復(fù)合益生菌發(fā)酵玉米-豆粕型飼料的品質(zhì)評(píng)價(jià)及抑菌性能研究

丁亞偉，劉 月, 徐艷輝，王雅麗，王海玉，郝慶紅,4，段春輝*，郭云霞,,4*，紀(jì)守坤，嚴(yán) 慧，劉月琴，張英杰

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，河北 保定 071001；2.河北省畜牧獸醫(yī)研究所，河北 保定 071001；3.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071001；4.農(nóng)業(yè)微生物河北省工程中心，河北 保定 071001)

發(fā)酵飼料可降解飼料中大分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[1]，利于幼齡動(dòng)物腸道的消化吸收。益生菌在發(fā)酵過程中還產(chǎn)生有機(jī)酸和風(fēng)味物質(zhì)，酸化的飼料可防止飼料霉變，抑制有害菌生長(zhǎng)，進(jìn)而減弱大腸桿菌致腸毒癥的能力[2]，發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有機(jī)酸可以激活與蛋白質(zhì)和碳水化合物有關(guān)消化酶，提高飼料營(yíng)養(yǎng)利用率[3]，最終達(dá)到增強(qiáng)免疫力促進(jìn)生長(zhǎng)的目的[4]。芽孢桿菌是最理想的發(fā)酵菌種，可形成芽孢，屬于兼性厭氧菌，生命力頑強(qiáng)，具有較高的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性，產(chǎn)生活性抑菌物質(zhì)，且獨(dú)特的奪氧機(jī)制為厭氧菌提供生長(zhǎng)條件，同時(shí)還產(chǎn)生B族維生素和維生素C等。生產(chǎn)中常用的芽孢桿菌有地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌。乳酸菌因其發(fā)酵可產(chǎn)生乳酸提供酸性環(huán)境，可抑制有害菌的增殖，在生產(chǎn)中也被廣泛應(yīng)用。近年來發(fā)酵飼料作為優(yōu)質(zhì)的替抗產(chǎn)品在單胃動(dòng)物中研究較多，在幼齡反芻動(dòng)物中研究較少。本試驗(yàn)以玉米、豆粕、麩皮為發(fā)酵底物，以前期篩選的抗腹瀉地衣芽孢桿菌(Y5-39)[5]、乳酸桿菌(RSG-1)、枯草芽孢桿菌(B-1)為發(fā)酵菌種，研究飼料經(jīng)復(fù)合益生菌發(fā)酵后營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的變化及對(duì)腹瀉病原菌的抑制作用，為益生菌發(fā)酵料的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間及地點(diǎn)

本試驗(yàn)于2021年3月在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院完成。

1.2 菌種及培養(yǎng)基

發(fā)酵菌種：枯草芽孢桿菌B-1(CGMCC22064)，地衣芽孢桿菌Y5-39(CGMCC22062)，乳酸桿菌RSG-1(CGMCC22061)。腹瀉病原菌：大腸桿菌(E.coli)、沙門氏菌(Salmonella)和痢疾桿菌(ShigellaCastellani)。所有菌種均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院制藥工程系實(shí)驗(yàn)室分離并保存。根據(jù)Design-Expert軟件中Mixture模型，設(shè)計(jì)不同菌種分組，以酸溶蛋白為響應(yīng)值，最終得到乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌1∶1∶4復(fù)合。

瓊脂培養(yǎng)基(NA)：瓊脂20 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，蛋白胨10 g、1 L蒸餾水，pH 7.2～7.4；發(fā)酵培養(yǎng)基(NB)：牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，蛋白胨10 g，1 L蒸餾水，pH7.2～7.4；肉湯培養(yǎng)基(MRS)：蛋白胨10 g、牛肉粉5 g、酵母粉5 g、葡萄糖20 g、吐溫80 1 mL、磷酸氫二鉀2 g、乙酸鈉5 g、檸檬酸三銨2 g、硫酸鎂0.2 g、硫酸錳0.05 g、瓊脂粉15 g、1 L蒸餾水，pH7.2～7.4。使用前121 ℃滅菌20 min。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)中飼料原料(衡水某畜牧有限公司提供)按處理方式分別為對(duì)照組和發(fā)酵組，對(duì)照組不做處理，發(fā)酵組用復(fù)合益生菌接種，接種量10%、含水量45 %，裝瓶室溫(30 ℃，發(fā)酵瓶容積為350～400 g)密閉發(fā)酵14 d。發(fā)酵結(jié)束后分別檢測(cè)兩組營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量、酸溶蛋白、pH、消化酶、揮發(fā)性脂肪酸、抗原蛋白、霉菌毒素等指標(biāo)，并進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，檢測(cè)抑菌效果。

1.4 指標(biāo)測(cè)定與方法

1.4.1 酸溶蛋白的測(cè)定 取烘干后對(duì)照組和試驗(yàn)組飼料各3 g于50 mL離心管中，加入25 mL 15%三氯乙酸靜置沉淀4 h，離心取5 mL上清，后按照GB/T6432《飼料中粗蛋白測(cè)定方法》[6]測(cè)定酸溶蛋白含量。

1.4.2 常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定 取烘干后兩組的飼料各50 g樣品，105 ℃烘干20 min，65 ℃烘48 h后，粉碎過60目篩，干物質(zhì)(DM)、粗蛋白(CP)、中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)、粗脂肪(EE)含量參照《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)》[7]測(cè)定。

1.4.3 消化酶含量與抗原蛋白測(cè)定 飼料中淀粉酶采用α-淀粉酶(α-amylase，α-AL)試劑盒測(cè)定，蛋白酶采用酸性蛋白酶(Acid protease, ACP)試劑盒檢測(cè)，脂肪酶采用脂肪酶(Lipase，LPS)試劑盒檢測(cè)，纖維素酶采用纖維素酶(Cellulase，CL)試劑盒檢測(cè)。酶含量檢測(cè)試劑盒均購自索萊寶試劑公司。大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白采用大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白試劑盒(龍科方舟生物工程有限公司)測(cè)定，操作步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.4 毒素的測(cè)定 黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素測(cè)定方法參照GB/13078-2017《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行測(cè)定。

1.4.5 pH與有機(jī)酸測(cè)定 樣品與蒸餾水按1∶10放于錐形瓶中，37 ℃、180 r/min振蕩30 min得到飼料浸提液，用pH計(jì)(PSH-3D，梅特勒-托利多)測(cè)定pH。參照孫蕊[8]等的方法，稱取適量樣品(1 g)于10 mL容量瓶，加流動(dòng)相(0.01 mol/L磷酸二氫鉀，pH=2.55)定容至刻度，超聲30 min，利用高效液相色譜法(HPLC)進(jìn)行樣品中乳酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸含量的測(cè)定，色譜柱(C18柱，250 mm×4.6 mm×5 um)，流速(0.5 mL/min)，柱溫(35 ℃)進(jìn)樣量(10 μL)，檢測(cè)波長(zhǎng)(210 nm)。有機(jī)酸計(jì)算公式：

式中：X為樣品中有機(jī)酸的含量，mg/kg；m為樣品稱樣量，g；V為樣品定容體積，mL；C為各有機(jī)酸在標(biāo)曲上計(jì)算的濃度，μg/mL。

1.4.6 微生物含量的檢測(cè) 芽孢桿菌參照GB/T26428-2010《飼用微生物制劑中枯草芽孢桿菌的檢測(cè)》、乳酸桿菌參照GB4789.35-2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》。其中芽孢桿菌計(jì)數(shù)選用NA培養(yǎng)基，乳酸桿菌計(jì)數(shù)選用MRS培養(yǎng)基。

1.4.7 抑菌試驗(yàn)E.coli、沙門氏菌、痢疾桿菌接種到NB中，于37 ℃、180r/min培養(yǎng)24 h。按1∶100(病原菌：培養(yǎng)基)在NA中分別接種大腸桿菌、沙門氏菌、痢疾桿菌菌懸液，于滅菌培養(yǎng)皿中傾注15～20 mL的NA，制成病原菌平板。取未烘干的對(duì)照組和發(fā)酵組各10 g樣品，分別加入100 mL正丁醇在37 ℃，45k Hz下超聲波震蕩浸提1 h，3 000 r/min離心10 min，收集上清液備用，用平板對(duì)峙試驗(yàn)在病原菌平板上打孔，加入60 μL浸提液，每個(gè)樣品9個(gè)平行，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，記錄抑菌圈直徑大小。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)基礎(chǔ)整理采用WPS軟件，采用SPSS軟件中T-text檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，以P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料對(duì)常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分的影響

由表1可知，與對(duì)照組相比，飼料經(jīng)復(fù)合益生菌發(fā)酵后粗蛋白含量極顯著增加了11.27%(P<0.01)，酸溶蛋白含量極顯著增加了498.06%(P<0.01)，干物質(zhì)、粗灰分、粗脂肪、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)。

表1 飼料發(fā)酵前后營(yíng)養(yǎng)成分分析(干物質(zhì)基礎(chǔ))

2.2 復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料對(duì)抗原蛋白及消化酶的影響

復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料對(duì)抗原蛋白及消化酶的影響見表2。由表2可知，飼料經(jīng)復(fù)合益生菌發(fā)酵后極顯著降低了大豆抗原蛋白、β-伴大豆球蛋白含量(P<0.01)，分別下降了70.85%和66.59%，淀粉酶、纖維素酶和脂肪酶極顯著增加(P<0.01)，酸性蛋白酶顯著提高(P<0.05)。

表2 復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料對(duì)抗原蛋白及消化酶的影響

2.3 復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料對(duì)霉菌毒素含量的影響

復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料對(duì)霉菌毒素含量的影響見表3。由表3可知，與對(duì)照組相比，復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料中黃曲霉毒素B1和嘔吐毒素含量分別降低44.41%(P<0.01)和79.04%(P<0.01)，玉米赤霉烯酮降低了16.89%(P<0.05)。

表3 復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料對(duì)霉菌毒素含量的影響

2.4 復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料的抑菌性能分析

2.4.1 復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料對(duì)pH和揮發(fā)性脂肪酸的影響 復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料對(duì)pH和揮發(fā)性脂肪酸的影響見表4。由表4可知，復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料后pH顯著下降(P<0.01)，乳酸、乙酸及總揮發(fā)性脂肪酸含量極顯著增加(P<0.01)，丁酸和戊酸顯著降低(P<0.01)，丙酸無顯著性差異(P>0.05)。

表4 復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料對(duì)pH和揮發(fā)性脂肪酸的影響

2.4.2 復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料后活菌數(shù)量和抑菌性能分析 復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料后活菌數(shù)量和抑菌性能分析見表5。由表5可知，飼料經(jīng)復(fù)合益生菌發(fā)酵后極顯著增加乳酸菌與芽孢桿菌的菌落數(shù)(P<0.01)。采用正丁醇對(duì)發(fā)酵料的抑菌物質(zhì)提取后結(jié)果顯著，發(fā)酵飼料對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌、痢疾桿菌的抑菌圈直徑大小分別比未發(fā)酵飼料增加了60.00%(P<0.01)、31.58%(P<0.01)、42.86%(P<0.01)。

表5 復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料后活菌數(shù)量和抑菌性能分析

3 討 論

3.1 復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的影響

酸溶蛋白是評(píng)價(jià)發(fā)酵飼料品質(zhì)的主要指標(biāo)之一，主要由肽和游離氨基酸等低分子量的蛋白水解物組成，具有溶于酸性溶液(三氯乙酸)的特性，可以一定程度上反映抗原蛋白和其他蛋白質(zhì)抗?fàn)I養(yǎng)因子被水解的程度，同時(shí)也反映小肽含量的高低[9]。王梅等[10]研究表明，益生菌發(fā)酵豆粕組中粗蛋白含量比對(duì)照組提高了6.5%，酸溶蛋白含量是對(duì)照組的3倍。本研究發(fā)現(xiàn),益生菌發(fā)酵后的飼料粗蛋白顯著增加，可能是由于益生菌發(fā)酵過程中微生物的大量增殖，提高了微生物菌體蛋白含量；酸溶蛋白含量的顯著增加可能是發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有機(jī)酸激活與蛋白質(zhì)有關(guān)的消化酶，促進(jìn)大分子蛋白降解成小肽利于動(dòng)物消化吸收[3]。本試驗(yàn)中試驗(yàn)組DM含量低于對(duì)照組，與王洋等[11]研究相似，可能是因?yàn)轱暳显诎l(fā)酵過程中微生物的增殖會(huì)消耗發(fā)酵底物成分，造成DM的損失。研究表明，乳酸菌發(fā)酵飼料對(duì)NDF和ADF無影響[12]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵后NDF、ADF與對(duì)照組均無顯著性影響，可能是與飼料中含有DM有關(guān)，試驗(yàn)組NDF、ADF含量下降可能是發(fā)酵過程中芽孢桿菌產(chǎn)生的纖維素酶可以破壞纖維間的氫鍵，釋放細(xì)胞內(nèi)容物形成單糖[13]。進(jìn)過益生菌發(fā)酵飼料可以提升CP、酸溶蛋白含量，降低不易吸收NDF、ADF含量，提升了飼料品質(zhì)。

3.2 復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料對(duì)抗原蛋白影響

腸道作為機(jī)體最大的營(yíng)養(yǎng)器官，滲透性吸收是腸道固有的形態(tài)，指腸粘膜分子會(huì)把一些小分子物質(zhì)以被動(dòng)擴(kuò)散吸收，大分子物質(zhì)不被吸收的能力[14]。大豆球蛋白和β-大豆球蛋白是豆粕中主要的抗?fàn)I養(yǎng)因子。日糧中大豆抗原蛋白含量高會(huì)破壞幼齡反芻動(dòng)物腸道上皮完整性，抑制上皮細(xì)胞增殖，提高腸道上皮細(xì)胞炎性因子的分泌，引起過敏反應(yīng)，導(dǎo)致腹瀉[15]。陳中平等[16]研究表明，米曲霉發(fā)酵過程中產(chǎn)生的活性蛋白酶可將豆粕大分子蛋白亞基降解為小分子蛋白，有效降解豆粕的抗?fàn)I養(yǎng)因子和致敏化合物。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，益生菌發(fā)酵后，酸性蛋白酶活性顯著提升，使大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白降解，這與酸溶蛋白含量上升結(jié)果一致，說明經(jīng)過益生菌發(fā)酵后的飼料更有利于動(dòng)物腸道的消化吸收。

3.3 復(fù)合益生菌發(fā)酵對(duì)飼料中霉菌毒素的影響

霉菌毒素是一種有毒的次級(jí)代謝產(chǎn)物。黃曲霉毒素是世界公認(rèn)的毒性最強(qiáng)的物質(zhì)，主要與肝損傷有關(guān)，主要抑制DNA合成。嘔吐毒素主體是脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)，其作用機(jī)制主要是抑制蛋白質(zhì)合成以及細(xì)胞膜的通透性，從而破壞機(jī)體免疫機(jī)能。另外，玉米赤霉烯酮是一種類雌激素，它可以與雌激素競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，對(duì)動(dòng)物生殖生理造成損傷。原料以及配合飼料中極易受到霉菌毒素的污染，因此，飼料中有效的解毒措施是必不可少的。目前認(rèn)為一些微生物主要通過降解與吸附作用進(jìn)行有效的解毒。Petchkongkaew等[17]和Cho等[18]研究表明，芽孢桿菌通過代謝后產(chǎn)生的酶水解作用可降解黃曲霉毒素和玉米赤霉烯酮。Chen等[19]研究表明，乳酸菌和芽孢桿菌作為革蘭氏陽性菌，有相同的細(xì)胞壁特征，通過細(xì)胞膜疏水性和細(xì)胞壁碳水化合物組分吸附真菌毒素使毒素含量降低。本研究表明，經(jīng)過復(fù)合益生菌發(fā)酵后三種毒素菌顯著降低，說明枯草芽孢桿菌B-1、地衣芽孢桿菌Y5-39和乳酸桿菌復(fù)合后發(fā)酵飼料可有效降低霉菌毒素含量，與以上研究結(jié)果一致。

3.4 復(fù)合益生菌發(fā)酵對(duì)飼料抑菌性能的影響

pH和有機(jī)酸作為評(píng)價(jià)發(fā)酵品質(zhì)重要指標(biāo)，良好的發(fā)酵飼料pH會(huì)從6.0左右降到4.0以下[20]。本試驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)過益生菌發(fā)酵后飼料pH從6.0降低到3.4，與候楠楠等[21]研究結(jié)果一致。主要是因?yàn)楣虘B(tài)發(fā)酵初期利用芽孢桿菌的好氧發(fā)酵消耗密閉環(huán)境的氧氣為乳酸菌的厭氧發(fā)酵提供條件，乳酸菌可以將飼料中的葡萄糖等碳水化合物轉(zhuǎn)化為乳酸等有機(jī)酸，從而降低飼料的pH。另外，乳酸具有調(diào)節(jié)腸道生態(tài)平衡、抑制病原菌、緩解腹瀉、促進(jìn)鈣質(zhì)吸收以及減緩應(yīng)激的功能[10]，說明益生菌發(fā)酵飼料可能對(duì)促進(jìn)羔羊健康生長(zhǎng)有重要作用。乙酸是良好的酸味劑以及降低環(huán)境惡臭的有益物質(zhì)，丙酸是很好的防腐劑和誘食劑[22]。本研究中，發(fā)酵后期主要是乳酸菌起作用，飼料碳水化合物經(jīng)過同質(zhì)性乳酸與異質(zhì)性乳酸發(fā)酵產(chǎn)生乳酸和乙酸，因此乙酸和乳酸含量較高，這與王梅等[10]研究結(jié)果相似。丁酸是腐敗菌等微生物降解蛋白質(zhì)、葡萄糖和乳酸的產(chǎn)物，丁酸含量增加會(huì)伴隨著pH的升高及蛋白質(zhì)的快速降解[23]，本研究中益生菌發(fā)酵飼料丁酸含量比對(duì)照組降低了64.86%，提高了發(fā)酵飼料的品質(zhì)。

動(dòng)物腸道中主要由致病菌、有益微生物和病原體構(gòu)成動(dòng)態(tài)平衡[24]。腸道菌群微生物與宿主是共生關(guān)系，如果腸道菌群紊亂會(huì)造成動(dòng)物腹瀉。腸道主要致病菌有大腸桿菌和沙門氏菌，病原菌最適生長(zhǎng)pH為6.0～7.0，發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生抗菌代謝產(chǎn)物、乳酸等有機(jī)酸，飼料乳酸菌菌落數(shù)提高又可進(jìn)一步證明乳酸的產(chǎn)生，降低飼料pH，處于酸性環(huán)境，抑制有害菌的增長(zhǎng)[25]。本研究結(jié)果表明，益生菌發(fā)酵后芽孢桿菌菌落數(shù)明顯提高，經(jīng)過正丁醇提取發(fā)酵后的代謝產(chǎn)物抑菌直徑顯著提高，酸性環(huán)境可加速乳酸菌代謝，產(chǎn)生的過氧化氫、乙醛、有機(jī)酸等物質(zhì)，及芽孢桿菌代謝中產(chǎn)生桿菌素等物質(zhì)，均對(duì)革蘭氏陰性菌有抑制作用，同時(shí)產(chǎn)生的大量有益菌與有害菌形成競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，主要是對(duì)飼料營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和空間位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)，芽孢桿菌占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)后，有害菌不滿足增殖條件從而達(dá)到抑菌作用。因此，益生菌發(fā)酵飼料的抑菌功能提高。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)條件下，玉米-豆粕型飼料經(jīng)過復(fù)合益生菌發(fā)酵后品質(zhì)顯著提高，顯著降低飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子與霉菌毒素且抑菌效果較好，有望用于動(dòng)物飼養(yǎng)的一種新型功能性飼料。