脊髓背角miR-16-5p可能通過靶向Akt3調(diào)節(jié)帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛

張德新，張桂友

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院疼痛科，貴州 遵義 563000)

帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛(PHN)是帶狀皰疹(HZ)最常見的后遺癥，HZ愈合后超過1個(gè)月仍存在原皮損區(qū)疼痛，則為PHN[1]。中國(guó)醫(yī)院內(nèi)統(tǒng)計(jì)顯示，HZ的發(fā)病率為7.7%，PHN的發(fā)病率為2.3%，其中29.8%的HZ患者會(huì)發(fā)展為PHN[2]。目前尚缺乏良好的PHN治療藥物及方法，其中原因之一為PHN的疼痛機(jī)制尚未闡明[3]。

MiRNA是具有調(diào)控功能的非編碼RNA，主要通過與靶基因結(jié)合，抑制后者的功能。因其生物學(xué)效應(yīng)顯著、分子量小(22 nt左右)、易于合成和改良，具有很好的臨床應(yīng)用前景。神經(jīng)病理性疼痛動(dòng)物模型能誘導(dǎo)背根神經(jīng)節(jié)、脊髓背角、海馬及前扣帶皮層中的miRNA出現(xiàn)差異性表達(dá)，miRNA在NP中的作用機(jī)制可能涉及神經(jīng)炎性反應(yīng)、突觸可塑性、神經(jīng)元興奮性和DNA甲基化[4]。MiRNA作為一種微型介質(zhì)，有可能成為神經(jīng)病理性疼痛的生物學(xué)標(biāo)志物及可能潛在的治療靶點(diǎn)，從而為神經(jīng)病理性疼痛提供更好的診斷和治療方法[5]?？梢妋iRNA參與了神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SPF級(jí)C57/BL6J小鼠24只，體重25～30 g，鼠齡6～8周，購(gòu)于長(zhǎng)沙天勤生物技術(shù)有限公司，證書編號(hào)：SCXK(湘)2014-0011。飼養(yǎng)于貴州省麻醉與器官保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房。

1.1.2主要試劑 BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天，上海)；CIP buffer(Exiqon，丹麥)；CIP酶(Exiqon，丹麥)；DEPC水(Solarbio，北京)；HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(博士德，武漢)；HRP標(biāo)記羊抗小鼠二抗(博士德，武漢)；Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit(Clontech，美國(guó))；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara，日本)；RNAiso Plus(Takara，日本)；樹脂毒素(RTX，Acros，美國(guó))；RIPA裂解液(碧云天，上海)；TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus,Takara，日本)；TEMED(國(guó)藥集團(tuán)，上海)；兔多抗Akt3一抗(ab152157,Abcam，英國(guó))；三氯甲烷(氯仿,川東化工，重慶)；吐溫-80(Solarbio，北京)；無水乙醇(川東化工，重慶)；小鼠單抗β-actin一抗(博士德，武漢)；異丙醇(富宇，天津)。

1.1.3主要儀器 -80 ℃低溫冰箱(Thermo Fisher，美國(guó))；ATY224電子分析天平(亞萊博，杭州)；ChemiDocTM MP成像系統(tǒng)(Bio-Rad，美國(guó))；Milli-Q Integral超純水系統(tǒng)(Millipore，美國(guó))；NanoDrop ND-1000分光光度計(jì)(Thermo Fisher，美國(guó))；聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀(Bio-Rad，美國(guó))；Plantar Test儀(IITC，美國(guó))；von Frey纖維絲(Danmic，美國(guó))；垂直電泳儀(Bio-Rad，美國(guó))；低溫高速離心機(jī)(Thermo Fisher，美國(guó))；多功能酶標(biāo)儀(Thermo Fisher，美國(guó))；濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad，美國(guó))。

1.2方法

1.2.1PHN小鼠建模及痛閾測(cè)定 將小鼠分為PHN組和Vehicle組，每組12只，PHN組腹腔注射10 μg/kg RTX構(gòu)建PHN小鼠模型，建模成功后小鼠可出現(xiàn)同PHN患者類似的熱痛覺減退(熱痛閾升高)和機(jī)械痛覺超敏(機(jī)械痛閾降低)[6-8]。Vehicle組注射等量的RTX溶劑(10%乙醇、10%吐溫-80與生理鹽水混合溶液)。在RTX和Vehicle注射前及注射后第 4、7、14、21、28天，通過測(cè)定PHN小鼠足底熱痛閾、機(jī)械痛閾確認(rèn)建模成功。

熱痛閾測(cè)定：熱痛閾通過檢測(cè)熱縮足潛伏期(TWL)采用Hargreaves熱輻射法測(cè)定。保持室溫18～20 ℃，將小鼠分別放在罩有有機(jī)玻璃外殼的透明玻璃表面上適應(yīng)環(huán)境30 min。適應(yīng)環(huán)境30 min后，使用足底輻射熱痛覺測(cè)試儀(Plantar Test儀，IITC公司)，將熱輻射光源直接放置在左后爪的正下方后，激活設(shè)備，記錄小鼠縮足、甩腿、舔足等動(dòng)作的時(shí)間，超過30 s后仍未縮足、甩腿、舔足，記錄儀器自動(dòng)停止時(shí)間記為30 s，每只測(cè)試3次，每次測(cè)量間隔5 min，3次測(cè)量的平均值為TWL。

機(jī)械痛閾測(cè)定：機(jī)械痛閾通過檢測(cè)機(jī)械退縮閾值(MWT)，采用von Frey纖維絲測(cè)痛套件(Damic，美國(guó))，由小到大依次使用不同力度的von Frey纖維絲由下往上垂直刺激小鼠足底皮膚，逐漸加大力度至合適刺激強(qiáng)度[9-10]，觀察后足回縮反應(yīng)(或舔足、甩腿等)時(shí)的刺激強(qiáng)度，在5次測(cè)量中，至少有3次出現(xiàn)縮足反應(yīng)，測(cè)量結(jié)束，每次測(cè)量間隔5 min，3次測(cè)量的平均值為MWT。

1.2.2脊髓背角取材 在建模前及建模后的第14天分別取PHN組與Vehicle組小鼠脊髓背角。首先用七氟烷對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉，待充分麻醉后取俯臥位，暴露T11～L3段脊柱，用脊髓適配器固定小鼠脊柱。沿脊髓走形剖開小鼠皮膚及皮下組織，咬骨鉗輔助暴露T13～L1脊柱下的脊髓(即脊髓腰膨大部分，脊髓L3～L5節(jié)段)，再取膨大處背側(cè)脊髓，-80 ℃凍存直至使用。

1.2.3PCR檢測(cè)miR-16-5p、Akt3表達(dá) 使用RNAiso Plus(Takara，日本)提取總RNA。采用Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit(Clontech，美國(guó))和PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara，日本)進(jìn)行RNA的反轉(zhuǎn)錄。用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Takara，日本)對(duì)RNA進(jìn)行擴(kuò)增。使用2-ΔΔCt計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。引物見表1。

1.2.4Western blotting檢測(cè)Akt3表達(dá) 加200 μL裂解液裂(含2 μL苯甲基磺酰氟、2 μL磷酸酶抑制劑)，置于自動(dòng)勻漿機(jī)中勻漿，將離心管置于冰上30 min充分裂解。30 min后，將裂解液移至1.5 mL離心管中，12 000 r/min離心力4 ℃離心5 min，取蛋白上清。樣品稀釋20倍，用 BCA 法測(cè)定蛋白濃度。每孔加入40 μg蛋白進(jìn)行電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜上； PVDF膜用含5%脫脂奶粉TBST(封閉液)浸泡，室溫?fù)u床封閉2 h。用封閉液稀釋相應(yīng)一抗，使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4 ℃過夜。TBST充分洗滌5次，每次5 min。用TBST稀釋相應(yīng)二抗(1∶5 000稀釋)，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，37 ℃搖床孵育2 h。TBST洗滌5次，每次5 min。將電化學(xué)發(fā)光法(ECL)試劑中增強(qiáng)液與穩(wěn)定的過氧化物酶溶液按1∶1比例混合，反應(yīng)約2 min，將PVDF膜平放在曝光板上，將混合均勻的顯影液覆蓋在PVDF膜的正面充分反應(yīng)，依照發(fā)光的強(qiáng)度選擇不同的曝光時(shí)間。

2 結(jié) 果

2.1PHN小鼠模型的建立 PHN組小鼠在第14天開始出現(xiàn)穩(wěn)定的熱痛閾升高和機(jī)械痛閾的下降，Vehicle組小鼠痛閾未見變化。見圖1。

2.22組脊髓背角miR-16-5p、Akt3表達(dá)情況比較 與Vehicle組比較，在建模后的第14天，PHN組miR-16-5p表達(dá)下調(diào)，Akt3表達(dá)上調(diào)；進(jìn)一步用western blotting檢測(cè)Akt3蛋白的表達(dá)，與Vehicle組比較，在建模后的第14天，PHN組Akt3蛋白表達(dá)上調(diào)。見圖2。

3 討 論

本研究通過RTX腹腔注射構(gòu)建PHN小鼠模型，并分別在建模后第14天取脊髓背角組織。PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-16-5p在建模后第14天下調(diào)，進(jìn)一步檢測(cè)miR-16-5p的靶基因Akt3，發(fā)現(xiàn)Akt3的mRNA及蛋白表達(dá)均上調(diào)。已有多項(xiàng)研究報(bào)道，Akt3是miR-16-5p的靶基因[11-13]。進(jìn)一步推論miR-16-5p可能通過靶向作用于Akt3，從而在PHN疼痛的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

MiRNA是具有調(diào)控功能的非編碼RNA，通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控神經(jīng)病理性疼痛的病理過程[14-15]。MiRNA在慢性疼痛患者和健康對(duì)照之間存在顯著差異，這些異常表達(dá)的miRNA與炎癥調(diào)節(jié)、傷害性信號(hào)傳遞及蛋白激酶功能相關(guān)[16]。BAI等[17]在2007年首次報(bào)道了炎性疼痛模型中miRNA的異常表達(dá)，在疼痛大鼠的三叉神經(jīng)節(jié)中，miR-10a、miR-29a、miR-98、miR-99a、miR-124a、miR-134和miR-183的表達(dá)下調(diào)。HUANG等[18]檢測(cè)HZ和PHN患者血清miRNA的表達(dá)譜差異發(fā)現(xiàn)，有5個(gè)miRNA可能參與了HZ向PHN轉(zhuǎn)化過程。QIU等[19]通過分析PHN模型大鼠同側(cè)背根神經(jīng)節(jié)的基因表達(dá)GSE64345數(shù)據(jù)組，并通過基因本體對(duì)差異基因進(jìn)行分析，分別發(fā)現(xiàn)了11、31個(gè)與神經(jīng)病理性疼痛和炎癥相關(guān)的miRNA。ZOU等[20]通過大鼠腹腔注射RTX構(gòu)建PHN模型，并給予電針處理，發(fā)現(xiàn)電針通過增加miR-223-3p的表達(dá)抑制PHN中的神經(jīng)元細(xì)胞自噬。

既往已有miR-16-5p可能參與疼痛調(diào)節(jié)的報(bào)道[21-23]。TANG等[21]通過生物信息分析發(fā)現(xiàn)在保留性神經(jīng)損傷的神經(jīng)病理性疼痛動(dòng)物模型的背根神經(jīng)節(jié)中，有80個(gè)差異表達(dá)的基因，并預(yù)測(cè)miR-16-5p可能參與了神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生、發(fā)展，有望成為神經(jīng)病理性疼痛診斷和治療的靶點(diǎn)。CCI大鼠模型的脊髓背角中miR-16表達(dá)上調(diào)，通過鞘內(nèi)注射抑制劑使其表達(dá)下調(diào)，可以顯著減輕CCI大鼠的熱痛和機(jī)械痛覺過敏[22]。在CFA誘導(dǎo)的炎癥性疼痛大鼠模型的脊髓背角中，miR-16表達(dá)水平降低，RAB23表達(dá)水平明顯升高，通過鞘內(nèi)注射miR-16可緩解疼痛，提高痛閾值，注射RAB23后加重疼痛；螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)，RAB23是miR-16的直接靶基因，提示miR-16通過靶向RAB23和抑制P38 MAPK的激活來緩解慢性炎癥性疼痛[23]。本課題組在臨床上收集了5例PHN患者雙側(cè)皮膚，通過miRNA芯片篩查發(fā)現(xiàn)，與健康側(cè)皮膚比較PHN患者疼痛側(cè)皮膚中差異miRNA共317個(gè)，其中有67個(gè)在PHN組上調(diào)，250個(gè)下調(diào)。從芯片篩選出的差異miRNA中選取19個(gè)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示miR-16-5p和其他5個(gè)miRNA的表達(dá)趨勢(shì)和芯片結(jié)果相同[24]。以上研究提示，miR-16-5p可能參與PHN疼痛的發(fā)生、發(fā)展。

Akt是一種絲/蘇氨酸激酶，又名蛋白激酶B，其是磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)下游的重要靶點(diǎn)，通過磷酸化、調(diào)控凋亡蛋白和轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)PI3K通路的關(guān)鍵功能[25-26]。已有多項(xiàng)研究提示，Akt參與疼痛調(diào)節(jié)[27-30]。ZHANG等[27]發(fā)現(xiàn)，隱丹參酮通過抑制PI3K/Akt通路中Akt的磷酸化減輕CCI術(shù)后神經(jīng)痛。在脊神經(jīng)結(jié)扎和CCI大鼠背根神經(jīng)節(jié)和脊髓背角中Akt活性增加，p-Akt增加，給予PI3K或Akt抑制劑后，可減輕模型的神經(jīng)病理性疼痛[28-29]。有學(xué)者總結(jié)了PI3K/Akt通路的激活促進(jìn)坐骨神經(jīng)損傷、糖尿病周圍神經(jīng)病變、脊髓損傷、骨癌、阿片類藥物引起的痛覺過敏等慢性疼痛的進(jìn)展及維持[30]。

以上Akt與疼痛關(guān)系的研究，均是在總蛋白水平，既往關(guān)于Akt各亞型與疼痛的報(bào)道很少。近幾年已有Akt3參與疼痛調(diào)節(jié)的研究。PASKU等[31]在腰椎間盤突出患者中分析3種Akt亞型的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)Akt1和Akt3存在顯著的正相關(guān)，在腰椎間盤突出中具有協(xié)同作用；在急性疼痛患者中Akt2表達(dá)上調(diào)，提示Akt2可能與急性炎癥和吞噬相關(guān)。近年來在CCI大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，miR-15a、miR-20b-5p、miR-150、miR-145表達(dá)明顯降低，并預(yù)測(cè)Akt3為靶基因，通過過表達(dá)miR-15a、miR-20b-5p、miR-150、miR-145，靶向使Akt3表達(dá)下調(diào)，使CCI大鼠熱痛和機(jī)械痛覺過敏緩解，提示Akt3可能參與了CCI大鼠疼痛的發(fā)生、發(fā)展[32-35]。

本研究考慮miR-16-5p的靶基因?yàn)锳kt3，且已有多項(xiàng)研究報(bào)道Akt3是miR-16-5p的靶基因[11-13]。例如，在乳腺癌患者中發(fā)現(xiàn)miR-16-5p低表達(dá)，且miR-16-5p低表達(dá)的乳腺癌患者生存率低于高表達(dá)miR-16-5p患者；螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)Akt3為miR-16-5p的靶基因，miR-16-5p通過抑制核因子-κB(NF-κB)通路和靶向作用于Akt3，抑制乳腺癌的發(fā)展[11]。在胃癌患者和胃癌細(xì)胞系中，環(huán)狀RNA circNF1可與miR-16結(jié)合，螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示miR-16抑制Akt3表達(dá)[12]。口腔鱗癌患者和細(xì)胞系中，miR-16表達(dá)下調(diào)，螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-16通過靶向作用于Akt3抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[13]。

以上研究均提示miR-16-5p可以通過靶向作用于Akt3發(fā)揮生物學(xué)功能，但目前還沒有miR-16-5p靶向作用于Akt3調(diào)節(jié)疼痛的相關(guān)研究。盡管如此，已有研究提示miR-15a、miR-20b-5p、miR-150、miR-145等可靶向作用于Akt3參與調(diào)控CCI大鼠疼痛的發(fā)生、發(fā)展[32-35]。本研究也間接證明了miR-16-5p可能通過靶向作用于Akt3參與調(diào)控PHN疼痛的發(fā)生、發(fā)展。