巴氏滅活嗜黏蛋白阿克曼氏菌對ox-LDL誘導(dǎo)的HAEC細胞損傷的保護作用及機制初探

高靜竹，朱文秀，夏效東,

（1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧大連 116034；

2.國家海洋食品工程技術(shù)研究中心，遼寧大連 116034）

心血管疾病是全球范圍導(dǎo)致死亡的主要原因之一[1]。《中國心血管健康與疾病報告2020》中指出，中國心血管病死亡占城鄉(xiāng)居民總死亡原因的首位，給居民和社會帶來的沉重的經(jīng)濟負擔(dān)[2]。動脈粥樣硬化是心血管系統(tǒng)最常見的疾病，其導(dǎo)致的冠心病、中風(fēng)等心腦血管疾病嚴重危害人類的健康。內(nèi)皮功能障礙是心血管疾病的重要危險因素，是動脈粥樣硬化發(fā)病機制的起始步驟[3]。在內(nèi)皮細胞損傷的諸多因素中，氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）是重要的危險因子，參與細胞損傷以及動脈粥樣硬化病變的發(fā)生發(fā)展[4]。因含過氧化產(chǎn)物及溶血卵磷酯，ox-LDL可破壞細胞膜結(jié)構(gòu)，改變細胞通透性；可通過激活細胞特異性受體，誘導(dǎo)相關(guān)蛋白和基因的表達[5-8]。同時，ox-LDL又可誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞內(nèi)活性氧（Reactive oxygen species, ROS）的生成[9]。外界刺激產(chǎn)生的過量活性氧將致使細胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致細胞內(nèi)抗氧化和促氧化的平衡失調(diào)，進而加重動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[10]。清除體內(nèi)過量的ROS或增強抗氧化能力可能是預(yù)防和治療動脈粥樣硬化的關(guān)鍵點之一[11]。腸道菌群是指在腸道中以共生關(guān)系生活的數(shù)以萬億計的細菌、病毒、真菌、古生菌和真核生物。腸道微生物對宿主具有多種有益的功能，在許多疾病的發(fā)生發(fā)展中的作用已被闡明，和心血管系統(tǒng)之間的關(guān)系也得到了證實[12]。嗜黏蛋白阿克曼氏菌（以下簡稱阿克曼氏菌）是一種革蘭氏陰性厭氧菌，屬于疣微菌門，是一種廣泛分布于人體腸道粘液層的共生菌，占人體腸道微生物的1%～5%[13]。阿克曼氏菌作為下一代益生菌的代表菌株，其潛在功能引起了研究人員的廣泛關(guān)注[14]。

目前已有動物研究表明阿克曼氏菌具有改善代謝紊亂、抗炎、調(diào)節(jié)腸道屏障功能和抗衰老的功能[15-17]。此外，阿克曼氏菌對代謝調(diào)節(jié)相關(guān)的疾病如肥胖和糖尿病的緩解作用已得到臨床試驗驗證[18]。阿克曼氏菌對動脈粥樣硬化也具有一定的改善效果[19-20]。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)對阿克曼氏菌進行巴氏滅活處理后，其對相關(guān)疾病的緩解作用非但沒有消失，反而在某些指標(biāo)改善方面比活菌表現(xiàn)出更好的效果[21]。臨床試驗表明口服巴氏滅活的阿克曼氏菌可使受試者胰島素敏感性提高30%，降低胰島素血癥和高總膽固醇血癥。巴氏滅活的阿克曼氏菌也同時降低了受試者的體重和脂肪量[18]。這些研究結(jié)果表明巴氏滅活的阿克曼氏菌中的某些細菌成分或代謝產(chǎn)物可通過循環(huán)系統(tǒng)到達體內(nèi)發(fā)揮其健康功能。相比活的阿克曼氏菌，巴氏滅活的阿克曼氏菌具有更好的安全性以及便于保存運輸?shù)忍匦?，這些均表明巴氏滅活的阿克曼氏菌可作為原料來開發(fā)具有相應(yīng)健康改善功能的后生元（對宿主起有益作用的滅活菌和/或菌成分）相關(guān)產(chǎn)品。雖然有研究表明阿克曼氏菌能改善糖尿病以及動脈粥樣硬化，但目前的機制主要集中在改善糖脂代謝以及改善腸道屏障減輕腸漏造成的系統(tǒng)炎癥，關(guān)于滅活阿克曼氏菌是否能緩解ox-LDL造成的內(nèi)皮細胞損傷以及相應(yīng)的機制尚未有報道。

基于此，本實驗旨在探究巴氏滅活的阿克曼氏菌對ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮損傷的保護作用并初步探討其可能的機制。本文采用ox-LDL誘導(dǎo)HAEC細胞損傷模型，運用MTT法、JC-1熒光染色、實時熒光定量PCR、免疫印跡法等技術(shù)研究巴氏滅活的阿克曼氏菌對ox-LDL損傷的人主動脈內(nèi)皮細胞活性和功能的影響及潛在的機制。研究結(jié)果可為將來基于滅活阿克曼氏菌開發(fā)具有改善心血管健康的后生元相關(guān)健康食品奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

嗜黏蛋白阿克曼氏菌（ATCC BAA-835） 美國模式菌株保藏中心；人主動脈內(nèi)皮細胞（HAEC） 中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心；高糖DMEM（Dulbecco's modified eagle medium）培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；BHI腦心浸液肉湯 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；氧化型低密度脂蛋白 廣州奕源生物科技有限公司；BCA（Bicinchoninic acid assay）蛋白濃度測定試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；活性氧檢測試劑盒、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒、過氧化氫酶（Catalase，CAT）檢測試劑盒、總抗氧化能力（Total antioxidant capacity，TAOC）檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；Nrf2、HO-1、NQO1、β-actin抗體 武漢愛博泰克生物科技有限公司；其他試劑 均為分析純；相關(guān)引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

Revolve Generation 2正倒置一體熒光顯微鏡美國Echo公司；PowerPac基礎(chǔ)電泳儀電源、Mini-PROTEAN Tetra垂直電泳槽 美國Bio-Rad公司；MF-ChemiBIS 2.0凝膠成像儀 以色列DNR公司；Infinite F200 PRO熒光酶標(biāo)儀 瑞士Tecan Infinite公司；MyCycler實時熒光定量PCR儀 德國耶拿公司；LDZX-30KBS高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；TS-2000A脫色搖床 上海書培實驗設(shè)備有限公司；T100 Thermal Cycler PCR儀 德國Biometra公司；NanoDrop-One微量核酸定量儀 賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 巴氏滅活的嗜黏蛋白阿克曼氏菌的制備 將-80 ℃超低溫冰箱中凍存的嗜黏蛋白阿克曼氏菌接種在含黏蛋白的BHI 培養(yǎng)基中，在厭氧條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期。8000 r/min，10 min條件下離心棄上清，使用PBS洗菌體2次并重懸，調(diào)整懸液到OD600nm=0.8（濃度為108CFU/mL左右）。在70 ℃水浴鍋中加熱30 min，-20 ℃保存。

1.2.2 HAEC細胞培養(yǎng) 在37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下，HAEC細胞培養(yǎng)于含有10% FBS、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，取對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.3 細胞活性實驗 將 100 μL 1×105個/mL HAEC細胞懸液接種于96孔細胞培養(yǎng)板中。培養(yǎng)24 h后，加入不同菌數(shù)的巴氏滅活的阿克曼氏菌（105、106、107、108CFU/mL）于 37 ℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。向每孔中加入20 μL 5 mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)孵育細胞4 h。形成的甲瓚晶體溶解于150 μL DMSO中，使用酶標(biāo)儀檢測OD490nm的吸光度。

1.2.4 細胞分組 在后續(xù)實驗中，細胞均分為以下幾組，并進行相應(yīng)處理?？瞻捉M：使用無血清培養(yǎng)基孵育24 h；模型組：用含50 μg/mL ox-LDL的無血清培養(yǎng)基孵育24 h；樣品組：用含不同菌數(shù)巴氏滅活的阿克曼氏菌（105、106CFU/mL）以及 50 μg/mL ox-LDL的無血清培養(yǎng)基孵育24 h。

1.2.5 乳酸脫氫酶釋放檢測 將HAEC細胞懸液接種于96孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h。待細胞貼壁后分為三組，按照1.2.4方法處理。孵育結(jié)束后，用PBS緩沖液輕輕洗滌細胞2次，按照乳酸脫氫酶（Lactic dehydrogenase, LDH）檢測試劑盒的說明書要求，吸取細胞上清液進行LDH活性檢測。

1.2.6 活性氧水平檢測 利用二氯熒光乙酰乙酸鹽（DCFH-DA）熒光探針測定HAEC細胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS含量。將1 mL 1×106個/mL HAEC細胞接種到12孔細胞培養(yǎng)板中，按照1.2.4節(jié)的方法處理細胞24 h后，按照ROS檢測試劑盒說明書操作步驟測定各孔的熒光強度。

1.2.7 抗氧化酶SOD、CAT活力及總抗氧化能力檢測 將HAEC細胞接種到12孔細胞培養(yǎng)板中，按照1.2.4節(jié)的方法處理細胞24 h后，胰酶消化細胞，收集至1.5 mL EP管中。使用PBS洗兩次后，超聲破碎細胞，在4 ℃ 1000 r/min條件下離心10 min，收集上清液。根據(jù)SOD、CAT、T-AOC試劑盒說明書，檢測上清液中的SOD、CAT活力和總抗氧化能力。

1.2.8 RT-PCR檢測細胞相關(guān)抗氧化基因的表達將1×106個/mL細胞接種于6孔板并放入CO2培養(yǎng)箱中保持37 ℃過夜培養(yǎng)，按照1.2.4節(jié)的方法處理細胞24 h后，用PBS將細胞潤洗3次，嚴格依據(jù)RNA提取試劑盒說明書操作，提取細胞RNA。微量核酸定量儀測定RNA濃度，使用Evo M-MLV RT Kit with gDNA Clean for qPCR II試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后放在-20 ℃冰箱保存待用。利用SYBR Green Permix Pro Taq HS qPCR試劑盒做熒光定量PCR檢測，10 μL反應(yīng)體系（上下游引物各0.2 μL，SYBR Green Permix Pro Taq HS 5.0 μL，無RNA 酶水 3.6 μL，cDNA 模板 1.0 μL）。以β-actin基因作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法分析基因的相對表達量。相關(guān)引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR實驗中的引物序列Table 1 Primer sequences used for qPCR

1.2.9 Western blot檢測相關(guān)蛋白的表達 采用Western blot實驗測定細胞內(nèi)Nrf2及其下游抗氧化酶HO-1蛋白的表達量。將細胞按照1.2.4節(jié)的方法處理后加入 100 μL細胞裂解液（含 1 mmol/L PMSF），然后用刮刀刮取細胞放置在EP管內(nèi)，劇烈震蕩 20 s，冰浴 10～15 min。10000 r/min 4 ℃ 條件下離心15 min，收集上清。使用BCA試劑盒測定蛋白濃度并將蛋白濃度調(diào)到一致。以V（蛋白樣品）:V（上樣緩沖液）=1:4的比例加入 5×loading buffer。將樣品混勻后于100 ℃變性10 min，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

配制質(zhì)量分數(shù)12%的分離膠和5%的濃縮膠，上樣，分離目的蛋白。采用濕轉(zhuǎn)的方法，將目的蛋白電轉(zhuǎn)至NC膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，使用TBST洗膜3次，每次10 min。將NC膜放入抗體Nrf2、HO-1、NQO1稀釋液中 4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，將配好的化學(xué)發(fā)光液滴于膜上，通過凝膠成像儀成像，并通過Image J軟件定量分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個實驗結(jié)果均做三次平行實驗。采用SPSS Statistics 19軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，進行單因素方差分析與Duncan氏多重比較。實驗結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。P＜0.05表示差異顯著。使用Origin 2021軟件進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 巴氏滅活的阿克曼氏菌對HAEC細胞活力的影響

采用MTT法分析巴氏滅活的阿克曼氏菌對HAEC細胞活力的影響，結(jié)果如圖1所示。當(dāng)巴氏滅活的阿克曼氏菌菌數(shù)低于106CFU/mL時，細胞活力均大于90%，表明該劑量的細菌對細胞基本無不良影響。當(dāng)巴氏滅活的阿克曼氏菌菌數(shù)超過107CFU/mL時，與對照組相比，細胞的活力有一定的降低。因此本研究將選取105、106CFU/mL作為巴氏滅活的阿克曼氏菌的干預(yù)劑量進行后續(xù)實驗。

圖1 巴氏滅活的阿克曼氏菌PAKK對HAEC細胞活力的影響Fig.1 Effects of PAKK on the viabilities of HAEC

2.2 巴氏滅活的阿克曼氏菌對HAEC損傷細胞的LDH釋放的影響

乳酸脫氫酶是一種氧化還原酶，內(nèi)皮細胞功能障礙、凋亡或壞死等造成細胞膜結(jié)構(gòu)被破壞，會導(dǎo)致細胞漿內(nèi)的乳酸脫氫酶釋放到培養(yǎng)液中，因此LDH釋放被視為檢測細胞完整性的重要指標(biāo)。巴氏滅活的阿克曼氏菌對ox-LDL誘導(dǎo)HAEC細胞的LDH釋放的影響，結(jié)果如圖2所示，與對照組相比，ox-LDL處理24 h后，HAEC細胞的LDH釋放增強（P＜0.05）。而巴氏滅活的阿克曼氏菌（105、106CFU/mL）可顯著逆轉(zhuǎn)氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的細胞內(nèi)LDH釋放的增加（P＜0.05）。結(jié)果表明巴氏滅活的阿克曼氏菌具有保護細胞膜結(jié)構(gòu)的作用，能夠抑制胞內(nèi)物質(zhì)的流出。Liu等[22]使用GPR120受體激活劑GW9508干預(yù)ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞后，LDH釋放量明顯下降，與本研究結(jié)果一致。

圖2 PAKK對HAEC損傷細胞LDH釋放的影響Fig.2 Effect of PAKK on LDH release from injured HAEC

2.3 巴氏滅活的阿克曼氏菌對HAEC損傷細胞內(nèi)ROS水平的影響

ROS是細胞氧化損傷的一個重要標(biāo)志[23]。據(jù)報道，ROS的釋放與多種心血管疾病有關(guān)[24]。在氧化劑誘導(dǎo)的細胞毒性中，ROS的釋放是一個早期和關(guān)鍵的事件[25]。如圖3所示，與對照組細胞相比，經(jīng)ox-LDL損傷刺激后，HAEC細胞內(nèi)ROS水平顯著增加（P＜0.05），約為對照組的162%。而經(jīng)過巴氏滅活的阿克曼氏菌處理后，細胞的ROS含量顯著降低（P＜0.05），且呈現(xiàn)劑量依賴性。實驗結(jié)果表明，巴氏滅活的阿克曼氏菌能夠顯著降低HAEC細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，從而緩解細胞的氧化損傷。與本文的報道類似，Zhou等[26]研究表明具有心血管改善功能的苦參堿也能夠以濃度依賴的方式顯著降低ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細胞的ROS水平。Wang等[27]研究發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌SC06處理能夠降低H2O2誘導(dǎo)的腸上皮細胞內(nèi)ROS水平。

圖3 PAKK對HAEC損傷細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的影響Fig.3 Effects of PAKK on the production of ROS in injured HAEC

2.4 巴氏滅活的阿克曼氏菌對HAEC損傷細胞抗氧化酶及總抗氧化能力的影響

巴氏滅活的阿克曼氏菌對ox-LDL誘導(dǎo)HAEC細胞內(nèi)SOD活力、CAT活力和總抗氧化能力影響的結(jié)果如圖4所示。經(jīng)ox-LDL處理的細胞與對照組細胞相比，HAEC細胞內(nèi)的SOD活力，CAT活力及總抗氧化能力均顯著降低（P＜0.05）。與ox-LDL處理組相比，巴氏滅活的阿克曼氏菌干預(yù)組中HAEC細胞內(nèi)的SOD活力、CAT活力和總抗氧化能力均有顯著升高（P＜0.05）。超氧化物歧化酶、過氧化氫酶作為是抗氧化酶系統(tǒng)的最主要成員，也是生物抗氧化系統(tǒng)的重要防線[28]。SOD可以把有害的超氧自由基轉(zhuǎn)化為過氧化氫。盡管過氧化氫仍是對機體有害的活性氧，但體內(nèi)的CAT會立即將其分解為完全無害的水，在延緩機體衰老、抵御疾病等方面發(fā)揮著重要的作用[29]?？偪寡趸芰κ怯糜诤饬繖C體抗氧化系統(tǒng)功能狀況的綜合性指標(biāo)，單獨測定某一種或某些抗氧化成分的含量往往不能全面的反映組織的抗氧化能力，因而可通過T-AOC來評價機體總體上的抗氧化能力，即測定對象中各種抗氧化物質(zhì)和抗氧化酶等構(gòu)成總抗氧化水平[30]。以上實驗結(jié)果表明，巴氏滅活的阿克曼氏菌能顯著提高ox-LDL誘導(dǎo)氧化損傷的HAEC細胞內(nèi)SOD和CAT酶活力，提高細胞的總抗氧化能力，有效清除氧化損傷細胞內(nèi)的ROS，從而保護HAEC細胞免受ox-LDL誘導(dǎo)的氧化損傷。

圖4 PAKK對HAEC損傷細胞內(nèi)抗氧化酶活力及抗氧化能力的影響Fig.4 Effects of PAKK on antioxidative enzyme activity and antioxidant capacity in injured HAEC

Wang等[31]探究了重組植物乳桿菌對H2O2誘導(dǎo)的HUVEC細胞氧化應(yīng)激的保護作用。研究發(fā)現(xiàn)，重組植物乳桿菌能夠顯著下調(diào)H2O2誘導(dǎo)HUVEC細胞內(nèi)的ROS水平和SOD酶活力（P＜0.05）。崔志文等[32]研究發(fā)現(xiàn)，氧化損傷的Caco-2細胞內(nèi)，SOD、CAT酶活力以及T-AOC水平顯著降低（P＜0.05）；而經(jīng)過鼠李糖乳酸桿菌處理，上調(diào)了細胞SOD、CAT酶活力以及T-AOC水平（P＜0.05），與本研究結(jié)果一致。

2.5 巴氏滅活的阿克曼氏菌對 HAEC損傷細胞Nrf2、HO-1基因及蛋白表達的影響

巴氏滅活的阿克曼氏菌對ox-LDL誘導(dǎo)HAEC細胞中Nrf2/HO-1信號通路中相關(guān)基因mRNA表達量的影響如圖5所示。對Nrf2基因以及下游的3個基因HO-1、NQO1、GST的表達情況分別進行了測定。與空白組細胞相比，ox-LDL處理后，細胞中Nrf2、HO-1、NQO1和GST基因受到明顯的抑制。經(jīng)過巴氏滅活的阿克曼氏菌處理后，mRNA表達顯著升高（P＜0.05）。Western blot結(jié)果如圖6所示，ox-LDL處理組的Nrf2、HO-1和NQO1蛋白相對表達量顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，105、106CFU/mL巴氏滅活的阿克曼氏菌處理組中Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表達量均顯著升高（P＜0.05）。Nrf2/HO-1途徑被認為是細胞抗氧化防御的關(guān)鍵機制。Nrf2是維持氧化還原穩(wěn)態(tài)和細胞抗氧化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，能夠通過抗氧化反應(yīng)元件調(diào)節(jié)多種抗氧化系統(tǒng)及Ⅱ期解毒酶的表達[33]。其中Ⅱ期解毒酶包括HO-1、NQO1、GST[34]。HO-1 在動脈粥樣硬化性疾病中起重要的保護作用。有大量研究發(fā)現(xiàn)，HO-1的表達上調(diào)有助于細胞抵御外界刺激，緩解氧化應(yīng)激損傷[35-36]。以上結(jié)果表明，巴氏滅活的阿克曼氏菌可能通過激活HAEC細胞的Nrf2/HO-1信號通路，從而提高細胞抗氧化酶的活力和抗氧化基因的表達，發(fā)揮其對ox-LDL誘導(dǎo)HAEC損傷的保護作用。

圖5 PAKK對HAEC損傷細胞內(nèi)mRNA相對表達量的影響Fig.5 Effects of PAKK on the relative mRNA expression in injured HAEC

圖6 PAKK對HAEC損傷細胞內(nèi)蛋白相對表達量的影響Fig.6 Effects of PAKK on the relative protein expression in injured HAEC

之前有研究探究了格氏乳桿菌SBT2055對3T3細胞氧化應(yīng)激的保護作用[37]。研究發(fā)現(xiàn)，格氏乳桿菌SBT2055處理能夠顯著上調(diào)3T3細胞內(nèi)Nrf2和HO-1的蛋白質(zhì)水平（P＜0.05）。Mu等[38]研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌Y44能夠通過激活Nrf2信號通路，顯著上調(diào)Caco-2細胞內(nèi)Nrf2和HO-1蛋白的表達（P＜0.05），保護細胞免受ABAP誘導(dǎo)的氧化損傷。

3 結(jié)論

本實驗結(jié)果表明，巴氏滅活的嗜黏蛋白阿克曼氏菌對ox-LDL氧化損傷的HAEC細胞具有一定的保護作用。巴氏滅活的阿克曼氏菌能夠降低ox-LDL誘導(dǎo)的HAEC細胞內(nèi)LDH的釋放，保護細胞完整性；降低細胞內(nèi)活性氧的生成，提高抗氧化酶活力，上調(diào)抗氧化基因的表達，緩解細胞氧化損傷。巴氏滅活的阿克曼氏菌能夠明顯上調(diào)ox-LDL處理的HAEC細胞內(nèi)Nrf2、HO-1基因及相關(guān)蛋白的表達量，表明巴氏滅活的阿克曼氏菌可能通過激活Nrf2/HO-1信號通路，發(fā)揮其對ox-LDL損傷的HAEC細胞的保護作用。本研究將為今后開發(fā)基于阿克曼氏菌的后生元相關(guān)制劑用于預(yù)防和減緩動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展奠定理論基礎(chǔ)。