基于流式細胞術研究葉綠素對腸道細菌增殖的影響

鄭紅莉，王 瀟，杜夢璇，劉 暢, ，張 燕,

（1.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，國家果蔬加工工程技術研究中心，北京 100083；2.中國科學院微生物研究所，微生物資源前期開發(fā)國家重點實驗室，北京 100101）

葉綠素是綠色果蔬中主要的呈色物質(zhì)，也是自然界含量最為豐富的植物次生代謝物，具有抗氧化[1]、抗炎[2]、抗腫瘤[3]等多種功能。膳食攝入葉綠素經(jīng)胃腸消化后，約有95%的葉綠素會進入結腸，與腸道菌群相互作用[4]。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，葉綠素可通過介導腸道菌群有效改善高脂飲食誘導的小鼠肥胖，顯著上調(diào)小鼠腸道中擬桿菌屬（Bacteroides）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）和阿克曼氏菌屬（Akkermansia）的相對豐度，同時顯著下調(diào)乳球菌屬（Lactococcus）和乳桿菌屬（Lactobacillus）的相對豐度[5-6]。闡明葉綠素介導腸道菌群改善高脂飲食誘導肥胖的機制，需要深入探討葉綠素對特定菌株的影響，但國內(nèi)外對相關領域的研究還非常有限。與此同時，Liu等[7]從小鼠腸道中分離得到244株腸道細菌，為研究葉綠素對特定腸道菌的影響規(guī)律提供了可使用的菌株?；谇捌谘芯拷Y果，本研究從上述菌株庫中篩選獲得與肥胖顯著相關的菌株進行了體外培養(yǎng)研究。

大多數(shù)腸道細菌嚴格厭氧，對培養(yǎng)條件要求高、生長周期長。在采用稀釋涂布平板法進行腸道菌活菌計數(shù)時發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過7～15 d的培養(yǎng)后，許多腸道菌仍只能長出大小不一且分散不均的微小菌落。在體外培養(yǎng)中如何實現(xiàn)腸道細菌數(shù)量的有效檢測是一大難點。因此，要在菌種水平上探究葉綠素對特定腸道細菌的增殖影響，闡明膳食葉綠素影響健康的機制，需要找到一種便捷、有效、可檢測體外培養(yǎng)中腸道細菌數(shù)量的方法。

流式細胞術（Flow cytometry, FCM）是一種可實現(xiàn)細胞或細菌快速檢測的簡便技術，耗時短且重復性高[8]。目前，已有許多研究將其應用于幽門螺旋桿菌等致病菌[9-10]的檢測。在食品領域，F(xiàn)CM已實現(xiàn)對酸奶中乳酸菌[11]、葡萄酒中釀酒酵母[12]和食醋中醋酸菌[13]等工業(yè)菌的快速檢測。目前，還未有研究利用FCM檢測難以培養(yǎng)的腸道細菌。

本研究比較了體外培養(yǎng)中珀氏解黃酮菌（Flavonifractor plautii）的FCM計數(shù)與稀釋涂布平板法計數(shù)，并基于FCM研究了葉綠素對來源于小鼠腸道的珀氏解黃酮菌、普通擬桿菌（Bacteroides vulgatus）、假長雙岐桿菌（Bifidobacterium pseudolongum）和鼠乳桿菌（Lactobacillus murinus）增殖的影響，為闡明膳食-腸道菌群-宿主互作機制提供了有效的研究方法和理論數(shù)據(jù) 。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗菌株 均分離于ob/ob小鼠盲腸內(nèi)容物[7]，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心（China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC），如表1所示。葉綠素（含量為 92.11%，其中葉綠素a為70.99%，葉綠素b為21.12%[14]）自制；95%乙醇 分析純，國藥集團化學試劑有限公司；改良GAM肉湯 青島海博生物技術有限公司；澄清瘤胃液 北方遠洋生物科技有限公司；瓊脂粉北京奧博星生物科技有限責任公司； LIVE/DEAD?BacLightTM試劑盒 美國Thermo Fisher Scientific公司。

表1 實驗菌株名稱Table 1 Names of the test strains

SpectraMax iD5型酶標儀 美國Molecular Devices公司；Q23XD-2型二位三通先導電磁閥 浙江奉化市中源氣動成套廠；Coylabotatory型厭氧手套箱 美國COY公司； FACSCantoⅡ型流式細胞儀美國Becton-Dickinson醫(yī)療器械有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 GAM培養(yǎng)基參照Liu等[7]的方法進行配制。液體培養(yǎng)基配制：改良GAM肉湯60 g、L-半胱氨酸0.5 g、精氨酸0.5 g、色氨酸0.3 g、氯高鐵血紅素5 mL、澄清瘤胃液100 mL、刃天青1 mL，蒸餾水定容至 1000 mL，調(diào) pH 為 7.2±0.1（25 ℃），分裝至10 mL厭氧管，115 ℃滅菌25 min；固體培養(yǎng)基配制：改良GAM肉湯60 g、半胱氨酸0.5 g、精氨酸0.5 g、色氨酸0.3 g、氯高鐵血紅素5 mL、澄清瘤胃液100 mL、菊粉益生元0.5 g、纖維二糖0.5 g、海藻糖0.5 g、甘露糖0.5 g、半乳糖0.5 g、果糖0.5 g、鼠李糖0.5 g、異麥芽酮糖0.5 g、碳酸氫鈉2 g、無水乙酸鈉2.46 g、刃天青1 mL、瓊脂10 g，最后用蒸餾水定容至 1000 mL。調(diào) pH 為 7.2±0.1（25 ℃），115 ℃滅菌25 min。

1.2.2Flavonifractor plautii的培養(yǎng) 將葉綠素加入新鮮的GAM液體培養(yǎng)基中，使其葉綠素濃度分別為 100、300、500 μg/mL； 而 后 將Flavonifractor plautii以2%的接種量接入含有葉綠素的培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至穩(wěn)定期（24 h）。以不加葉綠素為對照組，葉綠素添加量為100、300、500 μg/mL的組依次定義為低濃度組、中濃度組和高濃度組。

1.2.3Flavonifractor plautii的流式細胞術（FCM）計數(shù)

1.2.3.1 樣品制備 取1 mLFlavonifractor plautii菌液，10000 g離心2 min以收集菌體細胞，將沉淀重懸于1 mL 0.85% NaCl溶液中，室溫孵育30 min，10000 g離心2 min，用0.85% NaCl溶液洗滌沉淀以除去干擾成分[15]，再次10000 g離心2 min，最后將菌體沉淀重懸于1 mL 0.85% NaCl溶液中，制得活菌懸浮液，備用；另取1 mL菌液，10000 g離心2 min以收集菌體細胞，將沉淀重懸于1 mL 70%異丙醇[16]，余下步驟與活菌懸浮液制備相同，制得死菌懸浮液，備用。樣品染色液：在分析管中依次加入0.85% NaCl溶液977 μL、3.34 mmol/L SYTO 9 1.5 μL、30 mmol/L PI 1.5 μL、細菌懸浮液 10 μL 和微球懸浮液10 μL，充分混合，室溫下避光孵育15 min[17]。調(diào)試儀器所需單色對照管：分別準備2份活菌懸浮液和2份死菌懸浮液，與樣品染色液制備步驟一致，2份活/死菌懸浮液中，一份僅加入SYTO 9，另一份僅加入PI。分析管中樣品的總體積應為1000 μL，以便準確計數(shù)。

1.2.3.2 儀器調(diào)整與參數(shù)設置 前向角、側(cè)向角和熒光信號采集對數(shù)放大信號。不斷調(diào)整電壓參數(shù)和熒光補償，使細菌群體和標準微球均位于橫、縱坐標軸的中間區(qū)域，同時使活菌和死菌所在區(qū)域能夠很好區(qū)分開[18]。參數(shù)設置：進樣量 10 μL；進樣速度 1.0 μL/s；events采集總數(shù)量30000個；電壓值：前向角FSC 170V、側(cè)向角SSC 340 V、綠色熒光280 V、紅色熒光280 V。

1.2.3.3 細菌總數(shù)計算 微球標準品稀釋100倍后，密度為1.0×106個/mL，即1個計數(shù)微球表示10-6mL。根據(jù)細菌區(qū)域的信號數(shù)（events in bacteria region）和微球區(qū)域的信號數(shù)（events in bead region），可得出每10-6mL的細菌總數(shù)[19]。計算公式如下：

式中：C表示細菌總數(shù)，個/mL；B表示細菌區(qū)域的信號數(shù)；D表示溶液稀釋倍數(shù)100；M表示微球區(qū)域的信號數(shù)；V表示計數(shù)微球體積10-6，mL。

1.2.4Flavonifractor plautii的稀釋涂布平板法計數(shù)另取1 mLFlavonifractor plautii菌液（與上述流式細胞術所用菌液相同），用無菌的磷酸緩沖鹽溶液進行梯度稀釋。選取10-5、10-6、10-7三個稀釋梯度，分別取100 μL稀釋液涂布于GAM固體培養(yǎng)基上[18]，置于37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，培養(yǎng)環(huán)境的相對濕度為50%，氧氣值 ＜300 ppm。選取菌落數(shù)在30～300個的平板進行計數(shù)，單位為CFU/mL[20]。所有操作均在厭氧手套箱中進行，氣體環(huán)境為85%N2、5%CO2、10%H2。

1.2.5Flavonifractor plautii的FCM活菌計數(shù)與稀釋涂布平板法活菌計數(shù)比較 將FCM測得的活菌數(shù)與稀釋涂布平板法檢測出的活菌數(shù)進行比較，并利用皮爾遜相關性分析兩種方法測得的樣本數(shù)據(jù)之間的相關程度。

1.2.6 待測菌株的培養(yǎng)及FCM檢測 將葉綠素加入新鮮的GAM液體培養(yǎng)基中，使其葉綠素濃度分別為100、300、500 μg/mL，而后分別將Bacteroides vulgatus、Bifidobacterium pseudolongum和Lactobacillus murinus以2%的接種量接入含有葉綠素的培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至穩(wěn)定期。三株腸道細菌的FCM檢測與上述Flavonifractor plautii相同。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗重復3 次。采用SPSS 20.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，結果表示為平均值±標準差。采用T檢驗對組間數(shù)據(jù)進行顯著性差異分析，低濃度組、中濃度組和高濃度組與對照組比較，*表示差異顯著（P＜0.05）；**表示差異高度顯著（P＜0.01）；***表示差異極顯著（P＜0.001）。使用Flow Jo 10處理流式細胞圖，Origin 9.0進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 FCM 計數(shù)與稀釋涂布平板法計數(shù)比較

以Flavonifractor plautii為例，應用FCM檢測了體外培養(yǎng)中Flavonifractor plautii的細菌數(shù)，得到如圖1所示的流式細胞圖。分別以活菌和死菌單色對照管為對照，在FSC/SSC散點圖中確定細菌及計數(shù)微球分別所在區(qū)域并圈出。如圖1a中P1（左下）為細菌所在區(qū)域，P2（右上）為計數(shù)微球所在區(qū)域；接下來選中細菌所在區(qū)域，進一步在FITC/PerCP-Cy5-5熒光圖中確定活菌和死菌分別所在區(qū)域并圈出，如圖1b中P3（下側(cè)）為活菌所在區(qū)域，P4（上側(cè)）為死菌所在區(qū)域。統(tǒng)計細菌和計數(shù)微球各自所在門中的events數(shù)分別進行計算，得出相應的細菌數(shù)。對照組（葉綠素濃度為 0 μg/mL）中，F(xiàn)lavonifractor plautii總菌數(shù)為 2.85×108個/mL，其中活菌數(shù)為 2.78×108個/mL，死菌數(shù)為7.39×106個/mL；低濃度組（葉綠素濃度為 100 μg/mL），F(xiàn)lavonifractor plautii總菌數(shù)為 4.01×108個/mL，其中活菌數(shù)為 3.93×108個/mL，死菌數(shù)為 8.75×106個/mL。

圖1 流式細胞術檢測Flavonifractor plautii的細菌數(shù)Fig.1 Flow cytometry to detect the bacterial count of Flavonifractor plautii

SYTO 9可進入細胞膜完整的活細菌內(nèi)與DNA結合，而PI只能進入細胞膜受損或不完整的死細菌內(nèi)[11]。因此，F(xiàn)CM與SYTO 9/PI雙染色液配合使用可以區(qū)分出死菌和活菌各自所占比例，從而實現(xiàn)對腸道菌培養(yǎng)中活細菌和死細菌的同時檢測。

為更好地評估FCM對Flavonifractor plautii細菌數(shù)檢測的效果，實驗同時采用經(jīng)典的活菌計數(shù)方法—稀釋涂布平板法檢測該菌的活菌數(shù)。由圖2a可知，對照組（葉綠素濃度為0 μg/mL）活菌數(shù)為1.0×108CFU/mL，低濃度組（葉綠素濃度為 100 μg/mL）活菌數(shù)為1.4×108CFU/mL，與對照組相比顯著增加（P＜0.05）。對兩種方法測得的活菌數(shù)進行皮爾遜相關性分析，兩者相關性系數(shù)r＞0.8，具有顯著正相關關系（P＜0.001）（圖2b）。

圖2 流式細胞術與稀釋涂布平板法計數(shù)比較Fig.2 Counting comparison between flow cytometry and agar plate method

進一步將FCM與稀釋涂布平板法活菌計數(shù)數(shù)值進行比較，流式細胞術所得數(shù)值均大于稀釋涂布平板法所得數(shù)值（圖2a），這與李可欣等[21]的研究結果相似。這是因為對于一些處于特殊生理狀態(tài)的活菌體細胞，如有活力但不可培養(yǎng)（viable but not culturable, VBNC）、生長緩慢和休眠狀態(tài)的菌體細胞，利用稀釋涂布平板法無法對其進行計數(shù)[22-24]，而FCM是基于特異性染料分別對活細胞和死細胞DNA進行染色，因此可有效檢測出該部分特殊的活菌細胞；此外，由于細菌具有聚集的特性，菌細胞在固體培養(yǎng)基上分布不均勻，一個菌落很有可能是由一個以上的菌細胞生長而來，因此稀釋涂布平板法所得活菌數(shù)通常會小于真實值[25]，而FCM可通過降低流速或菌細胞濃度來最大程度避免細菌聚集對檢測結果的影響[26]，因此其檢測結果更接近真實值。稀釋涂布平板法一般需要培養(yǎng)24～48 h才能進行菌落計數(shù)，對于大部分難以在體外生長的腸道細菌而言，甚至需要48 h以上的時間才能長出菌落，而FCM在30 min內(nèi)即可完成1株菌的計數(shù)檢測，明顯縮短了檢測時間與實驗周期。綜上可知，使用FCM檢測體外培養(yǎng)中腸道菌的細菌數(shù)，可明顯縮短實驗周期，提高檢測效率，同時檢測結果更接近于真實值。因此，接下來的研究中將利用FCM探究葉綠素對不同腸道菌增殖的影響。

2.2 葉綠素對不同腸道菌增殖的影響

2.2.1 葉綠素對珀氏解黃酮菌（Flavonifractor plautii）增殖的影響 由圖3可知，隨著葉綠素濃度的升高，F(xiàn)lavonifractor plautii總菌數(shù)和活菌數(shù)均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，而死菌數(shù)極顯著增加（P＜0.001）。當葉綠素濃度為100 μg/mL時，活菌數(shù)最多，達3.93×108個/mL；當葉綠素濃度為300 μg/mL及以上時，活菌數(shù)逐漸減少。對照組中活菌數(shù)為2.78×108個/mL；與對照組相比，葉綠素濃度為100 μg/mL時，活菌數(shù)增加 1.15×108個/mL，葉綠素濃度為 100 和 500 μg/mL時，活菌數(shù)分別減少 1.33×108和 2.10×108個/mL，表明葉綠素對Flavonifractor plautii的增殖表現(xiàn)出 “低濃度促進、高濃度抑制”的作用規(guī)律。Flavonifractor plautii是一種革蘭氏陽性菌，可參與腸道中兒茶素的代謝[27]，具有降低機體炎癥、改善肥胖的功效[28]。Mikami等[29]研究證明，飲用綠茶可以增加腸道中Flavonifractor plautii的豐度并有助于改善結腸炎；此外，Liu等[30]研究發(fā)現(xiàn)，芝麻素可促進Flavonifractor的生長，有益于腸道健康。因此，100 μg/mL的葉綠素濃度促進Flavonifractor plautii增殖或許有助于改善肥胖和腸道疾病。目前，還未有研究報道外源性物質(zhì)對Flavonifractor plautii生長的影響機制。

圖3 葉綠素對Flavonifractor plautii增殖的影響Fig.3 Effect of chlorophyll on proliferation of Flavonifractor plautii

2.2.2 葉綠素對普通擬桿菌（Bacteroides vulgatus）增殖的影響 由圖4可知，隨著葉綠素濃度的升高，Bacteroides vulgatus總菌數(shù)和活菌數(shù)均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，而死菌數(shù)高度顯著減少（P＜0.01）。當葉綠素濃度為100 μg/mL時，活菌數(shù)最多，達3.09×108個/mL；當葉綠素濃度為300 μg/mL及以上時，活菌數(shù)逐漸減少。對照組中活菌數(shù)為1.61×108個/mL；與對照組相比，葉綠素濃度為100 μg/mL時，活菌數(shù)增加1.47×108個/mL，葉綠素濃度為100和 500 μg/mL時，活菌數(shù)分別減少 1.40×108和 1.35×108個/mL，表明葉綠素對Bacteroides vulgatus的增殖也表現(xiàn)出“低濃度促進、高濃度抑制”的作用規(guī)律。相似地，Kamijo等[31]研究發(fā)現(xiàn)，向培養(yǎng)基中添加0.01%薔薇花瓣粉可促進Bacteroides vulgatusJCM5826T的增殖，而0.05%薔薇花瓣粉則會抑制該菌的增殖（抑制率82%），當濃度提高到0.1%時，該菌的增殖被完全抑制。由此可知，濃度是葉綠素等植物化合物對Bacteroides vulgatus作用的重要影響因素。有研究報道腸道細菌如布勞特氏菌屬（Blautia）可利用卟啉作為能源物質(zhì)或生物合成的前體物質(zhì)，從而促進自身生長[32]，而葉綠素促進Bacteroides vulgatus增殖的機制還有待探究。目前，大多數(shù)植物化合物對腸道菌群生長的研究，主要針對復雜微生物群落展開。其中，植物性化合物對腸道細菌的抑制作用更為常見[33]，而關于促生長機制，目前還未有確切的研究報道。

圖4 葉綠素對Bacteroides vulgatus增殖的影響Fig.4 Effect of chlorophyll on proliferation of Bacteroides vulgatus

2.2.3 葉綠素對假長雙岐桿菌（Bifidobacterium pseudolongum）增殖的影響 如圖5所示，隨著葉綠素濃度的升高，Bifidobacterium pseudolongum總菌數(shù)和活菌數(shù)極顯著減少（P＜0.001），而死菌數(shù)無顯著變化。當葉綠素濃度為0 μg/mL時，Bifidobacterium pseudolongum活菌數(shù)為2.63×108個/mL，隨著葉綠素濃度的增加，Bifidobacterium pseudolongum活菌數(shù)依次減少 7.78×107、1.63×108和 1.82×108個/mL，表明葉綠素可極顯著抑制Bifidobacterium pseudolongum的增殖（P＜0.001），且葉綠素濃度越高，抑制作用越強，呈現(xiàn)劑量依賴性。與其相似的是，Gwiazdowska等[34]研究發(fā)現(xiàn)，橙皮苷和槲皮素對Bifidobacterium adolescentisNCFB 2004和Bifidobacterium bifidumNCFB 2235的增殖也具有抑制作用，且呈現(xiàn)劑量依賴性。Li等[5]基于16S rRNA 基因擴增子測序報道了葉綠素可下調(diào)腸道中雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）的豐度，而本研究將其延伸到菌種水平，首次發(fā)現(xiàn)葉綠素對Bifidobacterium pseudolongum的增殖有抑制作用。

圖5 葉綠素對Bifidobacterium pseudolongum增殖的影響Fig.5 Effect of chlorophyll on proliferation of Bifidobacterium pseudolongum

2.2.4 葉綠素對鼠乳桿菌（Lactobacillus murinus）增殖的影響 如圖6所示，隨著葉綠素濃度的升高，Lactobacillus murinus的總菌數(shù)、活菌數(shù)和死菌數(shù)均顯著增加（P＜0.05）。當葉綠素濃度為 0 μg/mL時，Lactobacillus murinus的總菌數(shù)和活菌數(shù)分別為2.01×107和 2.11×106個/mL；隨著葉綠素濃度的增加，Lactobacillus murinus的總菌數(shù)依次增加3.55×107、7.00×107、1.01×108個/mL，活菌數(shù)依次增加 1.75×106、6.36×105、6.98×105個/mL。說明葉綠素可以極顯著促進Lactobacillus murinus的增殖（P＜0.001），且濃度越高，促進作用越強。與此相似的是，Huang等[35]研究發(fā)現(xiàn)，薯蕷皂苷元也可顯著促進Lactobacillus murinus的增殖，且濃度越高促進效果越好。據(jù)報道，Lactobacillus murinus是一種潛在的益生菌，具有抗過敏[36]、抗炎[37]、改善糖尿病[38]等功效。因此，葉綠素以濃度依賴性的方式促進Lactobacillus murinus增殖，說明葉綠素具有益生元的潛在特性。

圖6 葉綠素對Lactobacillus murinus增殖的影響Fig.6 Effect of chlorophyll on proliferation of Lactobacillus murinus

3 結論

為了探究葉綠素對特定腸道細菌增殖的影響，以期能更好地闡明膳食葉綠素介導腸道菌群調(diào)控人體健康的內(nèi)在規(guī)律。本文比較了FCM和平板計數(shù)法用于體外培養(yǎng)中特定腸道細菌的計數(shù)，證明FCM可實現(xiàn)對腸道細菌的高效、準確計數(shù)；在此基礎上，進一步探究了體外培養(yǎng)中葉綠素對小鼠腸道來源的珀氏解黃酮菌（Flavonifractor plautii）、普通擬桿菌（Bacteroides vulgatus）、假長雙岐桿菌（Bifidobacterium pseudolongum）和鼠乳桿菌（Lactobacillus murinus）增殖的影響。結果表明，葉綠素對Flavonifractor plautii和Bacteroides vulgatus的增殖表現(xiàn)出 “低濃度促進、高濃度抑制”的作用規(guī)律；葉綠素可極顯著抑制Bifidobacterium pseudolongum的增殖（P＜0.001），且呈現(xiàn)劑量依賴性；葉綠素可極顯著促進Lactobacillus murinus的增殖（P＜0.001）。本研究為闡明膳食葉綠素對腸道菌群生長的影響規(guī)律提供了有效的研究方法和重要的理論數(shù)據(jù)。