半楓荷根對佐劑誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎的改善作用及其正丁醇提取物UPLC-Q-TOF-MS分析

尹 麗，韋小敏，盧成淑，盧海嘯，王華坤,

（1.玉林師范學(xué)院，廣西玉林 537000；2.玉林師范學(xué)院地產(chǎn)藥用資源開發(fā)與生物工程技術(shù)中心，廣西玉林 537000）

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種系統(tǒng)的全身性慢性疾病，可引起骨功能喪失和殘疾，主要病理特征為關(guān)節(jié)炎滑膜系統(tǒng)性炎癥引起的關(guān)節(jié)軟骨和骨侵蝕[1-3]，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。目前RA發(fā)病機(jī)制尚不明確，臨床上還缺乏針對該病的有效治療手段，西醫(yī)常選用激素類、非甾體類抗炎藥及免疫抑制類藥物控制炎癥緩解疾病，缺點(diǎn)是用藥時間長、無法根治且副作用大，如肝腎受損等[4]。因此，選擇一種合適的造模方法篩選生物活性物質(zhì)應(yīng)用到保健營養(yǎng)食品、醫(yī)藥及生物化學(xué)領(lǐng)域科學(xué)研究中，開發(fā)能夠預(yù)防和改善RA的藥物及功能性食品對減輕患者痛苦并提高生活質(zhì)量具有廣闊的應(yīng)用前景[5]。

半楓荷（Semiliquidambar cathayensis）為金縷梅科半楓荷屬植物，全株及花蜜均可入藥，是海南、兩廣、貴州等當(dāng)?shù)厣贁?shù)民族群眾常用的治風(fēng)濕跌打珍貴藥材[6]，因治療風(fēng)濕有奇效，在中醫(yī)界有“風(fēng)濕之王”的美譽(yù)。半楓荷始載于《嶺南采藥錄》，民間多用其治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、跌打損傷和軟組織損傷、慢性腰腿痛等疾病[7]。日常泡茶、泡酒、煲湯食用，目前已被開發(fā)成半楓荷酒、半楓荷蜂蜜等多種保健型食品用于祛風(fēng)除濕及舒經(jīng)活血[8]。目前對半楓荷的研究剛剛起步，主要集中在同名同效不同種植物的考證[9]、辨別半楓荷特征的生藥學(xué)研究[10]、半楓荷不同部位化學(xué)成分研究[11-13]、半楓荷祛風(fēng)除濕和舒筋活血功效研究[14-15]等方面?，F(xiàn)有文獻(xiàn)初步探究了半楓荷的活血止痛功能，如半楓荷水提取物對大鼠血瘀模型有活血化瘀作用[7,8,16]；熱板法、毛細(xì)血管通透法及大鼠足趾腫脹法等研究發(fā)現(xiàn)半荷根醇提物有明顯的鎮(zhèn)痛抗炎作用，半楓荷乙酸乙酯部位為活性提取物[14-15]，但活性成分和治療機(jī)制不明。課題組前期通過圖譜指認(rèn)以及文獻(xiàn)調(diào)研，明確半楓荷抗炎鎮(zhèn)痛活性物質(zhì)含量較高的部位為半楓荷根[14-15,17]。本研究利用與人RA發(fā)生機(jī)制相似的佐劑誘導(dǎo)型（adjuvant arthritis，AA）大鼠關(guān)節(jié)炎模型[18]，給予半楓荷根乙醇提取物（ethanol extract ofSemiliquidambar cathayensisroot，SCE）干預(yù)，與甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）組及模型組比較，探討半楓荷根對RA大鼠關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)作用、炎癥相關(guān)因子及血清細(xì)胞因子分泌的影響，并借助超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿-飛行時間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF-MS）技術(shù)分析得到半楓荷根正丁醇提取物的化學(xué)成分，以期篩選出更多可以預(yù)防和改善RA的有效物質(zhì)，為開發(fā)相應(yīng)的藥品、膳食補(bǔ)充劑或功能性食品提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF級健康SD雄性大鼠 50只，8～10周齡，體重200～220 g，廣西醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心（許可證號：SCXK桂2020-0003），動物飼養(yǎng)在層流SPF級無菌環(huán)境下單個分籠飼養(yǎng)，濕度40%±10%，溫度（23±1）℃，采用12 h光照循環(huán)，每日光照時間為早上8:00至晚上20:00，期間大鼠均能自由飲食、飲水，實(shí)驗(yàn)遵循3R原則，所有動物實(shí)驗(yàn)均符合廣西醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會標(biāo)準(zhǔn)（201908006）；半楓荷根藥材 由玉林師范學(xué)院盧海嘯教授采集并鑒定為金縷梅科半楓荷屬植物半楓荷的干燥根；甲氨蝶呤對照品 上海源葉生物技術(shù)有限公司（CAS號59-05-2）；弗氏完全佐劑（CAS 號 9007-81-2）、蘇木色精（CAS 號 517-28-2、伊紅（CAS 號 15086-94-9） Sigma公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒（貨號 ml002859）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）試劑盒（貨號 ml037361）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）試劑盒（貨號 ml064292）、白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10）試劑盒（貨號 ml00 2813）、環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）試劑盒（貨號 ml058808）、5-脂氧合酶（5-lipoxygenase，5-LOX）試劑盒（貨號ml058145）試劑盒 上海酶聯(lián)生物科技有限公司；切片石蠟（39601006） 德國Leica公司。

PV-200型足趾容積測量儀 成都泰盟軟件有限公司；1510型全波長酶標(biāo)儀美國Thermo Fisher公司；EG1150H型石蠟包埋機(jī)、HI1210型攤片機(jī)、RM2255型輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)、HI1220型烘片機(jī) 德國Leica公司；BX43型顯微鏡 日本奧林巴斯公司；Allegra 64R型高速冷凍離心機(jī) 美國 Beckman Coulter公司；Laborota4000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國Heidolph公司；Nexera UHPLC LC-30A型超高效液相色譜儀 日本島津儀器有限公司；TripleTOF 5600+型飛行時間質(zhì)譜儀 美國AB SCIEX公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組及建模 參照本課題組前期實(shí)驗(yàn)方法[17]，制備半楓荷根乙醇提取物：半楓荷根干燥粉碎后，取粗粉7 kg用10倍量75%乙醇回流提3次，每次2 h。合并提取液減壓濃縮至無醇味得干燥總提物，出膏率為8.2%。大鼠飼養(yǎng)一周后，把50只雄性大鼠隨機(jī)分為 5 組，每組 10 只：對照組（control）、模型組（model）、陽性藥物組（甲氨蝶呤，MTX，3 mg/kg）、半楓荷根乙醇提取物低劑量組（SCEL，生藥量0.125 g/kg，0.5倍中藥大辭典推薦使用量）、半楓荷根乙醇提取物高劑量組（SCEH，生藥量0.5 g/kg，2倍中藥大辭典推薦使用量）。根據(jù)半楓荷根乙醇提取物得率8.2%配制成0.4和1.6 g/kg兩個濃度的溶液進(jìn)行初步藥效學(xué)試驗(yàn)。大鼠足趾常規(guī)消毒，對照組大鼠左后足趾內(nèi)注射等量生理鹽水，其余大鼠左后足趾皮下注射弗氏完全佐劑0.1 mL致炎，次日開始按各組劑量灌胃給藥。參照文獻(xiàn)[19]方法，MTX組每周灌胃2次，每次間隔3.5 d，半楓荷根醇提取物高、低劑量組每天固定時段灌胃一次，對照組及模型組灌胃等體積生理鹽水每日一次，持續(xù)給藥28 d。造模結(jié)束后，剔除造模不成功大鼠，其他納入實(shí)驗(yàn)大鼠：對照組10只（無死亡）、模型組10只（無死亡）、MTX組9只（造模不成功1只）、SCEL組和SCEH組各9只（造模過程中各死亡1只）。

1.2.2 足腫脹容積的測定 造模前及致炎后，用足趾腫脹測量儀測定大鼠致炎前左后足初始容積，每組動物的足跖體積每3 d測量1次，每鼠測3次取平均值，得出各治療組關(guān)節(jié)足跖體積折線圖。

1.2.3 關(guān)節(jié)炎指數(shù)測定 大鼠免疫后每3 d進(jìn)行關(guān)節(jié)炎評分，得出各治療組關(guān)節(jié)級別分?jǐn)?shù)的折線圖。通用關(guān)節(jié)炎評分標(biāo)準(zhǔn)為根據(jù)免疫后足趾部位紅斑程度、范圍及關(guān)節(jié)腫大變形情況，累計(jì)得出關(guān)節(jié)炎指數(shù)（arthritis index，AI）[20]。0 分：正常、無腫脹；1 分：關(guān)節(jié)輕微紅腫；2分：后足踝關(guān)節(jié)及跗骨出現(xiàn)紅斑和腫脹；3分：踝關(guān)節(jié)至跖骨處或掌關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅斑和中度腫脹；4分：踝關(guān)節(jié)至跖骨處嚴(yán)重腫脹、紅斑或僵硬，不能負(fù)重。大鼠所有關(guān)節(jié)炎指數(shù)之和即為每只大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)。

1.2.4 免疫器官指數(shù)測定 28 d實(shí)驗(yàn)結(jié)束前進(jìn)行稱重，水合氯醛腹腔麻醉后斷頭處死大鼠，取出脾臟和胸腺并稱重，計(jì)算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，胸腺指數(shù)/脾臟指數(shù)=胸腺（脾臟）/體重。

1.2.5 炎癥因子和細(xì)胞因子測定 實(shí)驗(yàn)28 d腹主動脈取血，用histopaque 1083單核細(xì)胞離液獲取外周血單核細(xì)胞（peripheral blood monocytes，PBMC），ELISA試劑盒測定COX-2和5-LOX含量。大鼠腹主動脈取血，收集全血，靜置2 h后離心分離血清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩LISA試劑盒說檢測各組血清中 TNF-α、IL-1β、IL-6和 IL-10含量。

1.2.6 大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理切片觀察 實(shí)驗(yàn)28 d處死大鼠后，迅速剪去左足踝關(guān)節(jié)固定于4%多聚甲醛溶液。10% EDTA溶液脫鈣，石蠟包埋、切片，蘇木素-伊紅（HE）染色，顯微鏡觀察各組的關(guān)節(jié)處病理變化并拍照分析。

1.2.7 半楓荷根活性提取物篩選 半楓荷根乙醇提取物500 g經(jīng)水研磨混懸后，參照課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果[16]選用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇按照1:1的體積比依次對濃縮液進(jìn)行萃取，得到石油醚提取物浸膏20.6 g（得率4.12%）、二氯甲烷提取物浸膏32.6 g（得率6.52%）、乙酸乙酯提取物浸膏35.5 g（得率7.1%）、正丁醇提取物浸膏51.95 g（得率10.39%）。參照文獻(xiàn)[19]方法，考慮各部位在乙醇提取物中含量結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)實(shí)際結(jié)果設(shè)計(jì)給藥濃度，按1.2.1造模方法，取110只雄性SD大鼠隨機(jī)分為11組：對照組、模型組、甲氨蝶呤組（MTX，3 mg/kg）、石油醚提取物高劑量組（PE-H，25 mg/kg）、石油醚提取物低劑量組（PE-L，12.5 mg/kg）、二氯甲烷提取物高劑量組（CH2Cl2-H，80 mg/kg）、二氯甲烷提取物低劑量組（CH2Cl2-L，40 mg/kg）、乙酸乙酯提取物高劑量組（EtOAc-H，25 mg/kg）、乙酸乙酯提取物低劑量組（EtOAc-L，12.5 mg/kg）、正丁醇提取物高劑量組（BuOH-H，80 mg/kg）、正丁醇提取物低劑量組（BuOH-L，40 mg/kg），對大鼠進(jìn)行足腫脹容積測量及關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分評判治療效果。

1.2.8 半楓荷根活性提取物的液質(zhì)聯(lián)用定性分析對半楓荷根活性提取物進(jìn)行超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿-飛行時間質(zhì)譜法（UPLC-Q-TOF-MS）分析，結(jié)合 MassBank，Respect，GNPS（共 14951 個 records）等在線網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻(xiàn)對有效洗脫部位進(jìn)行成分鑒定，并對其中的抗RA活性成分進(jìn)行二級質(zhì)譜確認(rèn)。液質(zhì)聯(lián)用色譜條件：SHIMADZU InerSustain C18（2.1 mm×100 mm，2 μm），流動相為 A：乙腈，B：0.1%甲酸-水，進(jìn)樣量10 μL，柱溫35 ℃，波長254 nm。梯度洗脫程序：0～3 min，95% B；3～15 min，95%～80% B；15～40 min，80%～0 B； 40～45 min，0 B； 45～46 min，0～95% B；46～48 min，95% B。

分別采用電噴霧電離（ESI）正離子和負(fù)離子模式進(jìn)行檢測，質(zhì)譜參數(shù)為霧化氣（GS1）：50 psi，輔助加熱氣（GS2）：50 psi，氣簾氣（CUR）：25 psi，溫度（TEM）：500 ℃（正離子）和 450 ℃（負(fù)離子），毛細(xì)管電壓（IS）：±5500 V（正離子）和±4400 V（負(fù)離子）；TOF MS掃描范圍 m/z：100～1200，產(chǎn)物離子掃描范圍m/z：50～1000，TOF MS 掃描累積時間：0.20 s/spectra，產(chǎn)物離子掃描累積時間：0.01 s/spectra；二級質(zhì)譜采用信息依賴型獲取模式（IDA）獲得，并且采用超高靈敏度模式，去簇電壓（DP）：±60 V（正負(fù)兩種模式），CES碰撞能力疊加為：35±15 eV。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 SCE對大鼠關(guān)節(jié)外觀的影響及AI評分

對照組、模型組照片可以直觀地反映各組的關(guān)節(jié)狀態(tài)（圖1）。AA免疫大鼠左后足24 h后模型組跖骨和足骨出現(xiàn)多處紅斑，腫脹明顯，關(guān)節(jié)發(fā)生僵直，大鼠行走受限，符合RA的體外特征。根據(jù)AI判定標(biāo)準(zhǔn)：大鼠每只爪單獨(dú)評分最高4分，總分是四只爪關(guān)節(jié)炎癥之和，最高16分。實(shí)驗(yàn)組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)AI＞4分，認(rèn)定為關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)成功，AI＜4分判定無關(guān)節(jié)炎癥。關(guān)節(jié)炎指數(shù)結(jié)果（圖2）顯示，佐劑免疫15 d左右炎癥癥狀達(dá)到一個高峰期，隨著時間的變化，炎癥癥狀稍微有所減輕。前10 d，SCE組（AI為5.23±1.21）及 MTX 組（AI為 5.62±1.09）與模型組（AI為5.89±1.67）相比關(guān)節(jié)炎指數(shù)沒有顯著差異，從12 d后SCE組大鼠（AI為4.23±1.82）與模型組大鼠（AI為7.64±1.17）相比顯著降低關(guān)節(jié)炎指數(shù)（P＜0.05）。即給藥12 d后，SCE開始發(fā)揮抗炎作用，MTX組和SCE組特別是高劑量組的大鼠足跖腫脹程度明顯降低。高劑量治療組（AI為3.82±1.52）治療效果在即將結(jié)束的第21～28 d具有顯著性差異（P＜0.05）。

圖1 大鼠AA免疫前后關(guān)節(jié)變化Fig.1 Normal and AA-immunized rats joint changes

圖2 關(guān)節(jié)計(jì)分圖Fig.2 Joint scores

2.2 SCE對AA 大鼠足趾腫脹度的影響

在足跖腫脹程度的折線圖中（圖3），由Graphpad Prism 5.0計(jì)算結(jié)果可知，5組關(guān)節(jié)腫脹體積與X軸的曲線下面積（AUC）分別是對照組為33.75，模型組為 64.20，MTX組為 45.00，SCEL組為 52.83，SCEH組為49.77。經(jīng)過28 d給藥觀察，可以看出SCE能夠顯著（P＜0.05）降低發(fā)炎關(guān)節(jié)的腫脹程度，特別是高劑量組擁有與陽性藥相媲美的治療效果，其對關(guān)節(jié)腫脹具有明顯的緩解作用。足趾腫脹和關(guān)節(jié)炎指數(shù)是直觀評價抗RA作用的兩個指標(biāo)，Wang等[21]的研究顯示AA引起的關(guān)節(jié)炎會導(dǎo)致大鼠爪子腫脹減輕、降低關(guān)節(jié)炎評分，本研究結(jié)果與文獻(xiàn)結(jié)果類似。

圖3 足趾腫脹度折線圖Fig.3 Line graph of paw volume

2.3 SCE對 AA 大鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響

胸腺和脾臟是兩個重要的機(jī)體免疫器官，通過多種機(jī)制發(fā)揮免疫功能，其重量與體重的比例能夠反映出機(jī)體的整體免疫功能狀態(tài)[22]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表1）顯示，模型組的胸腺（2.73±0.11）和脾臟指數(shù)（2.04±0.17）與對照組（胸腺 2.07±0.06、脾臟 1.19±0.11）相比顯著增高（P＜0.05），可能與AA大鼠免疫功能紊亂和炎癥反應(yīng)有關(guān)[23]。SCE能降低AA大鼠胸腺指數(shù)（2.25±0.06），對脾臟指數(shù)也有降低趨勢（1.55±0.18），但無顯著性差異（P＞0.05），表明了SCE對AA大鼠具有一定的免疫抑制作用。

表1 SCE對AA大鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)的影響 ±S，mg/g）Table 1 Effects of SCE on the thymus index and spleen index in AA rats (±S, mg/g)

表1 SCE對AA大鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)的影響 ±S，mg/g）Table 1 Effects of SCE on the thymus index and spleen index in AA rats (±S, mg/g)

注：與對照組相比，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 動物數(shù)（只） 胸腺指數(shù) 脾臟指數(shù)對照組 10 2.07±0.06 1.19±0.11模型組 10 2.73±0.11# 2.04±0.17#甲氨蝶呤組 10 2.19±0.11* 1.37±0.12*提取物（低） 10 2.48±0.12 1.78±0.11提取物（高） 10 2.25±0.06* 1.55±0.18

2.4 SCE對AA大鼠PMBC中COX-2和 5-LOX表達(dá)影響及血清中細(xì)胞因子影響

COX-2和5-LOX 是花生四烯酸代謝途徑中的兩個關(guān)鍵酶，參與組織炎癥，在關(guān)節(jié)組織中COX-2過表達(dá)是關(guān)節(jié)炎疾病的共同特征[24]，而阻斷5-LOX可減輕小鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型中關(guān)節(jié)的功能性損傷。COX-2和5-LOX在正常情況下低表達(dá)，而當(dāng)發(fā)生炎癥時高表達(dá)[25]。如圖4所示，對照組PBMC中 5-LOX（0.50±0.04）和 COX-2 水平（0.49±0.10）顯著低于 AA 模型組（5-LOX 0.92±0.06，COX-2 0.91±0.07），表明對照組的炎癥水平低于AA模型組（P＜0.05）。給予 SCEH處理后，5-LOX（0.58±0.03）和COX-2（0.61±0.02）水平都顯著低于模型組（P＜0.01）。

圖4 SCE對AA大鼠 PMBC中COX-2和5-LOX含量的影響Fig.4 Effects of SCE on COX-2 and 5-LOX level in rats PBMC

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)RA是由自身免疫細(xì)胞和免疫因子造成的免疫損害，主要特征是自身免疫功能紊亂。在RA患者及動物模型血清中，TNF-α、IL-1β和IL-6水平高于正常組，在病灶部位呈現(xiàn)高表達(dá)[26]，TNF-α等是RA病理過程中的重要檢測指標(biāo)[27]。IL-10又稱細(xì)胞因子合成抑制因子[28]，與TNF-α等作用相反，RA患者血清和滑液中IL-10水平高于正常人，IL-10外源性補(bǔ)充能降低炎癥反應(yīng)強(qiáng)度，在關(guān)節(jié)修復(fù)和軟骨保護(hù)中起著至關(guān)重要的角色[29]。給藥28 d后，用ELISA試劑盒測定各組大鼠血清中細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的含量，各組細(xì)胞因子OD值如圖5所示，可知對照組中促炎細(xì)胞因子TNF-α（42.14±0.03）、IL-6（38.29±0.11）和IL-1β（68.16±0.02）的含量低于 AA模型組（P＜0.01），對照組中 IL-10（99.32±0.07）的含量高于模型組（P＜0.01），說明模型組動物處于很嚴(yán)重的炎癥狀態(tài)。給予SCE和MTX處理后，SCEH組和MTX組可顯著降低AA大鼠中TNF-α（SCEH 組 56.23±0.02，MTX 組 50.55±0.08）、IL-6（SCEH 組 51.22±0.08，MTX 組 49.24±0.02）和IL-1β（SCEH 組 96.49±0.06，MTX 組 90.21±0.09）的含量（P＜0.05），同時顯著升高AA大鼠血清中IL-10（SCEH 組 123.51±0.04，MTX 組 130.11±0.12）含量（P＜0.001）。

上述結(jié)果顯示SCE特別是高劑量組能夠顯著降低 RA大鼠體內(nèi) COX-2和 5-LOX水平及 TNF-α、IL-6和IL-1β含量，SCE表現(xiàn)出較好的體內(nèi)抗炎活性，存在抑制RA疾病進(jìn)展的內(nèi)在潛力。半楓荷根對AA大鼠免疫抑制作用具體表現(xiàn)在對細(xì)胞因子表達(dá)的影響，其作用機(jī)制不明確。推測其被大鼠體內(nèi)吸收后藥效成分與相關(guān)靶點(diǎn)結(jié)合，調(diào)控相應(yīng)免疫通路從而使機(jī)體異常的免疫應(yīng)答趨于平衡，出現(xiàn)下調(diào)或上調(diào)相關(guān)細(xì)胞因子的現(xiàn)象[30]。

2.5 建模關(guān)節(jié)照片及HE染色結(jié)果

滑膜增生，血管翳形成，關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì)破壞是RA的主要病理特征，本實(shí)驗(yàn)著重考察半楓荷根是否能夠抑制RA的關(guān)節(jié)侵蝕與破壞。踝關(guān)節(jié)的染色切片結(jié)果如圖6所示，模型組有大量炎癥細(xì)胞浸潤到關(guān)節(jié)腔且關(guān)節(jié)處，滑膜及軟骨都有很大程度的破壞，而SCE組特別是高劑量組滑膜較正常，僅有少量炎性細(xì)胞浸潤，關(guān)節(jié)腔間隙較小，展現(xiàn)出幾乎完整的關(guān)節(jié)滑膜?？梢?，SCE（尤其在1.6 g /kg的劑量下）具有一定的抑制關(guān)節(jié)處炎性細(xì)胞侵蝕及破壞作用，其原理可能是通過降低細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的含量來減輕關(guān)節(jié)處炎癥繼而降低炎癥對關(guān)節(jié)的侵蝕和損壞。

圖6 AA大鼠踝關(guān)節(jié)HE染色觀察（100×）Fig.6 The HE staining in ankle of AA rats （100×）

2.6 半楓荷根活性提取物的篩選

給藥10 d后，乙酸乙酯、二氯甲烷和正丁醇提取物抑制AA大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)（圖7），石油醚提取物對AA大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)無顯著性影響。在足跖腫脹程度的折線圖中（圖8），關(guān)節(jié)腫脹體積與X軸的曲線下面積（AUC）分別是對照組為 34.62，模型組為64.56，MTX 組為45.92，EtOAc-H 組為59.39，EtOAc-L組為 60.08，CH2Cl2-H組為 58.40，CH2Cl2-L組為60.11，BuOH-H 組為 52.74，BuOH-L 組為 54.29，其中半楓荷根正丁醇提取物高劑量組對RA大鼠關(guān)節(jié)炎腫脹和關(guān)節(jié)炎指數(shù)抑制作用效果最為顯著（P＜0.05），為半楓荷根活性提取物。

2.7 半楓荷根正丁醇提取物總離子流圖及化合物鑒定

采用UHPLC-Q-TOF-MS檢測半楓荷根正丁醇提取物，化合物在正、負(fù)離子模式下得到較好分離（圖9），整個實(shí)驗(yàn)過程中儀器誤差引起的變異較小。基于文獻(xiàn)檢索以及相關(guān)數(shù)據(jù)庫，參照色譜保留時間、精確分子量、準(zhǔn)分子離子和相關(guān)文獻(xiàn)，對半楓荷根正丁醇提取物的主要色譜峰化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了推斷和鑒定，最終確定104個化合物（表2），還需進(jìn)一步確證。半楓荷根正丁醇提取物化學(xué)組成包括有機(jī)酸類26種，糖和糖苷類化合物12種，醛酮類化合物7種，醇和酚類化合物7種，氨基酸類化合物2種，醌類及香豆素化合物5種，其他類成分26種。盧海嘯等[17]用硅膠和Sephadex LH-20柱色譜分離鑒定半楓荷根化學(xué)成分，得到11個化合物多為有機(jī)酸類。本研究結(jié)果與其基本一致，但由于半楓荷采集時間、提取部位、提取溶劑有所差異，具體化學(xué)成分之間存在一定差異。本課題組初步實(shí)驗(yàn)證明半楓荷根正丁醇提取物的黃酮類化合物如蘆薈大黃素、表沒食子兒茶素、紫杉醇及環(huán)烯醚萜類化合物梔子苷能夠不同程度地抑制 LPS誘導(dǎo)的 RAW264.7細(xì)胞釋放 NO、TNF-α、IL-1β，表現(xiàn)出抗炎作用。半楓荷根正丁醇提取物中含量較高且抗炎作用顯著的物質(zhì)為白藜蘆醇（圖10），田曉明等[13]通過UPLC/Q-TOF-MS技術(shù)分析出白藜蘆醇、瓜氨酸、膽酸、7-羰基豆甾醇四種化學(xué)成分在半楓荷根皮中含量較高，本研究結(jié)果與其一致。文獻(xiàn)報道白藜蘆醇在RA治療中發(fā)揮重要作用，通過誘導(dǎo)促凋亡基因caspase-3表達(dá)，顯著抑制RA滑膜細(xì)胞增殖、促使其凋亡[21]。本實(shí)驗(yàn)采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對半楓荷根正丁醇提取物的化學(xué)成分進(jìn)行分析，比對質(zhì)譜數(shù)據(jù)并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，鑒定出單體化合物結(jié)構(gòu)，為半楓荷根抗RA的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供依據(jù)。

圖10 白藜蘆醇的二級質(zhì)譜圖Fig.10 MS/MS spectrum of resveratrol

表2 半楓荷根正丁醇提取物化合物鑒定結(jié)果（部分）Table 2 Identified information of the compounds in n-butanol part of SCE (partial results)

圖9 正、負(fù)離子模式血漿樣本總離子流圖Fig.9 LC-MS total ion chromatography (TIC) of plasma metabolites in ES+ mode (A) and ES- mode (B)

續(xù)表 2

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)選用廣西地產(chǎn)半楓荷根炮制得到醇提物作用于AA模型大鼠，發(fā)現(xiàn)其能顯著降低大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)、足跖腫脹度和胸腺指數(shù)，降低大鼠體內(nèi)COX-2、5-LOX 及 TNF-α、IL-6、IL-1β水平，抑制大鼠踝關(guān)節(jié)處炎性細(xì)胞侵蝕及破壞，表現(xiàn)出較好的抗炎活性。半楓荷根正丁醇部位為抗炎活性提取物，高分辨質(zhì)譜法和高效液相色譜法結(jié)合對正丁醇提取物的潛在活性成分進(jìn)行定性分析，得到有機(jī)酸類、糖和糖苷類、醛酮類等多種活性化合物，具備較高的營養(yǎng)價值和潛在的藥用特性，其中白藜蘆醇等化合物含量較高，與已有研究結(jié)果一致，為有效成分及藥效機(jī)制研究提供基礎(chǔ)。本研究首次對半楓荷抗RA的主要活性成分和藥理活性進(jìn)行闡述，不足之處是對藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和機(jī)制研究缺乏深入探討。下一步擬通過HPLC法深入定量分析各化學(xué)成分含量，采用細(xì)胞炎癥模型明確各化合物抗炎活性，結(jié)合主成分分析法篩選主要成分，從細(xì)胞水平探究半楓荷根主成分抗RA的具體作用機(jī)制，為開發(fā)半楓荷成抗RA新藥和功能性食品提供數(shù)據(jù)支撐和研究策略。