lncRNA-MALAT1通過調(diào)節(jié)SIRT1介導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞活化調(diào)控2型糖尿病并發(fā)肝纖維化的機(jī)制研究①

吳玉婷 徐利芬 楊宇石 李翀瑤 薄 莉（貴州醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，貴陽 550004）

糖尿病是最常見的血糖異常升高引起的代謝性疾病，可引起多種慢性并發(fā)癥，如視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)病變、糖尿病腎病、非酒精性脂肪性肝炎和肝纖維化等［1-2］。高血糖作為糖尿病的重要特征之一，被認(rèn)為是引起糖尿病并發(fā)癥特別是肝纖維化的主要原因，但高血糖誘導(dǎo)肝纖維化的具體機(jī)制仍不明確［3-4］。深入研究高血糖誘導(dǎo)肝纖維化的分子機(jī)制，有助于進(jìn)一步理解糖尿病并發(fā)肝纖維化的病理生理過程，并為其臨床干預(yù)提供的新的策略和思路［5］。

lncRNA-MALAT1是一種在惡性腫瘤中研究較多的長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）。其在腫瘤中的作用主要是促進(jìn)腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，近期也有文章報道lnc-MALAT1在高血糖誘導(dǎo)的腎小管上皮損傷中具有重要作用，但其在糖尿病并發(fā)肝纖維化中的作用及機(jī)制仍然未知［6-8］。本文研究了lnc-MALAT1通過調(diào)控SIRT1介導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞活化及纖維化促進(jìn)糖尿病并發(fā)肝纖維化，為深入理解糖尿病肝纖維化的分子機(jī)制提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料lnc-MALAT1過表達(dá)質(zhì)粒、siRNA購自吉凱基因公司；SIRT1過表達(dá)質(zhì)粒購自和元生物；靶向FOXO1的siRNA購自Santa Cruz（sc-35382）；一抗購自Cell Signaling Technology；二抗購自Affinity；所有引物均購自GeneCopoeia。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)肝星狀細(xì)胞株IG12在90%DMEM+10%FBS的培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)。將細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中孵育，采用正常葡萄糖（normal glucose，NG，5.5 mmol/L）或高葡萄糖（high glucose，HG，45 mmol/L）處理后模擬糖尿病高血糖環(huán)境下肝星狀細(xì)胞的改變。肝星狀細(xì)胞與葡萄糖共孵育的時間為48 h。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染IG12細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，在融合度達(dá)到50%左右時轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒或siRNA，轉(zhuǎn)染12 h后換液，48 h后提總蛋白或總RNA進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 Western blot及RNA逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時熒光定量PCR細(xì)胞轉(zhuǎn)染后利用RIPA提取總蛋白，加PMSF和磷酸酶抑制劑防止蛋白降解與去磷酸化。蛋白電泳后轉(zhuǎn)膜，一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h后辣根過氧化物酶法檢測蛋白表達(dá)。GAPDH作為Western blot的內(nèi)參。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染后采用Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再進(jìn)行熒光定量PCR。以18S RNA為PCR內(nèi)參。

1.2.4 染色質(zhì)免疫共沉淀各實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染對應(yīng)的siRNA或過表達(dá)質(zhì)粒后48 h，1%甲醛37℃固定交聯(lián)10 min，使用超聲破碎。去除雜質(zhì)后，離心取上清為imput，分別加入對應(yīng)的抗體或IgG對照，4℃顛轉(zhuǎn)過夜。清洗沉淀后65℃解交聯(lián)過夜。樣品加入RNA酶等處理后，用于PCR分析。

2 結(jié)果

2.1 高糖環(huán)境介導(dǎo)肝星狀細(xì)胞的活化及向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變在高糖處理48 h后，對HG和NG組進(jìn)行Western blot，研究結(jié)果表明：HG組的α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、波形蛋白（vimentin）、結(jié)蛋白（desmin）、膠原蛋白（collagen）Ⅴ等肝星狀細(xì)胞活化的分子標(biāo)志物表達(dá)明顯升高（圖1）。提示在高糖壓力誘導(dǎo)下，肝星狀細(xì)胞活化并向“肌成纖維細(xì)胞”轉(zhuǎn)變。

圖1 高糖處理后肝星狀細(xì)胞活化Fig.1 High glucose induced activation of hepatic stellate cells

2.2 lnc-MALAT1介導(dǎo)高糖誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞活化及向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變結(jié)果表明lnc-MALAT1在HG組表達(dá)明顯升高（圖2A）。α-SMA、波形蛋白、結(jié)蛋白、膠原蛋白Ⅴ等分子在過表達(dá)lnc-MALAT1組的細(xì)胞中表達(dá)明顯升高（圖2B）。提示lnc-MALAT1是調(diào)控高糖誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞活化的重要分子。

圖2 lnc-MALAT1介導(dǎo)高糖誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞活化Fig.2 High glucose activated hepatic stellate cells via lnc-MALAT1

2.3 lnc-MALAT1調(diào)控肝星狀細(xì)胞活化及向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變的分子機(jī)制本研究擬檢測lnc-MALAT1是否通過與FOXO1結(jié)合促進(jìn)SIRT1表達(dá)，促進(jìn)TGF-β通路的激活，進(jìn)而調(diào)控肝星狀細(xì)胞活化及向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變。研究結(jié)果表明，在IG12細(xì)胞系中過表達(dá)lnc-MALAT1，lnc-MALAT1與SIRT1啟動子結(jié)合增多（圖3）。在過表達(dá)lnc-MALAT1的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步用靶向FOXO1的siRNA敲低FOXO1表達(dá)，則lnc-MALAT1與SIRT1啟動子結(jié)合有所減少（圖3）。以上結(jié)果表明，lnc-MALAT1與SIRT1啟動子區(qū)的結(jié)合依賴于FOXO1蛋白，驗(yàn)證了上述假設(shè)。

圖3 lnc-MALAT1通過FOXO1與SIRT1啟動子結(jié)合促進(jìn)其表達(dá)并激活下游TGF-β通路Fig.3 lnc-MALAT1 binds SIRT1 promoter to FOXO1 to promote its expression and activated down stream TGF-βpathway

本研究通過檢測TGF-β通路相關(guān)蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，使用siRNA敲低lnc-MALAT1表達(dá)可降低SIRT1和TGF-β1表達(dá)，降低SMAD2和SMAD3磷酸化水平，但未改變SMAD2、3總蛋白表達(dá)。在使用siRNA敲低lnc-MALAT1表達(dá)的基礎(chǔ)上，使用過表達(dá)質(zhì)粒增加SIRT1的表達(dá)則可提高TGF-β1表達(dá)，提高SMAD2和SMAD3磷酸化水平，但不改變SMAD2、3總蛋白的表達(dá)。以上結(jié)果表明，lnc-MALAT1通過與SIRT1啟動子結(jié)合可提高SIRT1表達(dá)，并進(jìn)一步提高了下游的TGF-β1表達(dá)，提高SMAD2和SMAD3的磷酸化水平，激活了TGF-β通路，促進(jìn)了肝星狀細(xì)胞纖維化。

3 討論

糖尿病患者并發(fā)肝硬化會造成肝功能下降，導(dǎo)致一系列并發(fā)癥，縮短患者生存時間［1-3］。而目前糖尿病并發(fā)肝硬化的分子機(jī)制尚不清楚，限制了臨床干預(yù)糖尿病并發(fā)肝硬化新方法的開發(fā)。本研究從高血糖誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞活化及纖維化入手，揭示了lnc-MALAT1在高葡萄糖糖誘導(dǎo)下表達(dá)升高，通過FOXO1與SIRT1啟動子結(jié)合，可促進(jìn)SIRT1表達(dá)升高，進(jìn)而激活下游的TGF-β信號通路，介導(dǎo)肝星狀細(xì)胞的活化與向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致肝纖維化。

糖尿病最重要的病理生理學(xué)特征之一是高血糖誘導(dǎo)的一系列以慢性炎癥浸潤為特征的細(xì)胞損傷，包括血管內(nèi)皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞損傷等［9-11］?？紤]到lnc-MALAT1在高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損失中亦發(fā)揮重要作用［8］，lnc-MALAT1在高血糖誘導(dǎo)的其他糖尿病并發(fā)癥，如糖尿病視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)病變中也可能具有重要作用，但相關(guān)研究目前仍是空白。未來的研究可能會進(jìn)一步闡釋其相關(guān)作用及機(jī)制，并可能作為糖尿病并發(fā)癥干預(yù)的重要靶點(diǎn)，為糖尿病并發(fā)癥的臨床藥物及干預(yù)策略等開發(fā)提供新的思路。

既往關(guān)于lnc-MALAT1的研究主要是關(guān)注其在各種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的作用，如lnc-MALAT1在乳腺癌中通過結(jié)合并抑制轉(zhuǎn)錄因子TEAD，抑制其與YAP的相互作用并抑制相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移［6］；lnc-MALAT1通過促進(jìn)EGFL7表 達(dá) 促 進(jìn) 腫 瘤 的 侵 襲 和 轉(zhuǎn) 移［12］；lnc-MALAT1通過激活P13K-AKT通路促進(jìn)卵巢癌的增殖和轉(zhuǎn)移［13］；高水平表達(dá)的lnc-MALAT1在膀胱癌中提示不良預(yù)后并促進(jìn)腫瘤的臨床進(jìn)展和轉(zhuǎn)移［14］。因此，lnc-MALAT1是一個很有前景的腫瘤治療潛在靶點(diǎn)。有研究表明，糖尿病患者的惡性腫瘤罹患風(fēng)險遠(yuǎn)高于非糖尿病患者［15-17］。糖尿病患者額外增加的腫瘤罹患風(fēng)險可能與糖尿病高血糖誘導(dǎo)的lnc-MALAT1表達(dá)升高有關(guān)?？紤]到lnc-MALAT1在惡性腫瘤和糖尿病肝纖維化和糖尿病腎小管上皮損傷中均具有重要作用，lnc-MALAT1可作為一個共同的干預(yù)靶點(diǎn)。抑制lnc-MALAT1可減輕糖尿病肝纖維化和腎小管上皮損傷，并同時抑制惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。因此，lnc-MALAT1是一個十分有前景的糖尿病合并惡性腫瘤的干預(yù)靶點(diǎn)。

但本研究也存在一些不足之處：①本研究均為體外實(shí)驗(yàn)，相關(guān)研究的結(jié)論均需要進(jìn)一步在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行驗(yàn)證；②本研究的結(jié)論仍需要臨床標(biāo)本進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證；③lnc-MALAT1在其他疾病模型中被發(fā)現(xiàn)可作為miRNA海綿吸附miRNA，從而調(diào)控下游分子表達(dá)，因此lnc-MALAT1調(diào)控肝星狀細(xì)胞活化及2型糖尿病并發(fā)肝纖維化仍可能存在其他分子機(jī)制，仍需進(jìn)一步探索驗(yàn)證。

總的來說，本研究發(fā)現(xiàn)肝星狀細(xì)胞中l(wèi)nc-MALAT1在高血糖誘導(dǎo)下表達(dá)升高，并可通過促進(jìn)SIRT1表達(dá)激活TGF-β通路，促進(jìn)肝星狀細(xì)胞向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變，進(jìn)而促進(jìn)肝纖維化。