• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    沉默狼瘡相關(guān)肺動脈高壓高表達的HMGB1通過TLR4/NF-κB途徑抑制低氧誘導的PASMC增殖、遷移及膠原合成①

    2022-11-15 09:03:06李鳴遠武云新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院全科醫(yī)學科烏魯木齊830054
    中國免疫學雜志 2022年17期
    關(guān)鍵詞:低氧膠原試劑盒

    李鳴遠 孟 巖 武云(新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院全科醫(yī)學科,烏魯木齊 830054)

    肺動脈高壓(pulmonary hypertension,PAH)是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)嚴重的并發(fā)癥之一,隨著肺動脈壓力與肺部血管阻力的漸進性升高,可導致右心室衰竭而死[1-2]。由于SLE-PAH發(fā)病機制尚未完全闡明,導致臨床藥物治療存在明顯局限性,因此更深層地了解其發(fā)病機制有助于改善患者的療效及預后。

    目前公認PAH的病理基礎(chǔ)是由肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMC)異常增殖和膠原蛋白等細胞外基質(zhì)蛋白積累而導致肺血管壁重塑[3-4]。但驅(qū)動PASMC異常生理活動的分子基礎(chǔ)并未得到明確闡述。近年來,越來越多的證據(jù)表明炎癥在PAH的發(fā)病機制中起著至關(guān)重要的作用,并且SLE-PAH相對于其他類型的PAH有更強的炎癥狀態(tài)[5-7]。高遷移率族蛋白1(high mobility group box-1,HMGB1)是一種由細胞主動或被動分泌的致炎因子,多研究顯示HMGB1在PAH患者肺部表達明顯上調(diào),并能促發(fā)炎癥反應(yīng)及肺血管重構(gòu),從而誘導PAH發(fā)生[8-9]。

    關(guān)于HMGB1在SLE-PAH中是通過何種信號通路誘發(fā)PASMC異常的生理活動目前仍未見報道。TLR4/NF-κB是參與機體炎癥反應(yīng)的重要信號通路之一。XUE等[10]證實了HMGB1通過TLR4/MyD88/NF-κB途徑促進了炎癥細胞因子的釋放,心肌細胞的遷移、黏附和聚集,加重了心肌缺血性輸液損傷,加重了心肌梗死面積。YU等[11]研究發(fā)現(xiàn)HMGB1的抑制通過TLR4和NF-κB信號通路抑制NLRP3介導的炎癥反應(yīng),從而改善壞死性腸結(jié)腸炎。可見HMGB1與TLR4/NF-κB途徑的相互調(diào)控在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。

    由此推測,SLE患者體內(nèi)高表達的HMGB1可能是通過激活TLR4/NF-κB途徑誘發(fā)炎癥反應(yīng),促進PASMC的過度增殖、遷移與膠原合成,最終誘發(fā)PAH的發(fā)生。本研究在臨床樣本驗證的基礎(chǔ)上設(shè)計PASMC的體外培養(yǎng)實驗,進一步明確HMGB1參與SLE-PAH疾病進展的作用機制。

    1 資料與方法

    1.1 資料

    1.1.1 一般資料選取新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院2019年3月至2021年3月收治的健康體檢者(健康對照組)、SLE患者(SLE組)、SLE-PAH(SLE-PAH組)作為研究對象,納入標準:SLE符合1997年美國風濕病協(xié)會制定的SLE分類診斷標準[12],PAH的診斷符合多普勒超聲測定肺動脈收縮壓(pulmonary artery systolic pressure,PASP)≥30 mmHg[13]。排除標準:由間質(zhì)性肺疾病、肺栓塞、心功能不全、心肌梗死等引發(fā)的PAH。本研究已通過本院倫理委員會審批,所有患者均對本研究知情,并簽署知情同意書。正常對照組30例,平均年齡(37.1±12.4)歲,男11例,女19例;SLE組33例,平均年齡(35.8±10.3)歲,男14例,女19例,SLE持續(xù)時間(59.3±30.1)個月,SLEDAI得分為(12.4±4.8)分;SLE-PAH組31例,平均年齡(36.9±7.9)歲,男15例,女16例,SLE持續(xù)時間(65.5±39.9)個月,SLEDAI得分為(10.8±5.1)分,3組性別組成與年齡無顯著性差異,SLE組與SLE+PAH組SLE持續(xù)時間、SLE疾病活動度指數(shù)(disease activity index of SLE,SLEDAI)得分無差異。

    1.1.2 儀器與試劑全自動生化分析儀(7600型,日本日立);PCR儀器(美國ABI 7500熒光定量PCR儀);液體閃爍計數(shù)器(liquid scintillation counter,美國Perkin Elmer);電泳儀(Bio-Rad,美國);PASMC(武漢云克隆科技股份有限公司);LipofectamineTM2000(Invitrogen,美國);MTT檢測試劑盒(酶聯(lián)生物,上海);酶標儀(America,美國);EdU細胞增殖檢測試劑盒(銳博生物科技有限公司,廣州);熒光顯微鏡(fluorescence microscope,日本奧林巴斯);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR檢測試劑盒(美國賽默飛科技);BCA定量試劑盒(碧云天公司,上海);Boyden小室(Hm-Kylin/海門麒麟公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 彩色多普勒超聲檢查使用彩色多普勒儀,M4s探頭,頻率為2.0~3.5 MHz,囑患者取左臥位,掃查患者胸骨旁長、短軸、四腔室,測量三尖瓣反流,估測PASP,ePASP=(4×TRV2)+RAP,其中TRV為最大三尖瓣反流速度,RAP為右房壓。

    1.2.2 SLEDAI根據(jù)SLE疾病活動度評分量表對SLE-PAH患者SLEDAI進行評分,SLEDAI≥8定義為SLE活動期,另為非活動期。

    1.2.3 PAH嚴重程度分級根據(jù)PASP對SLEPAH患者PAH的嚴重程度進行分級。輕度:PASP 30~40 mmHg,中 度:PASP 41~70 mmHg,重 度:PASP≥71 mmHg。

    1.2.4 血漿HMGB1含量檢測空腹采集患者的外周靜脈血,迅速分離血漿,采用全自動生化分析儀測定血漿中HMGB1含量。比較3組受試者血漿HMGB1含量,并分析不同SLE活動度、PAH嚴重程度分級的SLE-PAH患者血漿中HMGB1含量。

    1.2.5 細胞培養(yǎng)PASMC采用DMEM高糖培養(yǎng)基(含有10%FBS),在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng),培養(yǎng)至第4~6代使用。

    1.2.6 siRNA轉(zhuǎn)染將PASMC培養(yǎng)至30%~50%融合,使用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染25μmol siRNANC/siRNA-HMGB1,轉(zhuǎn)染6 h后,將細胞在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后進行后續(xù)實驗。所有siRNA均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。

    1.2.7 細胞增殖測定采用MTT法與EdU實驗測定PASMC細胞增殖情況,MTT實驗:于96孔板接種(2×103個/孔),培養(yǎng)24 h后按照MTT檢測試劑盒說明書加入MTT試劑,孵育4 h,酶標儀測定細胞在490 nm處的吸光值。EdU實驗:使用EdU細胞增殖檢測試劑盒,加入50μmol/L EdU試劑4 h,1μg/ml DAPI染色20 min,于熒光顯微鏡下觀察染色陽性細胞,計算EdU陽性率。

    1.2.8 細胞遷移測定采用Boyden小室試驗測定PASMC細胞遷移能力,將PASMC重新懸浮在含有0.4%BSA的無血清DMEM培養(yǎng)基中,取1×104個細胞加入Boyden上室。下腔充滿含0.4%BSA的無血清培養(yǎng)基,孵育5 h后,將穿透并附著在濾膜底部的細胞固定于甲醇中,并在室溫下用Giemsa溶液染色20 min。使用顯微鏡觀察細胞,并記錄每孔隨機選擇區(qū)域的細胞計數(shù)。

    1.2.9 膠原合成測定采用膠原酶消化法測定細胞膠原蛋白的合成,將PASMC置于含有抗壞血酸(50μg/ml)和β-氨基丙腈(80μg/ml)的[2,3,4,5-3H]L-脯氨酸中持續(xù)24 h。移出培養(yǎng)基并將其添加到等體積的冷Tris緩沖液(0.1 mmol/L,pH=7.4)中,緩沖液含有0.65 mmol/L NaCl、5.0 mmol/L CaCl2、2.5 mmol/L N-乙基馬來酰亞胺和100μg/ml牛血清白蛋白,添加三氯乙酸(10%)在4℃下絮凝30 min,于14 000 g、4℃離心10 min,95%冷乙醇洗滌2次,干燥,0.2%SDS溶解,液體閃爍計數(shù)器測定。

    1.2.10 RT-PCR采用RT-PCR測定細胞中HMGB1 mRNA的相對表達量,以GAPDH作為內(nèi)部參照基因,HMGB1基因的相對表達水平采用2-ΔΔCt表示。引物序列為:HMGB1正向:5′-GCCGGGAGGAGCACAAGAAGAA-3′,反向:5′-GCCTTGTCAGCCTTTGCCATATCT-3′,GAPDH正向:5′-ACGGCAAGTTCAACGGCACAGTCA-3′,反向:5′-AGCGGAAGGGGCGGAGATGA-3′。

    1.2.11 Western blot采用Western blot測定HMGB1、TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β、COL1、COL3蛋白質(zhì)的含量。RIPA裂解法提取總蛋白,BCA定量試劑盒定量,使用10%SDS-PAGE于電泳儀進行分離,轉(zhuǎn)移至PVDF膜,加入相應(yīng)的抗體孵育,4℃隔夜,然后用辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶5 000稀釋),室溫下孵育1 h,使用Image-Lab軟件檢測生物發(fā)光,并對蛋白質(zhì)進行定量。

    1.3 統(tǒng)計學處理采用GraphPad Prism 8.0進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與圖形的繪制,實驗數(shù)據(jù)均采用±s表示,多組間數(shù)據(jù)的分析采用單因素方差分析,兩兩之間的比較采用LSD-t檢驗,當P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1 HMGB1在SLE-PAH患者血漿與低氧培養(yǎng)的PASMC中的表達上調(diào)結(jié)果顯示,SLE-PAH患者血漿中HMGB1水平高于SLE患者與正常對照,SLE患者HMGB1水平亦高于正常對照,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01,P<0.001,圖1A);進一步對HMGB1與SLE-PAH患者病情的關(guān)系進行分析,結(jié)果顯示,SLE活動期患者血漿HMGB1水平高于非活動期(P<0.05,圖1B),PAH重度患者血漿HMGB1水平高于輕中度患者(P<0.05,圖1C)。采用低氧環(huán)境培養(yǎng)PASMC模擬PAH環(huán)境,測定HMGB1 mRNA與蛋白質(zhì)的表達,以常氧條件下培養(yǎng)的PASMC作為對照,結(jié)果發(fā)現(xiàn),低氧誘導促進了HMGB1 mRNA與蛋白質(zhì)的表達上調(diào)(P<0.01,P<0.001,圖1D、E)。

    圖1 臨床SLE-PAH患者血漿與低氧培養(yǎng)的PASMC中HMGB1的水平分析Fig.1 Analysis of HMGB1 level in plasma of patients with SLE-PAH and PASMC induced by hypoxia

    2.2 沉默HMGB1抑制低氧誘導PASMC的增殖、遷移與膠原合成及TLR4/NF-κB通路的表達結(jié)果顯示,低氧誘導促進了細胞增殖、遷移(P<0.001,圖2A~C)與膠原合成(P<0.001,圖2D、E),而沉默HMGB1則 逆 轉(zhuǎn) 了 此 變 化(P<0.01,P<0.001,圖2A~E),以上提示低氧誘導了HMGB1表達增強,從而促進了PASMC增殖、遷移與膠原合成。同時,測定了TLR4/NF-κB通路相關(guān)蛋白的表達,結(jié)果顯示,低氧誘導激活了PASMC細胞中TLR4/NF-κB通路蛋白的表達,而在沉默HMGB1后則又逆轉(zhuǎn)了此變化(P<0.001,圖2F)。

    圖2 沉默HMGB1抑制了低氧誘導的PASMC增殖、遷移與膠原合成及TLR4/NF-κB通路表達Fig.2 Silencing HMGB1 inhibited proliferation,migration and collagen synthesis of PASMC and expression of TLR4/NF-κB pathway induced by hypoxia

    2.3 激活TLR4逆轉(zhuǎn)siRNA-HMGB1對低氧誘導PASMC增殖、遷移與膠原合成的抑制作用如圖3所示,為進一步驗證低氧誘導下HMGB1是否通過TLR4/NF-κB通路調(diào)控PASMC增殖、遷移與膠原合成,采用siRNA-HMGB1與TLR4的激活劑LPS分別處理PASMC,均給予低氧培養(yǎng),結(jié)果顯示,在siRNAHMGB1干預的基礎(chǔ)上采用LPS處理,能逆轉(zhuǎn)siRNAHMGB1對低氧誘導PASMC增殖、遷移(P<0.05)與膠原合成(P<0.01)的抑制作用,同時還觀察到,LPS處理使siRNA-HMGB1對TLR4/NF-κB通路的抑制作用也得到逆轉(zhuǎn)(P<0.01)。

    圖3 激活TLR4逆轉(zhuǎn)siRNA-HMGB1對低氧誘導PASMC增殖、遷移與膠原合成的抑制作用Fig.3 Activation of TLR4 reverses inhibitory effect of siRNA-HMGB1 on proliferation,migration and collagen synthesis of PASMC induced by hypoxia

    3 討論

    HMGB1是一種細胞核非組蛋白DNA結(jié)合蛋白,具有復雜的生物學效應(yīng),參與了細胞增殖、遷移、分化、炎癥、腫瘤發(fā)展等生理/病理過程,是近年來國內(nèi)外研究熱點之一[14]。

    本研究中首先在臨床樣本中證實了HMGB1與SLE-PAH的關(guān)系:與正常受試者及SLE患者相比,SLE-PAH患者血漿中HMGB1含量顯著升高,且處于SLE活動期與合并重度PAH的患者血漿HMGB1含量高于SLE非活動期與合并輕中度PAH的患者。這說明HMGB1與SLE-PAH疾病的進展密切相關(guān)。既往研究已證實SLE患者血清中HMGB1蛋白升高,與SLE疾病活性相關(guān)[15-16]。SLE是一種以產(chǎn)生抗核抗體(ANA)為特征的自身免疫性疾病,ANA能與HMGB1結(jié)合形成復合物后放大機體的炎癥反應(yīng)[17]。YAO等[18]研究中發(fā)現(xiàn)HMGB1是PAH藥物治療中主要的靶點蛋白之一。BAUER等[19]證實HMGB1可介導TLR4的活化促進PAH的進展。YUKARI等[20]證實HMGB1在肺動脈高壓小鼠模型中表達增加,促進了炎癥反應(yīng),并使肺血管壁增厚。上述研究結(jié)果均為單純探討HMGB1與SLE或PAH疾病之間的關(guān)系,而本研究直接探討了HMGB1在SLE-PAH疾病進展中的作用,可為SLE-PAH疾病的臨床診治實踐提供一定的參考。

    隨后本研究采用PASMC體外細胞培養(yǎng)實驗來探討HMGB1在SLE-PAH進展中的作用機制,結(jié)果證實低氧誘導PASMC可促進HMGB1表達,而HMGB1是通過激活TLR4/NF-κB信號通路促進PASMC增殖、遷移及膠原合成。TLR4/NF-κB信號通路是炎癥反應(yīng)的主要調(diào)控通路之一,TLR4是一類跨膜蛋白,能特異性識別病原相關(guān)分子模式,并在免疫和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用;TLR4通過與髓樣分化蛋白88或其他接頭蛋白結(jié)合后,使得核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB p65亞單位磷酸化激活,進入細胞核促進炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β等的表達[21]。近年來研究指出TLR4還能識別體內(nèi)危險信號[22]。HMGB1可作為損傷模式相關(guān)分子,是危險信號分子激活模式的識別受體。因而在低氧或SLE導致的炎癥環(huán)境下,HMGB1的表達上調(diào),被TLR4識別后,激活了NF-κB,從而產(chǎn)生了炎癥級聯(lián)放大反應(yīng),PASMC細胞過度增殖、遷移,合成膠原,促進了肺血管重構(gòu),最終引發(fā)或加重了PAH[23]。

    綜上所述,HMGB1通過TLR4/NF-κB途徑抑制低氧誘導的PASMC增殖、遷移及膠原合成,是SLEPAH未來可能的生物標志物及治療靶標之一。

    猜你喜歡
    低氧膠原試劑盒
    間歇性低氧干預對腦缺血大鼠神經(jīng)功能恢復的影響
    Wnt/β-catenin信號通路在低氧促進hBMSCs體外增殖中的作用
    膠原無紡布在止血方面的應(yīng)用
    GlobalFiler~? PCR擴增試劑盒驗證及其STR遺傳多態(tài)性
    GoldeneyeTM DNA身份鑒定系統(tǒng)25A試劑盒的法醫(yī)學驗證
    紅藍光聯(lián)合膠原貼治療面部尋常痤瘡療效觀察
    裸鼴鼠不同組織中低氧相關(guān)基因的表達
    牛結(jié)核病PCR診斷試劑盒質(zhì)量標準的研究
    膠原ACE抑制肽研究進展
    食品科學(2013年13期)2013-03-11 18:24:42
    ELISA試劑盒法測定水中LR型微囊藻毒素
    a级片在线免费高清观看视频| 亚洲男人天堂网一区| 美女高潮到喷水免费观看| 这个男人来自地球电影免费观看| 成人三级做爰电影| 老司机亚洲免费影院| 好男人电影高清在线观看| 宅男免费午夜| 在线观看午夜福利视频| 最新美女视频免费是黄的| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 久久人人精品亚洲av| 久久香蕉国产精品| 午夜老司机福利片| 看免费av毛片| 久久香蕉精品热| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 一级毛片高清免费大全| 午夜精品国产一区二区电影| 色综合站精品国产| 操美女的视频在线观看| 香蕉久久夜色| 日本五十路高清| www.999成人在线观看| 99riav亚洲国产免费| 国产精品久久电影中文字幕| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 国产精品久久久av美女十八| 亚洲黑人精品在线| 国产片内射在线| 精品福利观看| 亚洲精品一二三| 电影成人av| 91麻豆av在线| 97人妻天天添夜夜摸| 国产一区在线观看成人免费| 一级片免费观看大全| 精品午夜福利视频在线观看一区| 无限看片的www在线观看| 999久久久国产精品视频| 十八禁网站免费在线| 丝袜人妻中文字幕| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 18禁观看日本| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 午夜日韩欧美国产| 黄色成人免费大全| 男人舔女人下体高潮全视频| 成在线人永久免费视频| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 我的亚洲天堂| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 国产午夜精品久久久久久| 国产伦人伦偷精品视频| 亚洲avbb在线观看| 精品福利观看| 99精品欧美一区二区三区四区| 高清黄色对白视频在线免费看| 三级毛片av免费| 99国产精品99久久久久| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 成在线人永久免费视频| 国产国语露脸激情在线看| 中文字幕av电影在线播放| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 在线观看一区二区三区激情| 日韩欧美免费精品| 首页视频小说图片口味搜索| 9热在线视频观看99| 久久久久亚洲av毛片大全| 国产又色又爽无遮挡免费看| 国产三级在线视频| 久热这里只有精品99| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 后天国语完整版免费观看| 国产精品 欧美亚洲| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 日韩成人在线观看一区二区三区| 极品教师在线免费播放| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 91麻豆av在线| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 久久 成人 亚洲| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 黄色丝袜av网址大全| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| www.熟女人妻精品国产| 一本综合久久免费| 亚洲午夜理论影院| 久久精品国产综合久久久| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 亚洲国产欧美网| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 9色porny在线观看| 香蕉国产在线看| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 国产高清视频在线播放一区| 一级片'在线观看视频| 视频区欧美日本亚洲| 97人妻天天添夜夜摸| 不卡av一区二区三区| 亚洲情色 制服丝袜| 怎么达到女性高潮| 久久久久精品国产欧美久久久| 亚洲欧美精品综合久久99| 欧美色视频一区免费| 51午夜福利影视在线观看| 色老头精品视频在线观看| 亚洲色图av天堂| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 亚洲视频免费观看视频| 国产野战对白在线观看| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 新久久久久国产一级毛片| 国产精品一区二区三区四区久久 | tocl精华| 无限看片的www在线观看| 在线观看一区二区三区| 午夜精品国产一区二区电影| 午夜福利在线免费观看网站| www.精华液| 色老头精品视频在线观看| 欧美在线黄色| 久久性视频一级片| 中文字幕av电影在线播放| 亚洲精品在线观看二区| 亚洲中文av在线| 麻豆国产av国片精品| 精品高清国产在线一区| 午夜免费成人在线视频| 在线观看午夜福利视频| 两个人看的免费小视频| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 曰老女人黄片| 丰满的人妻完整版| 欧美日韩一级在线毛片| 成人永久免费在线观看视频| 亚洲成人国产一区在线观看| 久久中文字幕人妻熟女| 欧美日韩福利视频一区二区| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 嫩草影视91久久| 啦啦啦 在线观看视频| 日本wwww免费看| 美女福利国产在线| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 18禁美女被吸乳视频| 很黄的视频免费| 日韩精品中文字幕看吧| 88av欧美| 嫩草影院精品99| 午夜视频精品福利| 午夜免费鲁丝| 夫妻午夜视频| 国产单亲对白刺激| 免费不卡黄色视频| 操美女的视频在线观看| 久久人妻av系列| 久久人妻av系列| 国产成人av激情在线播放| 久久久国产一区二区| 国产激情久久老熟女| 中文字幕色久视频| 黄片播放在线免费| 午夜免费鲁丝| 一区二区三区国产精品乱码| 色播在线永久视频| 亚洲色图av天堂| 男女高潮啪啪啪动态图| 久久人妻熟女aⅴ| 极品教师在线免费播放| 1024视频免费在线观看| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | a级毛片黄视频| 国产免费男女视频| 麻豆成人av在线观看| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲少妇的诱惑av| 亚洲美女黄片视频| 国产精品国产av在线观看| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 亚洲,欧美精品.| 99在线人妻在线中文字幕| 美女午夜性视频免费| 一级a爱视频在线免费观看| www日本在线高清视频| 曰老女人黄片| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 三上悠亚av全集在线观看| 岛国视频午夜一区免费看| 久久香蕉激情| 亚洲午夜理论影院| 亚洲精品一二三| 久久性视频一级片| 激情在线观看视频在线高清| 亚洲久久久国产精品| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 99热只有精品国产| 日本a在线网址| 国产男靠女视频免费网站| 国产高清激情床上av| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 久久久久久久精品吃奶| 中文欧美无线码| 老司机福利观看| 老司机在亚洲福利影院| 欧美在线黄色| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 19禁男女啪啪无遮挡网站| 国产主播在线观看一区二区| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 日韩视频一区二区在线观看| 母亲3免费完整高清在线观看| 一边摸一边抽搐一进一小说| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 超碰成人久久| 国产深夜福利视频在线观看| 88av欧美| 真人一进一出gif抽搐免费| 午夜久久久在线观看| 99国产精品99久久久久| 自线自在国产av| 精品乱码久久久久久99久播| 视频区欧美日本亚洲| 亚洲欧美激情综合另类| 国产成人系列免费观看| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 国产单亲对白刺激| 国产精品1区2区在线观看.| 久久狼人影院| a在线观看视频网站| 看免费av毛片| 在线免费观看的www视频| 一区在线观看完整版| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 亚洲第一av免费看| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲av片天天在线观看| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 久久久国产成人精品二区 | 国产精品偷伦视频观看了| 麻豆一二三区av精品| 99国产极品粉嫩在线观看| a在线观看视频网站| 在线观看免费高清a一片| 国产欧美日韩一区二区三| 99香蕉大伊视频| 高清欧美精品videossex| 麻豆久久精品国产亚洲av | 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 在线观看免费午夜福利视频| 久久久久久久久久久久大奶| 桃色一区二区三区在线观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 欧美日韩av久久| 两个人免费观看高清视频| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 后天国语完整版免费观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 久久中文字幕人妻熟女| 久久久国产成人精品二区 | 国产av又大| 久久国产亚洲av麻豆专区| 日本 av在线| av福利片在线| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 一个人免费在线观看的高清视频| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲第一av免费看| 国产成人精品无人区| 两个人看的免费小视频| 无遮挡黄片免费观看| 在线观看免费日韩欧美大片| 色老头精品视频在线观看| 日韩三级视频一区二区三区| 精品午夜福利视频在线观看一区| 999精品在线视频| 母亲3免费完整高清在线观看| 可以在线观看毛片的网站| 精品国产一区二区三区四区第35| 午夜福利免费观看在线| 国产精品野战在线观看 | 黑人猛操日本美女一级片| 黄色 视频免费看| 最近最新免费中文字幕在线| 午夜日韩欧美国产| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产成人精品无人区| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 久久国产乱子伦精品免费另类| 欧美激情 高清一区二区三区| 精品福利永久在线观看| 91精品国产国语对白视频| 国产一区在线观看成人免费| 日本wwww免费看| 12—13女人毛片做爰片一| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 一本综合久久免费| 午夜福利一区二区在线看| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 亚洲欧美激情在线| 久久久久久久精品吃奶| 老司机亚洲免费影院| 两个人免费观看高清视频| 少妇的丰满在线观看| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 久久99一区二区三区| 亚洲色图综合在线观看| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 国产99白浆流出| 久久99一区二区三区| 在线观看舔阴道视频| 在线免费观看的www视频| 一进一出抽搐动态| 日本黄色视频三级网站网址| 母亲3免费完整高清在线观看| 99国产精品一区二区三区| 国产精品一区二区三区四区久久 | 黄色女人牲交| 黑人猛操日本美女一级片| 久久欧美精品欧美久久欧美| 69精品国产乱码久久久| 一级黄色大片毛片| 精品福利永久在线观看| 亚洲av成人一区二区三| 91成年电影在线观看| 久久人妻av系列| 乱人伦中国视频| 国产精品偷伦视频观看了| 欧美日韩精品网址| 亚洲第一av免费看| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 日韩精品青青久久久久久| 欧美日韩av久久| 精品乱码久久久久久99久播| 一区在线观看完整版| 丝袜美足系列| 精品一品国产午夜福利视频| 1024视频免费在线观看| 成熟少妇高潮喷水视频| 久久人妻av系列| 午夜久久久在线观看| 国产精品一区二区在线不卡| 国产99久久九九免费精品| 国产一区二区三区视频了| 日本 av在线| 中国美女看黄片| 女人精品久久久久毛片| 人妻久久中文字幕网| 少妇 在线观看| 久久狼人影院| 视频区欧美日本亚洲| 国产精品久久视频播放| 啦啦啦在线免费观看视频4| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 久久午夜亚洲精品久久| 天堂影院成人在线观看| 麻豆成人av在线观看| 啦啦啦 在线观看视频| 国产成人欧美在线观看| 国产精品乱码一区二三区的特点 | tocl精华| 制服人妻中文乱码| 国产精品一区二区精品视频观看| 99re在线观看精品视频| bbb黄色大片| 一级毛片高清免费大全| 国产亚洲精品第一综合不卡| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国产成人啪精品午夜网站| 午夜免费成人在线视频| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 99热只有精品国产| 日韩高清综合在线| 校园春色视频在线观看| 亚洲色图av天堂| 亚洲av成人av| 69精品国产乱码久久久| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 婷婷丁香在线五月| 久久青草综合色| 免费在线观看影片大全网站| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 亚洲精华国产精华精| 免费在线观看亚洲国产| 咕卡用的链子| 亚洲少妇的诱惑av| 99在线人妻在线中文字幕| 男女之事视频高清在线观看| 精品久久蜜臀av无| 国产精品98久久久久久宅男小说| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 18禁美女被吸乳视频| 成人18禁在线播放| 国产乱人伦免费视频| 黄色女人牲交| 一进一出抽搐动态| 久久久久久久久中文| 99国产极品粉嫩在线观看| av有码第一页| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 亚洲少妇的诱惑av| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 又黄又爽又免费观看的视频| 国产野战对白在线观看| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 国产高清videossex| 一二三四在线观看免费中文在| 国产精品一区二区三区四区久久 | 成人影院久久| 不卡av一区二区三区| 日韩欧美一区视频在线观看| 日韩av在线大香蕉| 校园春色视频在线观看| 又黄又爽又免费观看的视频| 久久欧美精品欧美久久欧美| 男女下面插进去视频免费观看| e午夜精品久久久久久久| 窝窝影院91人妻| 免费看a级黄色片| 一级,二级,三级黄色视频| 精品久久蜜臀av无| 9热在线视频观看99| 亚洲成人国产一区在线观看| 99精品久久久久人妻精品| 韩国av一区二区三区四区| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 午夜精品国产一区二区电影| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 中文字幕人妻丝袜制服| 欧美丝袜亚洲另类 | 亚洲片人在线观看| 男女之事视频高清在线观看| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| av免费在线观看网站| 亚洲国产精品999在线| 91国产中文字幕| 国产高清videossex| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 天堂√8在线中文| 亚洲一区二区三区欧美精品| 成熟少妇高潮喷水视频| 国产精品亚洲一级av第二区| 亚洲久久久国产精品| 国产精品 欧美亚洲| 最好的美女福利视频网| tocl精华| 亚洲熟女毛片儿| 亚洲精品久久午夜乱码| 亚洲 国产 在线| 久久亚洲真实| 搡老熟女国产l中国老女人| 久久天堂一区二区三区四区| 操美女的视频在线观看| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产黄色免费在线视频| 韩国av一区二区三区四区| 国产有黄有色有爽视频| 久热爱精品视频在线9| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 丰满饥渴人妻一区二区三| 嫁个100分男人电影在线观看| 大型黄色视频在线免费观看| 真人一进一出gif抽搐免费| 午夜精品国产一区二区电影| 国产精品偷伦视频观看了| 97碰自拍视频| 精品无人区乱码1区二区| 美女午夜性视频免费| 色综合欧美亚洲国产小说| 黄片小视频在线播放| 亚洲精品久久午夜乱码| 男女之事视频高清在线观看| 一本综合久久免费| 99riav亚洲国产免费| 国产99白浆流出| 桃色一区二区三区在线观看| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 淫妇啪啪啪对白视频| 久久久久久久午夜电影 | 久久中文字幕人妻熟女| 日韩国内少妇激情av| 久久久久国内视频| 老汉色∧v一级毛片| 首页视频小说图片口味搜索| 亚洲国产精品999在线| 丰满迷人的少妇在线观看| 久久精品影院6| 一本大道久久a久久精品| 99国产精品一区二区蜜桃av| 欧美亚洲日本最大视频资源| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 久久香蕉国产精品| 欧美精品啪啪一区二区三区| 久久午夜亚洲精品久久| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 午夜成年电影在线免费观看| 国产免费av片在线观看野外av| 麻豆一二三区av精品| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 又紧又爽又黄一区二区| 91国产中文字幕| 久久久国产欧美日韩av| 成熟少妇高潮喷水视频| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 精品久久久精品久久久| 亚洲人成电影观看| 亚洲熟女毛片儿| 国产亚洲欧美98| 午夜免费观看网址| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 神马国产精品三级电影在线观看 | 成人精品一区二区免费| 久久人人精品亚洲av| 麻豆国产av国片精品| 妹子高潮喷水视频| 一级片免费观看大全| 欧美最黄视频在线播放免费 | 日本 av在线| 国产成人欧美在线观看| 国产xxxxx性猛交| 三级毛片av免费| 色哟哟哟哟哟哟| 日韩有码中文字幕| 又紧又爽又黄一区二区| 中文字幕人妻丝袜制服| 精品国产国语对白av| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 午夜精品国产一区二区电影| 久久亚洲真实| 窝窝影院91人妻| 男人舔女人下体高潮全视频| 夫妻午夜视频| avwww免费| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲美女黄片视频| 免费不卡黄色视频| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 男女之事视频高清在线观看| 亚洲在线自拍视频| 精品国产一区二区三区四区第35| 国产成人欧美在线观看| 国产不卡一卡二| 婷婷丁香在线五月| 国产免费av片在线观看野外av| 美女扒开内裤让男人捅视频| 国产精品国产av在线观看| 亚洲精品国产一区二区精华液| 免费高清视频大片| 美国免费a级毛片| 91国产中文字幕| 国产精品影院久久| 两个人看的免费小视频| 女性生殖器流出的白浆| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 69av精品久久久久久| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 老司机福利观看| 在线免费观看的www视频| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 精品久久蜜臀av无| 亚洲成人国产一区在线观看| 一本大道久久a久久精品| 十八禁人妻一区二区| 搡老岳熟女国产| 天堂影院成人在线观看| 男女之事视频高清在线观看| 激情在线观看视频在线高清| 美女 人体艺术 gogo| 一区福利在线观看| 可以在线观看毛片的网站| 久久人妻熟女aⅴ| 亚洲欧美一区二区三区久久| 国产成人精品久久二区二区91| www日本在线高清视频| 亚洲少妇的诱惑av| 一级片免费观看大全| 国产视频一区二区在线看| 成年人黄色毛片网站| 国产高清视频在线播放一区| 国产91精品成人一区二区三区| 午夜精品久久久久久毛片777| av国产精品久久久久影院| 欧美精品啪啪一区二区三区| 日韩大码丰满熟妇| 日韩免费高清中文字幕av| 日本 av在线| 国产国语露脸激情在线看| 热99国产精品久久久久久7| 久久久久久久午夜电影 | 国产亚洲欧美98| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 搡老熟女国产l中国老女人| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 99精品在免费线老司机午夜| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频|