2,4-二硝基苯酚輻射增敏及相關機制

李曉俊，許玉杰

(蘇州大學附屬獨墅湖醫(yī)院，江蘇 蘇州 215124)

當今社會，惡性腫瘤已逐漸成為人類死亡的第一殺手，而腫瘤的治療手段主要有手術、放化療、生物治療、免疫治療等。目前臨床上有超過一半的腫瘤需要接受放療[1-2]，為了提高放療效果，臨床上常利用放射增敏藥物來增強射線對腫瘤的殺傷作用。目前已有研究證實，硝基咪唑類藥物[3-4]，如順鉑、吉西他濱、紫杉醇等化療藥物[5-7]；有些分子靶向藥物，如表皮生長因子受體(EGFR)、蛋白激酶B(AKT)抑制劑[8-9]；以及有些合成納米材料[10]、中草藥[11]等也具有輻射增敏作用，但尋找新的具有放射增敏的藥物一直是腫瘤放療的研究方向之一。

2，4-二硝基苯酚(DNP)是一種線粒體解偶聯(lián)劑，其能通過抑制細胞腺苷二磷酸(ADP)的磷酸化，從而抑制細胞的能量代謝。腫瘤細胞是一種高耗能的細胞，而且腫瘤細胞受射線損傷后，其自身的增殖及對輻射損傷的修復都需要很大的能量。因此，設想通過使用DNP來抑制受損腫瘤細胞的修復，從而達到輻射增敏的效果。本文擬通過研究DNP對Hela及KB細胞的效應，評估該藥是否具有輻射增敏能力，并且探討其可能存在的相關機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株 Hela細胞(宮頸癌細胞)、KB細胞(口腔上皮癌細胞)均購于中科院上海細胞庫。

1.1.2藥物與試劑 DNP粉末購于武漢福德化工公司；改良型RPMI-1640培養(yǎng)基、青霉素鏈霉素雙抗、DMEM高糖培養(yǎng)基均購于Hyclone公司；胎牛血清(Biological Industries)； 胰酶溶液(上海源培生物有限公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS)(自配)；MTT(Biosharp)；吉姆薩染色液(珠海貝索生物技術有限公司)；細胞周期檢測試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒均購于江蘇碧云天生物技術公司；電鏡專用戊二醛(上海源葉生物公司)；鋨酸(上海斯百全化學有限公司)；LC3B(LC3-Ⅰ/Ⅱ)(1∶1 000,ab48394,Abcam)；兔抗-LC3B-Ⅱ(1∶2 000，Abcam,ab48394)。

1.1.3儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermo公司)；X線輻照儀(RAD SOURCE RS2000 Pro Biological Irradiator)；手持式細胞計數儀(MILLIPORE公司)；多功能酶標儀(美國Biotek公司)；流式細胞檢測儀(型號FACSVerse 美國BD)；透射電子顯微鏡(美國FEI公司)。

1.2方法

1.2.1MTT法檢測細胞增殖 將對數生長期的Hela、KB細胞分別接種到96孔板上，每孔加入細胞數目約為4 000個，同時設置空白孔，置于培養(yǎng)箱過夜。移除培養(yǎng)液，分別加入提前配置的濃度梯度分別為0、100、200、300、400 μmol/L DNP的培養(yǎng)液，作用24 h后移除培養(yǎng)液，每孔加入20 μL、5 mg/L的MTT溶液，繼續(xù)避光培養(yǎng)4 h。移除上清液，每孔分別加入100 μL 二甲基亞砜(DMSO)溶液，使結晶充分溶解后，在酶標儀上設置檢測波長為490 nm，檢測各孔的吸光度值，計算Hela、KB細胞增殖抑制率。

1.2.2細胞克隆形成實驗計算輻射增敏比 將對數生長期的Hela、KB細胞分別接種到6孔板上，然后將6孔板分為A組(單純照射組，0、2、4、6、8 Gy)、B組(照射加藥組，0、2、4、6、8 Gy+200 μmol/L DNP),并根據劑量梯度接種細胞數目分別為300、500、800、2 000及10 000個，待細胞完全貼壁后，將A、B組細胞均置于X線機下接受不同劑量X線輻照(輻照條件160 kV、25 mA，劑量率為0.02 Gy/s)，然后B組加入200 μmol/L DNP培養(yǎng)液作用24 h后，予PBS清洗，加入新鮮培養(yǎng)基。2組細胞均每2天更換1次新培養(yǎng)基，培養(yǎng)10～12 d可見細胞集落形成時終止培養(yǎng)，予甲醇固定，用吉姆薩染色液染色。顯微鏡下計數細胞數目>50的集落為一個克隆形成，小于50的則舍棄，根據對照組的克隆形成數，計算克隆形成率，根據單擊多靶分別擬合計算輻射增敏比。

1.2.3細胞周期檢測 取對數生長期的Hela、KB細胞，分別接種到6孔板上，然后分成4組，分別為對照組、加藥組(200 μmol/L)、照射組(4 Gy)及照射加藥組(4 Gy+200 μmol/L),每組3個平行樣，根據分組予輻照及200 μmol/L DNP作用24 h后，收集各組細胞，以乙醇溶液固定過夜，碘化丙啶染色液染色，避光水浴，流式細胞儀檢測各組細胞周期分布情況。

1.2.4線粒體膜電位檢測 同細胞周期檢測，將對數生長期的Hela、KB細胞接種后，分成4組，根據分組處理細胞，然后收集各組細胞；根據試劑盒要求配制JC-1染色工作液，將染色工作液與收集的細胞孵育20 min，采用流式細胞儀檢測。

1.2.5透射電子顯微鏡觀察檢測細胞自噬 接種對數生長期的Hela、KB細胞，將細胞分為2組，一組無特殊處理為對照組，另一組使用200 μmol/L DNP作用24 h為實驗組，分別收集各組細胞(收集的細胞數目要大于107個)，予電鏡專用的2.5%戊二醛固定溶液固定，并將固定細胞用瓊脂包裹，再將包裹細胞的瓊脂塊置于1%的鋨酸固定液固定，然后用不同濃度的丙酮(70%、80%、90%、100%)梯度脫水，最后將脫水后的細胞樣品由包埋劑包埋，然后切片，醋酸鈾染色，透射電子顯微鏡觀察檢測。

1.2.6Western blotting 檢測蛋白表達 接種對數生長期的Hela、KB細胞，將細胞分為2組，一組無特殊處理為對照組，另一組使用200 μmol/L DNP作用24 h為實驗組，各組加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，低溫裂解5 min。予超聲振蕩后低溫靜置30 min，離心取上清蛋白進行定量及變性。配制電泳凝膠，取變性后的蛋白進行上樣電泳及轉膜，轉膜結束后予脫脂牛奶封閉NC膜2 h。加入一抗，低溫孵育過夜，PBST清洗NC膜，加入二抗常溫孵育2 h，再次清洗NC膜，最后予電化學發(fā)光(ECL)試劑進行顯色，Image J軟件分析各組灰度值。

2 結 果

2.1DNP對Hela、KB細胞的抑制 Hela及KB細胞經不同濃度DNP(0、100、200、300、400 μmol/L)處理 24 h，結果顯示，隨著藥物濃度的增加，Hela、KB細胞的活力逐漸降低，見圖1。

2.2細胞克隆形成實驗檢測細胞增殖能力的影響 通過克隆形成實驗也表明，DNP對Hela細胞增殖具有明顯抑制作用，藥物濃度越高，效果越明顯，與MTT實驗結果相一致，見表1。

表1 不同濃度DNP作用24 h后Hela、KB細胞存活率比較

2.3細胞克隆形成實驗檢測DNP的輻射增敏作用 Hela及KB細胞受不同劑量X線照射，再經過200 μmol/L的DNP 作用24 h后，其克隆形成率明顯下降，細胞存活率顯著降低，見表2。通過單擊多靶擬合計算(圖3、表3)，Hela及KB對照組D0分別為1.65、2.35，實驗組D0分別為1.14、1.99；根據放射增敏公式SERD0=對照組D0/實驗組D0計算200 μmol/L DNP作用下Hela、KB細胞的輻射增敏比分別為1.45、1.18，均具有一定的輻射增敏能力。

表3 200 μmol/L DNP作用下Hela、KB放射增敏參數及放射增敏比

表2 不同劑量X線及聯(lián)合200 μmol/L DNP作用下Hela、KB細胞存活率比較

2.4DNP影響細胞周期分布 Hela及KB細胞經過4 Gy X線照射，然后經DNP作用24 h后，細胞周期出現明顯變化，G2/M細胞明顯增多，見圖4、表4，這可能是DNP誘導產生輻射增敏作用的機制之一。

表4 不同處理條件下Hela、KB細胞周期分布(%)

2.5DNP影響細胞線粒體膜電位 通過流式細胞儀分析發(fā)現，DNP對Hela細胞線粒體膜電位具有明顯的影響，顯著降低了線粒體膜電位，結果見圖5、表5；這種線粒體膜電位的降低，可能是其輻射增敏效應的產生機制。

表5 各組Hela、KB細胞紅綠熒光比例比較

2.6DNP促進細胞自噬小體產生 通過透射電子電鏡觀察正常Hela及KB細胞，發(fā)現細胞的結構清晰，線粒體濃染致密，細胞核完整，細胞漿中沒有發(fā)現吞噬小體。但經過200 μmol/L的DNP作用24 h后，Hela及KB細胞內中出現大量的不同形狀的自噬小體。見圖6。

2.7DNP作用24 h后LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ表達影響 通過western blotting實驗發(fā)現，200 μmol/L DNP作用24 h后，與對照組相比，Hela及KB細胞的LC3-Ⅱ表達明顯升高，并且LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值也有所升高。見圖7。

3 討 論

放療是當前腫瘤治療中的重要手段，而放療既有其優(yōu)越性，也有一定的局限性，如腫瘤細胞的輻射抵抗就是當前放療中的難題。面對這一問題，臨床上常引入放射增敏劑來解決，雖然目前已有放射增敏藥物應用于臨床，但是尋找新的具有放射增敏的藥物，也是腫瘤放療的研究熱點之一。

DNP是一種能夠抑制細胞氧化磷酸化的解偶聯(lián)劑，其基本不影響生物體的氧化作用，但其能阻止磷酸化的進行，從而抑制ATP的生成，而氧化釋放的能量則以熱能的形式散發(fā)[12]。目前，對于DNP的研究主要集中在治療神經系統(tǒng)疾病及代謝性疾病[13-14]，但已有學者嘗試研究DNP對腫瘤細胞的殺傷效應，并取得了較好的細胞增殖抑制效果，但其是否能夠作為輻射增敏劑還需進一步研究[15-16]。本研究通過MTT法同樣證實了DNP對Hela及KB細胞有增殖抑制作用。

為了探究DNP是否具有輻射增敏作用，本研究選擇了200 μmol/L DNP作為進一步的實驗條件，利用細胞克隆形成實驗，并通過單擊多靶擬合計算200 μmol/L DNP作用24 h，Hela及KB細胞的輻射增敏比分別為1.45、1.18，均具有一定的輻射增敏能力。

現已有研究證實，G2/M期的細胞對輻射的敏感性更強，調控細胞的周期分布是調節(jié)腫瘤細胞輻射增敏的機制之一[17]。另外，改變細胞的能量代謝、提高細胞凋亡或自噬能力也是輻射增敏的可能機制[18]。為了探究DNP輻射增敏是否具有相關機制，本研究通過流式細胞儀分析了DNP對Hela、KB細胞周期分布及線粒體膜電位的影響，發(fā)現DNP能夠引起線粒體膜電位的降低，以及引起G2/M期細胞周期阻滯情況。另外，通過透射電子顯微鏡發(fā)現，與對照組相比，DNP作用后Hela及KB細胞內能夠觀察到更多自噬小體的形成。最后通過western blotting實驗發(fā)現，DNP作用后，Hela及KB細胞內的LC-Ⅱ表達明顯升高，與對照組相比LC-Ⅱ/LC-Ⅰ值也明顯有所升高。

綜上所述，DNP能夠抑制腫瘤細胞增殖，并且具有輻射增敏效應，其作用機制可能包括DNP誘導細胞G2/M期周期阻滯，引起細胞線粒體膜電位下降而抑制線粒體功能，通過促進細胞自噬效應，啟動細胞死亡過程等，但更進一步的分子機制還有待繼續(xù)實驗探究。