島市市立醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)同意。

2、方法

2.1、骨關(guān)節(jié)炎大鼠建模［6］選取 43 只大鼠，從中隨機選取10 只大鼠為空白組，其余33 只建立骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠，腹腔注射10%水合氯醛（青島宇龍海藻有限公司，H37022673）麻醉，切開2 cm 雙側(cè)膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)，暴露關(guān)節(jié)腔，用生理鹽水清洗，止血，縫合。在關(guān)節(jié)中注射碘乙酸鈉溶液（上海信裕生物科技有限公司，型號305-53-3），飼養(yǎng)2 周，建模關(guān)節(jié)出現(xiàn)腫脹及屈伸功能障礙，表示建模成功。成功建模30只。

2.2、分組及干預(yù) 選取10 只大鼠為空白組，成功建模的30 只模型大鼠隨機分為模型組、上調(diào)miR-34a 組、沉默miR-34a 組，各 10 只。通過 Lipofectamine 2000 將 miR-34a inhibitor 轉(zhuǎn)染到上調(diào) miR-34a 組、沉默 miR-34a 組，分別為400 nm 和 200 nm，6 h 后換成含10% 血清的DMEM 培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱生物科技有限公司，貨號：XB01XLS），37 ℃，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，實時熒光定量PCR（RT-PCR）法檢測miR-34a inhibitor 轉(zhuǎn)染效果。模型組、空白組均給予等體積的生理鹽水干預(yù)，各組均連續(xù)干預(yù)2周。

2.3、檢測炎癥指標(biāo) 采用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-4、IL-10，在干預(yù)結(jié)束后抽取尾靜脈血5 ml，以離心半徑5 cm、轉(zhuǎn)速3 000 r/min 離心處理10 min，分離上層血清，-80 ℃保存待檢。嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。酶聯(lián)免疫吸附試劑盒由上海酶聯(lián)生物科技有限公司提供。

2.4、病理組織觀察 干預(yù)50 d 后，處死大鼠，觀察關(guān)節(jié)是否有積液，取4 塊脛骨內(nèi)側(cè)、脛骨外側(cè)為標(biāo)本，標(biāo)本使用中性甲醛溶液固定70 h，脫水，包埋，切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，根據(jù)Mankin關(guān)節(jié)軟骨病理評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評估。

2.5、采用實時熒光定量PCR 檢測miR-34a 采用Trizol一步法提取總RNA，所有步驟按說明書嚴(yán)格進(jìn)行。引物設(shè)計如下 ， miR-34a正 向引物 ：5’ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3’ ， 反 向 引 物 ：5’-GCCGCTGGCAGTGTCTTAGCTG-3’；GAPDH正向引物：5’ -AGCCACATCGCTCAGACA-3’ ， 反 向 引 物 ：5’-TGGACTCCACGACGTACT-3’。采用 2-△△Ct方法計算出需要檢測的miR-34a相對表達(dá)量。

2.6、檢測磷酸化蛋白激酶B（pAKT）、磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（pmTOR） 采用蛋白免疫印跡法將標(biāo)本提取液，根據(jù)蛋白濃度取適量進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分離蛋白。其余步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，結(jié)果用LabWorks3.0軟件以目的條帶β-肌動蛋白（β-actin）的會度值進(jìn)行分析。重復(fù)試驗5次。

3、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析處理。應(yīng)用Kolmogorov-SmiRnov 檢驗數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）描述，多組間比較采用方差齊性檢驗，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1、病理組織

如圖1 所示，圖1A 為空白組：未見明顯關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞，表面光滑沒有裂痕，骨細(xì)胞排列分布均勻；圖1B 為模型組：表面明顯粗糙，有裂隙，骨細(xì)胞減少偏平，分布紊亂；圖1C為沉默miR-34a 組：表面較為光滑無裂痕，骨細(xì)胞分布均勻，層次分明；圖1D 為上調(diào)miR-34a 組：表面粗糙，骨細(xì)胞減少，分布較為紊亂。

圖1 各組大鼠病理學(xué)觀察（HE ×400）。A 為空白組大鼠病理圖，B 為模型組大鼠病理圖，C 為沉默miR-34a 組大鼠病理圖，D為上調(diào)miR-34a組大鼠病理圖

2、miR-34a在各組中的表達(dá)水平比較

如表1 所示，與空白組相比，模型組、上調(diào)miR-34a 組、沉默miR-34a 組的miR-34a 表達(dá)較高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；與模型組相比，上調(diào) miR-34a 組、沉默miR-34a組miR-34a表達(dá)較低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；沉 默 miR-34a 組 與 上調(diào) miR-34a 組相 比，沉 默miR-34a 組miR-34a 表達(dá)較低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

表1 miR-34a在各組大鼠中的表達(dá)水平比較（）

表1 miR-34a在各組大鼠中的表達(dá)水平比較（）

注：空白組不做處理，模型組建立骨關(guān)節(jié)炎模型，上調(diào)miR-34a組、沉默miR-34a 組建立骨關(guān)節(jié)炎模型后分別轉(zhuǎn)染400 nm 和200 nm miR-34a inhibitor；miR-34a 為微小核糖核酸-34a；與空白組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與上調(diào)miR-34a 組相比，cP＜0.05

miR-34a 0.94±0.08 2.39±0.26a 2.12±0.23ab 1.54±0.17abc 25.290 0.001組別空白組模型組上調(diào)miR-34a組沉默miR-34a組F值P值n 10 10 10 10

3、各組Makin評分比較

如表2 所示，與空白組相比，模型組、上調(diào)miR-34a 組、沉默miR-34a 組的Makin 評分較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；與模型組相比，上調(diào)miR-34a 組、沉默miR-34a 組的Makin 評分較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；沉默miR-34a 組與上調(diào) miR-34a 組相比，沉默 miR-34a 組 Makin評分較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

表2 Makin評分在各組大鼠中的比較（分，）

表2 Makin評分在各組大鼠中的比較（分，）

注：空白組不做處理，模型組建立骨關(guān)節(jié)炎模型，上調(diào)miR-34a組、沉默miR-34a 組建立骨關(guān)節(jié)炎模型后分別轉(zhuǎn)染400 nm 和200 nm miR-34a inhibitor；miR-34a 為微小核糖核酸-34a；與空白組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與上調(diào)miR-34a 組相比，cP＜0.05

Makin評分0.35±0.05 4.13±0.19a 3.02±0.16ab 1.15±0.09abc 91.260 0.001組別空白組模型組上調(diào)miR-34a組沉默miR-34a組F值P值n 10 10 10 10

4、各組炎性反應(yīng)比較

如表3 所示，與空白組相比，模型組、上調(diào)miR-34a 組、沉默miR-34a組IL-1β、TNF-α較高，IL-4、IL-10較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；與模型組相比，上調(diào)miR-34a組、沉默 miR-34a 組IL-1β、TNF-α 較低，IL-4、IL-10 較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；沉默miR-34a 組與上調(diào)miR-34a 組相比，沉默 miR-34a 組 IL-1β、TNF-α 較低，IL-4、IL-10較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

表3 各組大鼠的炎性反應(yīng)比較（）

表3 各組大鼠的炎性反應(yīng)比較（）

注：空白組不做處理，模型組建立骨關(guān)節(jié)炎模型，上調(diào)miR-34a 組、沉默miR-34a 組建立骨關(guān)節(jié)炎模型后分別轉(zhuǎn)染400 nm 和200 nm miR-34a inhibitor；miR-34a 為微小核糖核酸-34a；IL 為白細(xì)胞介素，TNF-α 為腫瘤壞死因子-α；與空白組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與上調(diào)miR-34a組相比，cP＜0.05

IL-10（pg/ml）106.49±17.51 60.85±10.23a 76.81±13.07ab 91.05±15.02abc 10.676 0.001組別空白組模型組上調(diào)miR-34a組沉默miR-34a組F值P值n 10 10 10 10 IL-1β（ng/L）3.68±0.37 7.51±1.23a 5.72±0.95ab 4.63±0.72abc 14.144 0.001 TNF-α（ng/L）37.45±4.85 62.05±7.49a 56.26±6.25ab 43.85±5.10abc 13.077 0.001 IL-4（pg/ml）115.75±16.81 50.43±9.42a 75.82±11.94ab 93.85±13.86abc 16.080 0.001

5、各組AKT/mTOR通路蛋白相對表達(dá)量對比

如表4 所示，與空白組相比，模型組、上調(diào)miR-34a 組、沉默miR-34a組pAKT、pmTOR較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；與模型組相比，上調(diào)miR-34a 組、沉默miR-34a 組pAKT、pmTOR 較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；沉默miR-34a組與上調(diào)miR-34a組相比，沉默miR-34a組pAKT、pmTOR 較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。各組大鼠pAKT、pmTOR蛋白免疫印跡圖見圖2。

圖2 空白組、模型組、沉默miR-34a組、上調(diào)miR-34a組大鼠pAKT、pmTOR蛋白免疫印跡圖

表4 各組大鼠的pAKT、pmTOR蛋白相對表達(dá)量對比（）

表4 各組大鼠的pAKT、pmTOR蛋白相對表達(dá)量對比（）

注：空白組不做處理，模型組建立骨關(guān)節(jié)炎模型，上調(diào)miR-34a組、沉默miR-34a組建立骨關(guān)節(jié)炎模型后分別轉(zhuǎn)染400 nm和200 nm miR-34a inhibitor；miR-34a 為微小核糖核酸-34a，pAKT 為磷酸化蛋白激酶，pmTOR 為雷帕霉素靶蛋白；與空白組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與上調(diào)miR-34a組相比，cP＜0.05

pmTOR 1.00±0.01 1.89±0.24a 1.56±0.25ab 1.25±0.15abc 17.580 0.001組別空白組模型組上調(diào)miR-34a組沉默miR-34a組F值P值n 10 10 10 10 pAKT 1.00±0.01 1.95±0.29a 1.71±0.26ab 1.51±0.26abc 15.525 0.001

討 論

骨關(guān)節(jié)炎是一種退行性疾病，主要是以關(guān)節(jié)基質(zhì)破壞、關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞減少為特點，嚴(yán)重者可導(dǎo)致患者出現(xiàn)關(guān)節(jié)畸形、功能喪失等問題，當(dāng)時該病的發(fā)病機制尚未明確［7］。關(guān)于該病的治療目前沒有較好的方法，主要是以減輕疼痛、改善關(guān)節(jié)功能為主要治療方式，以提高生活質(zhì)量為主要目的［8］。但是治療方式不甚理想，因此應(yīng)更加深入了解病理機制，挖掘防治靶點。

miRNA 是一種普遍存在于生物體的小分子，其可以通過調(diào)節(jié)別的miRNA 來實現(xiàn)基因的調(diào)控，參與多種疾病中，尤其對于人體神經(jīng)分化、細(xì)胞凋亡、增殖具有重大作用，是一重要的調(diào)節(jié)因子［9-10］。隨著對miRNA 的深入了解發(fā)現(xiàn)，miR-34a 與骨質(zhì)疏松癥、骨腫瘤、骨關(guān)節(jié)炎等疾病的發(fā)生、發(fā)展具有密切關(guān)系。主要是因為miR-34a 可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡等生理學(xué)行為［11-12］。有研究結(jié)果顯示，通過miR-34a 進(jìn)行沉默，可以起到保護(hù)軟骨細(xì)胞的作用，同時可以抑制軟骨細(xì)胞凋亡，延緩關(guān)節(jié)退變的速度，對于治療骨關(guān)節(jié)炎提供了較好的理論支持［13］。本文研究結(jié)果顯示，在骨關(guān)節(jié)炎中miR-34a 表達(dá)較高，通過沉默miR-34a 可以降低大鼠miR-34a 表達(dá)，減輕大鼠的炎性反應(yīng)，從而影響骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展。主要是因為miR-34a 通過誘導(dǎo)p53 基因，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞周期停止、凋亡、衰老等生物學(xué)行為，同時通過導(dǎo)致基因的變化對細(xì)胞進(jìn)行較好的干預(yù)，因此對骨關(guān)節(jié)炎造成一定的影響［14］。

IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10 是較為經(jīng)典的炎性指標(biāo)，對于骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制有一定影響。miR-34a 對于細(xì)胞的自噬作用有一定影響，而自噬是機體中較為穩(wěn)態(tài)的一種機制，主要是通過吞噬受損的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)，從而釋放原料，為機體提供新的能量，因此在炎癥、免疫等指標(biāo)中具有重要作用［15］。由此說明，miR-34a 對于炎癥指標(biāo)有一定影響性。本文研究結(jié)果顯示，沉默miR-34a 可以使骨關(guān)節(jié)炎大鼠的IL-1β、TNF-α降低，IL-4、IL-10升高，減輕炎性反應(yīng)。主要是因為IL-1β 可以誘導(dǎo)軟骨產(chǎn)生較多的IL-6、IL-8 等炎癥介質(zhì)［16］。TNF-α 可抑制軟骨膠原產(chǎn)生，與病變具有密切關(guān)系［17］。IL-10對軟骨細(xì)胞具有保護(hù)作用，充分說明該炎癥指標(biāo)與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展具有密切的相關(guān)性。

mTOR 與細(xì)胞的增殖、凋亡、分化具有密切的相關(guān)性，同時有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，以mTOR 為交點的正向信號通路有AKT/mTOR 通路［18］。同時有研究表明，AKT/mTOR 參與調(diào)控細(xì)胞的凋亡、自噬，可以影響更多的反向效應(yīng)分子，從而起到抑制細(xì)胞自噬作用［19］。本文研究結(jié)果顯示，沉默miR-34a可以降低骨關(guān)節(jié)炎大鼠pAKT、pmTOR 表達(dá)。分析原因主要是因為沉默miR-34a 可以通過去磷酸化的三磷酸磷脂酰肌醇抑制AKT 活性，而激活A(yù)KT/mTOR 信號通路之后，可以引起一系列反應(yīng)，包括調(diào)控細(xì)胞的生長、增殖、自噬［20］。

綜上所述，沉默miR-34a 通過AKT/mTOR 信號通路調(diào)控，進(jìn)而改善pAKT、pmTOR 表達(dá)，提高大鼠的關(guān)節(jié)功能，減少炎性反應(yīng)，為臨床骨關(guān)節(jié)炎靶向治療提供理論依據(jù)。但因樣本量較少，在數(shù)據(jù)統(tǒng)計時可能存在一定的偏倚，存在一定的局限性，且未對其具體作用機制進(jìn)行深入分析，因此還需后續(xù)進(jìn)一步分析。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突