青藤堿調(diào)控LncRNA BLACAT1對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞增殖、凋亡的影響

陳 晨 鄭潤泉 李宗玉（中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第960醫(yī)院骨科，濟南 250031）

骨關(guān)節(jié)炎是臨床上常見的一種慢性疾病，目前尚無骨關(guān)節(jié)炎有效治療藥物，軟骨細胞是關(guān)節(jié)軟骨的主要細胞，其通過維持細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生與酶促降解的平衡而發(fā)揮作用，骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生過程中可產(chǎn)生軟骨細胞生長停滯、細胞損傷等，因而減輕軟骨細胞損傷成為重點，研究表明生物堿與植物的活性成分等具有抗氧化、抗炎等作用，并可減輕軟骨細胞損傷［1-4］。青藤堿是從中藥青風(fēng)藤中提取的生物堿單體，具有抗炎、鎮(zhèn)痛等作用，研究表明青藤堿可減緩類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎骨破壞的進程，但其作用機制尚未闡明［5］。LncRNA BLACAT1在骨關(guān)節(jié)炎骨髓基質(zhì)干細胞中表達水平升高，并可通過靶向miR-142-5p而抑制細胞增殖［6］。但青藤堿是否可通過調(diào)控BLACAT1的表達從而發(fā)揮作用尚未可知。因此，本研究采用脂多糖（LPS）誘導(dǎo)軟骨細胞建立骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞損傷模型，探討青藤堿對LPS誘導(dǎo)的軟骨細胞增殖、凋亡、炎癥反應(yīng)的影響及其對BLACAT1的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料青藤堿購自湖南正清制藥集團股份有限公司；人正常軟骨細胞購自北納生物；IFN-γ、TNF-α檢測試劑盒購自北京諾博萊科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；Lipofectamine2000購 自美國Invitrogen公 司；si-NC、si-BLACAT1、pcDNA、pcDNA-BLACAT1購自廣州銳博生物科技有限公司；Trizol試劑購自大連寶生物工程有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；CCK-8試劑購自日本同仁化學(xué)研究所；凋亡檢測試劑盒、LPS購自美國Sigma公司；兔抗人Bax、Bcl-2抗體購自美國CST公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Bio-Tec ELX808酶標(biāo)儀購自美國Bio-Tec公司；FACS Calibur流式細胞儀購自美國BD公司；StepOnePlus實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組軟骨細胞接種于含100 ng/ml LPS的培養(yǎng)液中培養(yǎng)12 h，記為LPS組［7］。同時將正常培養(yǎng)的軟骨細胞作為Con組。軟骨細胞接種于含不同濃度（20、40、80μg/ml）的青藤堿與含100 ng/ml LPS的培養(yǎng)液中培養(yǎng)12 h，分別記為LPS+青藤堿-L組、LPS+青藤堿-M組、LPS+青藤堿-H組［8］。si-NC、si-BLACAT1分別轉(zhuǎn)染人軟骨細胞后加入含100 ng/ml LPS的培養(yǎng)液中培養(yǎng)12 h，分別記為LPS+si-NC組、LPS+si-BLACAT1組。pcDNA、pcDNA-BLACAT1分別轉(zhuǎn)染軟骨細胞后加入含80μg/ml青藤堿與100 ng/ml LPS的培養(yǎng)液中培養(yǎng)12 h，分別記為LPS+青藤堿-H+pcDNA組、LPS+青藤堿-H+pcDNA-BLACAT1組。

1.2.2 qRT-PCR檢測細胞中BLACAT1的表達水平采用Trizol法提取各組軟骨細胞總RNA，應(yīng)用Nanodrop2000c超微量分光光度計檢測RNA濃度。反轉(zhuǎn)錄體系：5×DNA Buffer 2μl、10×King RT Buffer 2μl、FastKing RT Enzyme Mix 1μl、FQ-RT Primer Mix 2μl、RNA（2μg），RNase-Free ddH2O補足體系至20μl；反應(yīng)條件：42℃15 min，95℃3 min。qRTPCR擴增反應(yīng)體系：SYBR Green Master Mix 10μl、正反向引物各0.8μl、cDNA 2μl，ddH2O補足體系至20μl；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40次循環(huán)。BLACAT1以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算BLACAT1相對表達量。

1.2.3 CCK-8實驗檢測細胞活力收集各組軟骨細胞（1×105個/ml）接種于96孔板（100μl/孔），每孔加入10μl CCK-8溶液，將其置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度值（OD450nm）。

1.2.4 平板克隆形成實驗收集各組軟骨細胞接種于6孔板（1×103個/孔），將其置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)14 d，棄培養(yǎng)基，加入預(yù)冷PBS洗滌后加入甲醇（500μl/孔），將其置于-20℃冰箱內(nèi)孵育20 min，棄甲醇，加入1%結(jié)晶紫染色液（400μl/孔）孵育15 min，清洗后晾干，觀察細胞克隆形成數(shù)。

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率收集各組軟骨細胞加入預(yù)冷PBS洗滌后棄上清，向細胞沉淀中加入500μl結(jié)合緩沖液，分別加入5μl Annexin VFITC與5μl PI，室溫孵育10 min，應(yīng)用FACS Calibur流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.6 ELISA法檢測IFN-γ、TNF-α的水平收集各組軟骨細胞培養(yǎng)上清液，采用ELISA法檢測IFN-γ、TNF-α水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.7 Western blot檢測Bax、Bcl-2蛋白表達收集各組軟骨細胞加入RIPA裂解液提取細胞總蛋白，按照BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，SDSPAGE電泳分離蛋白，將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜后使用5%脫脂奶粉封閉2 h，4℃孵育一抗稀釋液（1∶1 000）24 h，室溫條件下孵育二抗稀釋液（1∶2 000）1 h，滴加ECL顯影，應(yīng)用Image J軟件分析各條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS21.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 青藤堿對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞增殖、凋亡的影響與Con組比較，LPS組BLACAT1的表達水平升高（P＜0.05），細胞活力降低（P＜0.05），克隆形成數(shù)減少（P＜0.05），凋亡率升高（P＜0.05），Bax蛋白水平升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平降低（P＜0.05）；與LPS組比較，LPS+青藤堿-M組、LPS+青藤堿-H組BLACAT1的表達水平降低（P＜0.05），細胞活力升高（P＜0.05），克隆形成數(shù)增多（P＜0.05），凋亡率降低（P＜0.05），Bax蛋白水平降低（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平升高（P＜0.05），且不同劑量間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 青藤堿對細胞增殖、凋亡的影響Fig.1 Effect of sinomenine on cell proliferation and apoptosis

2.2 青藤堿對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞中炎癥因子的影響與Con組比較，LPS組IFN-γ、TNF-α的水平升高（P＜0.05）；與LPS組比較，LPS+青藤堿-M組、LPS+青藤堿-H組IFN-γ、TNF-α的水平降低（P＜0.05），且不同劑量組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 青藤堿對細胞中炎癥因子的影響Fig.2 Effect of sinomenine on inflammatory factors in cells

2.3 干擾BLACAT1對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞增殖、凋亡的影響與LPS組、LPS+si-NC組比較，LPS+si-BLACAT1組細胞活力升高（P＜0.05），克隆形成數(shù)增多（P＜0.05），凋亡率降低（P＜0.05），Bax蛋白水平降低（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平升高（P＜0.05），見圖3。

圖3 干擾BLACAT1對細胞增殖、凋亡的影響Fig.3 Effect of interference with BLACT1 on cell proliferation and apoptosis

2.4 干擾BLACAT1對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞中炎癥因子的影響與LPS組、LPS+si-NC組比較，LPS+si-BLACAT1組IFN-γ、TNF-α的表達水平降低（P＜0.05），見圖4。

圖4 干擾BLACAT1對細胞中炎癥因子的影響Fig.4 Effect of BLACAT1 interference on inflammatory factors in cells

2.5 BLACAT1可逆轉(zhuǎn)青藤堿對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞增殖、凋亡的影響與LPS+青藤堿-H+pcDNA組比較，LPS+青藤堿-H+pcDNA-BLACAT1組細胞活力降低（P＜0.05），克隆形成數(shù)減少（P＜0.05），凋亡率升高（P＜0.05），Bax蛋白水平升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平降低（P＜0.05），見圖5。

圖5 BLACAT1可逆轉(zhuǎn)青藤堿對細胞增殖、凋亡的影響Fig.5 Effect of sinomenine on cell proliferation and apoptosis was reversed by BLACAT1

2.6 BLACAT1可逆轉(zhuǎn)青藤堿對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞中炎癥因子的影響與LPS+青藤堿-H+pcDNA組比較，LPS+青藤堿-H+pcDNA-BLACAT1組IFN-γ、TNF-α的水平升高（P＜0.05），見圖6。

圖6 BLACAT1可逆轉(zhuǎn)青藤堿對細胞中炎癥因子的影響Fig.6 Effect of sinomenine on inflammatory factors can be reversed by BLACAT1

3 討論

青藤堿具有抗炎、改善微循環(huán)的作用，并可減輕腦組織損傷［9］。青藤堿可抑制促炎因子的表達水平而改善類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的損傷程度［10］。本研究結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)的軟骨細胞活力降低，克隆形成數(shù)減少，而青藤堿可明顯升高LPS誘導(dǎo)的軟骨細胞活力，克隆形成數(shù)增多，且青藤堿中劑量與高劑量相比具有明顯差異，提示青藤堿可促進LPS誘導(dǎo)的軟骨細胞增殖及增強細胞克隆形成能力。Bcl-2/Bax比值降低可促進線粒體釋放細胞色素C而激活caspase級聯(lián)反應(yīng)從而誘導(dǎo)細胞凋亡［11］。本研究結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)的軟骨細胞凋亡率升高，Bax蛋白水平升高，Bcl-2蛋白水平降低，而青藤堿可明顯降低LPS誘導(dǎo)的軟骨細胞凋亡率，Bax蛋白水平降低，Bcl-2蛋白水平升高，且青藤堿中劑量與高劑量相比具有明顯差異，提示青藤堿可抑制LPS誘導(dǎo)的軟骨細胞凋亡從而減輕細胞損傷。本研究結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)的軟骨細胞IFN-γ、TNF-α的水平升高。與相關(guān)文獻報道結(jié)果相似，進一步研究顯示，青藤堿可明顯降低LPS誘導(dǎo)的軟骨細胞IFN-γ、TNF-α的水平，呈劑量依賴性，提示青藤堿可抑制LPS誘導(dǎo)的軟骨細胞炎癥反應(yīng)［12-13］。分析原因青藤堿可能通過增強軟骨細胞活力及抑制細胞凋亡而減輕細胞炎癥損傷。

本研究結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)的軟骨細胞中BLACAT1的表達水平升高，而青藤堿可明顯降低LPS誘導(dǎo)的軟骨細胞中BLACAT1的表達水平，提示青藤堿可能通過下調(diào)BLACAT1的表達從而發(fā)揮作用。研究表明抑制BLACAT1的表達可減輕神經(jīng)細胞損傷［14］。本研究結(jié)果顯示，干擾BLACAT1表達可明顯升高LPS誘導(dǎo)的軟骨細胞活力，克隆形成數(shù)增多，而凋亡率降低，IFN-γ、TNF-α的水平降低，提示干擾BLACAT1表達可促進LPS誘導(dǎo)的軟骨細胞增殖及克隆形成，而抑制細胞凋亡及炎癥反應(yīng)。同時本研究采用青藤堿與BLACAT1過表達聯(lián)合處理LPS誘導(dǎo)的軟骨細胞，結(jié)果顯示，細胞活力降低，克隆形成數(shù)減少，而凋亡率升高，IFN-γ、TNF-α的水平升高，提示BLACAT1過表達可明顯逆轉(zhuǎn)青藤堿對LPS誘導(dǎo)的軟骨細胞增殖、克隆形成、凋亡及炎癥反應(yīng)的作用。分析原因可能為青藤堿通過作用于BLACAT1而達到減輕LPS誘導(dǎo)的軟骨細胞損傷的作用，但BLACAT1如何調(diào)控miRNA表達及其相關(guān)通路而發(fā)揮作用仍需進一步驗證。

綜上所述，青藤堿可通過下調(diào)BLACAT1的表達而促進LPS誘導(dǎo)的軟骨細胞增殖及增強細胞克隆形成能力，并可抑制LPS誘導(dǎo)的軟骨細胞凋亡、炎癥反應(yīng)從而減輕細胞損傷，BLACAT1可能作為青藤堿治療骨關(guān)節(jié)炎的潛在靶點，但關(guān)于其具體作用機制仍需進一步探究。