乳酸菌對酵母菌發(fā)酵多谷物雜糧面包品質(zhì)的影響

張愛霞，苗盼盼，李朋亮，趙 巍，生慶海，張佳麗，劉敬科, ，劉 晶,

（1.河北省農(nóng)林科學院生物技術(shù)與食品科學研究所，河北石家莊 050051；

2.河北經(jīng)貿(mào)大學生物科學與工程學院，河北石家莊 050071）

飲食過度精細化和單一化對人體營養(yǎng)和健康的危害引起了人們的高度重視，尤其后疫情時代，國民更加注重健康，因此富含維生素、礦物質(zhì)、膳食纖維、多糖和酚類等多種營養(yǎng)和功能物質(zhì)的全谷物雜糧及其加工產(chǎn)品引起了人們的廣泛關注，而且多種全谷物雜糧合理搭配具有營養(yǎng)互補效果，極大彌補了單一食材營養(yǎng)不足和營養(yǎng)不均衡等問題。已有研究證實，小麥粉與黃豆、糙小米、燕麥等雜糧合理搭配研制的復配雜糧饅頭，其營養(yǎng)均衡性優(yōu)于純小麥饅頭，而且具有穩(wěn)定人體血糖的效果[1]。但是由于很多全谷物雜糧加工適應性差，加工產(chǎn)品存在口感粗糙、適口性差等問題，因此開發(fā)全谷物雜糧食品仍存在一些亟待解決的技術(shù)難題。

酸面包是酵母菌聯(lián)合乳酸菌發(fā)酵的傳統(tǒng)面制品，以其獨特的風味和較高的營養(yǎng)價值受到消費者喜愛。有研究表明，在面團發(fā)酵過程中酵母菌和一些乳酸菌可以分解原料中的糖類和蛋白質(zhì)，顯著提高食物消化率和生物價[2-3]，混菌發(fā)酵增加了面包中多酚和抗性淀粉含量從而降低了產(chǎn)品血糖生成指數(shù)[4]，也具有改善產(chǎn)品品質(zhì)和增強產(chǎn)品風味的效果[5-6]，尤其很多全谷物雜糧富含的膳食纖維和多糖成分（如大豆低聚糖、葡聚糖等），是乳酸菌的增殖因子[7-8]。由于雜糧加工適應性差，加工產(chǎn)品中雜糧添加量普遍較低，限制了雜糧的消費，為拓寬雜糧的應用范圍、改善雜糧加工產(chǎn)品的品質(zhì)，開展了本研究。通過選用小麥粉搭配黃豆、黑豆、紅豆、蕎麥、燕麥全谷物雜糧，將微生物發(fā)酵技術(shù)應用到全谷物雜糧面包加工中，利用酵母菌聯(lián)合乳酸菌發(fā)酵改善雜糧的加工適應性，探索乳酸菌與酵母菌協(xié)同作用對復配雜糧面團和面包品質(zhì)的改善效果。利用生物發(fā)酵技術(shù)提高全谷物雜糧利用率（全谷物雜糧占比35%），一方面改變由于雜糧添加量不足使雜糧加工產(chǎn)品的營養(yǎng)功能特性不能充分體現(xiàn)的現(xiàn)象；另一方面為下一步深入開展優(yōu)質(zhì)復配雜糧面包產(chǎn)品研發(fā)和營養(yǎng)功能特性研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

高筋小麥粉 五得利面粉集團有限公司；黃豆（冀星5號）、紅豆（冀紅16號） 均由河北省農(nóng)林科學院糧油作物研究所提供；燕麥（壩1） 張家口北燕燕麥食品開發(fā)有限公司；蕎麥（中甜蕎2號） 張家口市農(nóng)業(yè)科學院提供；安琪酵母 安琪酵母股份有限公司；黃油 恒天然商貿(mào)（上海）有限公司；谷朊粉 封丘縣華豐粉業(yè)有限公司；凍干型乳酸菌粉-六菌復合（活菌數(shù)≥1.0×1010CFU/g），包括乳雙歧桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、青春雙歧桿菌、長雙歧桿菌六種 山東中科嘉億生物工程有限公司；黑豆、雞蛋 均為市售；其他試劑 均為分析純。

Self Cooking Center XS萬能蒸烤箱 德國Rational；AG285分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；TMS-Pro食品物性分析儀（質(zhì)構(gòu)儀） 美國 Food Technology Corporation；TA HR-10流變儀美國TA儀器沃特斯公司；WPL-125BE 電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津市泰斯特儀器有限公司；Flavour-Spec?氣相離子遷移譜聯(lián)用儀 德國GAS公司；實驗室pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 復配雜糧面包制作工藝 a.配方設計：將高筋粉、黃豆粉、黑豆粉、紅豆粉、燕麥粉、蕎麥粉按13:2:1:1:2:1的比例制成均勻的混合粉200 g，除高筋粉外其他雜糧和豆類原料占混合粉總質(zhì)量百分比為35%。

b.添加輔料：按照占上述混合粉的質(zhì)量百分數(shù)，添加雞蛋20%、谷朊粉5%、木糖醇15%、黃油8%、鹽0.7%。

c.加入發(fā)酵劑：按照占上述混合粉的質(zhì)量百分數(shù)，添加1.5%的酵母和0.03%～0.12%的乳酸菌凍干粉。

d.和面：依據(jù)前期預實驗結(jié)果，按混合粉∶水=2∶1加入40 ℃純凈水，將混合粉、輔料和發(fā)酵劑混合均勻后加水和面，揉面5 min制成光滑的面團。

e.醒發(fā)：將和好的面團放于 38 ℃培養(yǎng)箱中醒發(fā)60 min。

f.整形：將發(fā)酵好的面團分割成（65±0.1）g 的小面團，整形放入模具，在 38 ℃培養(yǎng)箱中靜置10 min，進行二次醒發(fā)。

g.焙烤：在二次醒發(fā)好的面團外部刷一層蛋液，放于預熱好的蒸烤箱中140 ℃烘焙30 min。

1.2.2 發(fā)酵面團pH和發(fā)酵體積測定 參考王杰瓊[9]的方法測定面團的pH和發(fā)酵體積，稍作改動。先按照乳酸菌粉添加量為0、0.03%、0.06%、0.09%和0.12%比例制作復配雜糧面團。準確稱取面團10.00 g放于已滅菌的50 mL離心管中整平至10 mL，放在38 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進行醒發(fā)，每隔20 min記錄一次發(fā)酵面團的體積。準確稱取10.00 g面團，置于相同條件下醒發(fā)，每隔20 min取出一份，將其溶解于90 mL蒸餾水中（煮沸冷卻），磁力攪拌5 min，用pH計測量懸濁液的pH，即為發(fā)酵面團樣品的pH。每組樣品平行測定3次。

1.2.3 發(fā)酵面團流變特性檢測 稱取5 g面團，選取直徑為40 mm的平板，測試時兩平板的間距為2 mm，將待測面團放于平板之間。頻率掃描測定條件：等待時間 300 s，應變振幅 1.0%，溫度 25 ℃，頻率0.5～90 rad/s。掃描測定樣品的儲能模量（Storage modulus，G'）、損耗模量（Loss modulus，G"）與損耗角正切值（tanδ=G"/G'）隨著頻率的變化曲線。每組樣品平行測定3次。

1.2.4 面包質(zhì)構(gòu)特性檢測 將烘焙后的面包放于室溫（22±1 ℃）冷卻1 h后，挑選大小、高度一致的面包，用質(zhì)構(gòu)分析儀測定面包的硬度、彈性、膠粘性和咀嚼性指標。測定條件：感應元量程為500 N，測試速度為60 mm/min，起始力為1 N，形變百分量為30%。每組樣品平行測定3次，結(jié)果取平均值。

1.2.5 面包比容測定 烘焙后的面包放于室溫（22±1）℃冷卻1 h后稱重，采用小米替代法測定面包體積。每組樣品平行測定3次，比容取平均值。

面包比容計算公式：面包比容（mL/g）=面包體積（mL）/面包質(zhì)量（g）

1.2.6 面包感官評價 參照GB/T 35869-2018評價標準，并略作修改，由10位經(jīng)過培訓的人員（男性4名，女性6名）組成評價小組，采用評分法對復配雜糧面包的形態(tài)、色澤、質(zhì)地、紋理結(jié)構(gòu)、風味和口感進行評價，滿分為100分，評分標準見表1，最終結(jié)果取平均值。

表1 面包感官評分標準Table 1 Sensory evaluation of bread

1.2.7 面包揮發(fā)性風味物質(zhì)分析 通過氣相色譜-離子遷移譜聯(lián)用（GC-IMS）技術(shù)對面包風味成分進行分析，色譜柱類型MXT-5（弱極性，15 m×0.53 mm，4 μm）。取2 g雜糧面包放于20 mL頂空瓶中，80 ℃孵育20 min后進樣，分析時間30 min，柱溫60 ℃，IMS溫度為45 ℃。自動頂空進樣單元：進樣體積200 μL，進樣針溫度 85 ℃，孵化轉(zhuǎn)速為 500 r/min。每組樣品平行測定3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均為3次平行測量的平均值，采用SPSS20.0軟件進行方差分析和最小顯著差異分析（LSD）。數(shù)據(jù)繪圖使用Graphpad軟件。

風味物質(zhì)數(shù)據(jù)采用儀器配套軟件VOCal，以及內(nèi)置的NIST和IMS數(shù)據(jù)庫進行定性分析，采用Gallery Plot軟件進行指紋圖譜對比，直觀且定量分析不同樣品間揮發(fā)性有機物的差異。通過“最近鄰”指紋分析，計算每兩個樣本間的歐式距離，進行相似度分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌粉添加量對發(fā)酵雜糧面團pH和體積的影響

研究了乳酸菌粉添加量對發(fā)酵面團pH影響，如圖1所示。由圖1可知，發(fā)酵初期面團的pH基本一致為6.68左右（6.65～6.70），隨著面團發(fā)酵時間延長，所有面團pH均有下降趨勢，與單一酵母菌發(fā)酵面團pH比較，添加乳酸菌粉的面團pH下降幅度較大，而且乳酸菌粉添加量越大，pH降低程度越大。根據(jù)pH變化速度將面團發(fā)酵過程分為快速發(fā)酵（0～60 min）和緩慢發(fā)酵（60～120 min）兩個階段。在發(fā)酵到60 min時，單一酵母菌發(fā)酵面團pH為6.52，比未發(fā)酵時降低了2.99%；添加 0.03%、0.06%、0.09%和0.12%乳酸菌粉發(fā)酵面團pH分別為6.49、6.25、6.42和6.35，比未發(fā)酵時降低了3.73%、4.03%、4.18%和4.80%。在緩慢發(fā)酵階段，發(fā)酵到120 min與60 min時比較，單一酵母菌發(fā)酵面團pH降低了1.85%，添加0.03%、0.06%、0.09%和0.12%乳酸菌粉面團pH分別降低了2.17%、2.22%、2.18%和2.05%?？傊?20 min發(fā)酵過程中，添加乳酸菌粉比單一酵母菌發(fā)酵面團的pH降低程度大，分析與乳酸菌代謝密切相關，干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌在糖類代謝過程中產(chǎn)生乙酸等酸性物質(zhì)，青春雙歧桿菌發(fā)酵糖類可以產(chǎn)生琥珀酸和乙酸，長雙歧桿菌在糖類代謝中產(chǎn)生乙酸和乳酸，乳雙歧桿菌在糖類代謝時生成乙酸，有機酸含量不斷積累是面團pH下降的主要原因[10]。

圖1 乳酸菌粉添加量對發(fā)酵面團pH的影響Fig.1 Effects of lactic acid bacteria on pH of fermented dough

乳酸菌粉添加量對發(fā)酵面團體積影響如圖2所示。發(fā)酵開始時面團體積相同，隨著發(fā)酵時間延長面團體積逐漸增大，發(fā)酵初期面團體積增加緩慢，當發(fā)酵到120 min，乳酸菌粉添加量越大，發(fā)酵面團最終體積也越大。發(fā)酵到60 min時，單一酵母菌發(fā)酵面團體積增加了48.51%，添加0.03%、0.06%、0.09%和0.12%乳酸菌粉發(fā)酵面團體積分別增加了50.00%、107.92%、100%和88.12%。發(fā)酵過程中，添加0.03%乳酸菌粉發(fā)酵面團體積與單一酵母菌發(fā)酵相近；隨著乳酸菌粉添加量增加，發(fā)酵面團體積也有增大趨勢，尤其添加0.06%乳酸菌粉面團在發(fā)酵60 min內(nèi)體積增加最快，比單一酵母菌發(fā)酵面團體積增加6 mL，說明適量添加乳酸菌可增大面團發(fā)酵體積。在面團發(fā)酵過程中，酵母菌代謝小麥粉中的麥芽糖和葡萄糖等糖類產(chǎn)生CO2，產(chǎn)生蜂窩狀組織結(jié)構(gòu)，使面團膨脹松軟，體積增大。但糧豆的添加，使面團中面筋比例降低[9]，面團持氣能力下降，因此發(fā)酵體積有限，而添加適量乳酸菌后，乳酸菌代謝中會產(chǎn)生葡聚糖、果聚糖和雜多糖等多糖類，這些胞外多糖具有穩(wěn)定劑和乳化劑作用[11-12]，增加了面團三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，使其持氣能力增強，發(fā)酵體積增大。

圖2 乳酸菌粉添加量對發(fā)酵面團體積的影響Fig.2 Effects of lactic acid bacteria on the volume of fermented dough

2.2 乳酸菌粉添加量對發(fā)酵面團流變特性影響

乳酸菌粉添加量對發(fā)酵面團流變特性影響見圖3。由圖3可知，各種面團儲能模量G'始終大于損耗模量G''，面團呈固態(tài)特性。G'和G''均隨著角頻率的增加而增加，并趨于平穩(wěn)。與單一酵母菌發(fā)酵面團比較，添加不同比例乳酸菌粉面團的G'和G''值均有不同程度降低，說明添加乳酸菌粉對面團的硬度和韌性具有一定影響。乳酸菌粉添加量為0.06%時，G'和G''變化程度較小，分別降低33.33%和30.00%，而乳酸菌粉添加量為0.03%、0.09%和0.12%對面團彈性和韌性影響較大（降低35%以上）。面團tanδ均小于1，說明面團彈性占主導地位，面團tanδ隨頻率升高呈逐漸增大趨勢，表明在頻率掃描范圍內(nèi)混合面團體系穩(wěn)定性增強[13]。乳酸菌粉添加量為0.09%時面團tanδ值最大，其次為添加0.06%，分別比單一酵母菌發(fā)酵面團提高5.13%和4.44%。有研究表明，乳酸菌代謝過程中生成胞外多糖，在一定程度上影響面團穩(wěn)定性和粘彈性[12]。也有研究報道，乳酸菌發(fā)酵過程中還生成琥珀酸和乙酸等有機酸[10,14]，可促使面團中蛋白質(zhì)和淀粉水解，改變面團的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而影響發(fā)酵面團的粘彈性。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加乳酸菌粉后對面團G'和G''值具有一定影響，當乳酸菌粉添加量為0.06%時變化最小，需結(jié)合其他指標做進一步分析。

圖3 不同乳酸菌粉添加量下角頻率對面團流變特性的影響Fig.3 Influence of lactic acid bacteria on variation of G', G'' and tanδ with angular trequency

2.3 乳酸菌粉添加量對多谷物雜糧面包質(zhì)構(gòu)特性的影響

乳酸菌粉添加量對面包質(zhì)構(gòu)特性的影響結(jié)果如圖4所示。乳酸菌粉添加量為0.06%時面包的彈性值最大為10.24 mm，顯著高于其他面包（P＜0.05），說明乳酸菌發(fā)酵后的面團持氣性更佳，與相關研究結(jié)果一致[15]；乳酸菌粉添加量為0.06%時面包的硬度、膠粘性和咀嚼性數(shù)值均最小，顯著低于其他面包（P＜0.05），比單一酵母菌發(fā)酵面包分別降低25.62%、28.50%和30.60%。硬度、膠粘性和咀嚼性與面包品質(zhì)具有負相關性，適量添加乳酸菌粉改善了面包硬度，提高了面包的彈性，分析原因可能是酵母菌聯(lián)合乳酸菌發(fā)酵，產(chǎn)生的蛋白酶和淀粉酶類將大分子蛋白質(zhì)和淀粉水解成低分子的肽、氨基酸和糖類等，改善了面包面團的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)[16-17]，從而增強了面包面團的持氣能力和吸水性，所以面包更加柔軟和富有彈性。

圖4 乳酸菌粉添加量對多谷物雜糧面包質(zhì)構(gòu)的影響Fig.4 Effects of lactic acid bacteria on textural property of multigrain bread

2.4 乳酸菌粉添加量對多谷物雜糧面包比容和感官品質(zhì)的影響

乳酸菌粉添加量對復配雜糧面包比容和感官品質(zhì)的影響見圖5。當乳酸菌粉添加量在0.06%以上時，面包比容顯著高于單一酵母菌發(fā)酵面包（P＜0.05），尤其當乳酸菌粉添加量為0.06%時比容最大為2.94 mL/g，比單一酵母菌發(fā)酵面包比容增加24.88%。適量添加乳酸菌能增加雜糧面包的比容，與莊靚等[18]研究結(jié)果一致。面包比容的增加，一方面是乳酸菌通過協(xié)同作用提高酵母菌活性，增大產(chǎn)氣量；另一方面是乳酸菌發(fā)酵增加了面團的氣孔稠密度和氣孔表面積分率[15]，而且與前面分析的面包質(zhì)構(gòu)特性改善的實驗結(jié)果相互印證。

圖5 乳酸菌粉添加量對多谷物雜糧面包比容和感官的影響Fig.5 Effects of lactic acid bacteria on specific volume and sensory property of multigrain bread

通過感官評分可知，添加乳酸菌粉的雜糧面包感官評分均顯著高于單一酵母菌發(fā)酵雜糧面包（P＜0.05），尤其乳酸菌粉添加量為0.06%感官評分最高為81.56，表現(xiàn)出外形光滑、平整，質(zhì)地柔軟、有彈性，面包內(nèi)芯氣孔細密均勻，口感細膩，香氣濃郁。當乳酸菌粉添加量高于0.09%時，面包內(nèi)芯氣孔大小不均勻，略有酸味，口感發(fā)粘，降低了感官評分值。單一酵母菌發(fā)酵雜糧面包質(zhì)地較硬，彈性較小，面包內(nèi)芯氣孔小而且孔壁厚，口感略粗，香氣較淡，導致感官評分較低。由此可見，適量添加乳酸菌粉對多谷物雜糧面包的形態(tài)、質(zhì)地、紋理結(jié)構(gòu)、風味和口感均具有較好的改善效果。有研究表明，含有乳酸菌和酵母菌的酸面團發(fā)酵不僅可以改善面包的質(zhì)地、風味等感官品質(zhì)[19-20]，而且增加氨基酸、膳食纖維、多酚等營養(yǎng)和功能物質(zhì)含量[21]，提高產(chǎn)品的抗氧化等功能特性。

2.5 多谷物雜糧面包風味物質(zhì)分析

通過上述分析可知，酵母菌聯(lián)合復合乳酸菌發(fā)酵復配雜糧面包具有較好的感官品質(zhì)，因此，本研究通過氣相離子遷移譜技術(shù)對三種不同面包風味進行了檢測。通過分析三種面包風味物質(zhì)指紋圖譜（圖6）可知，三種面包的風味物質(zhì)比較具有較大差異，面包3-B揮發(fā)性有機物種類最多，共65種不同化合物，而且濃度最高；面包2-B揮發(fā)性物質(zhì)種類與面包3-B相似但是濃度較低；面包1-B風味物質(zhì)種類最少，共43種不同化合物，而且濃度較低。

圖6 三種面包風味指紋圖譜Fig.6 Flavor fingerprint of three kinds of bread

A、B、C和D區(qū)域代表1-B、2-B和 3-B面包特征揮發(fā)性物質(zhì)。A區(qū)域物質(zhì)有異戊醇和壬酮等；B區(qū)域物質(zhì)有3-甲基丁醛、2-甲基丁醛和戊醛等；C區(qū)域物質(zhì)主要有2-甲基-1-丙醇、2，3-丁二酮、己醇、戊醇、己醛、庚酮、E-2-庚醛、苯甲醛和己酸乙酯等；D區(qū)域物質(zhì)有庚醛、乙偶姻、2-戊基呋喃、E-2-辛醛、壬醛、E-2-壬醛、E-2-己醛和E-2-戊醛等。酵母菌發(fā)酵小麥粉面包的風味物質(zhì)主要存在于A區(qū)；單一酵母菌發(fā)酵多谷物雜糧面包的風味物質(zhì)主要存在于B區(qū)和C區(qū)；酵母菌復合乳酸菌發(fā)酵多谷物雜糧面包的風味物質(zhì)主要存在于C區(qū)和D區(qū)，其中醛、酮、醇含量豐富，酮類物質(zhì)大部分都含有特殊的香氣，醇類物質(zhì)具有植物香、芳香等氣味，在面包風味中起著重要作用，醛也是美拉德反應的重要產(chǎn)物[22]?？傊N面包揮發(fā)性物質(zhì)種類和濃度不同，雜糧粉的添加極大豐富了面包的風味，而且由于乳酸菌參與碳水化合物代謝、蛋白質(zhì)水解、脂肪分解和代謝產(chǎn)生多種風味物質(zhì)[23]，使酵母菌聯(lián)合乳酸菌發(fā)酵的面包香氣更加濃郁。

通過聚類分析三種面包風味物質(zhì)差異性，結(jié)果見圖7。三種面包均被很好地分離開，尤其1-B與其他兩種面包距離較遠，區(qū)分度較大，2-B和3-B較為接近。該結(jié)果說明，三種面包風味存在較大差異，由于原料不同，導致小麥粉面包與多谷物復配雜糧面包的風味差別較大；在原料一致時，酵母菌聯(lián)合乳酸菌發(fā)酵與單一酵母菌發(fā)酵的多谷物雜糧面包在風味上也存在一定差異。

圖7 三種面包指紋圖譜相似度分析Fig.7 Cluster analysis of the flavor fingerprint of three kinds of bread

3 結(jié)論

添加乳酸菌粉降低了多谷物復配雜糧面團的pH，增大了面團發(fā)酵體積，對面團的硬度和韌性具有一定影響；適量添加乳酸菌粉（添加量0.06%），多谷物雜糧面包的硬度、膠粘性和咀嚼性指標顯著降低（P＜0.05），彈性顯著增加（P＜0.05），大大改善了面包的質(zhì)構(gòu)特性。乳酸菌粉添加量為0.06%時，雜糧面包具有較大的比容，面包的形態(tài)、色澤、質(zhì)地、紋理、風味和口感特性較好，綜合感官評分也最高。通過風味指紋圖譜分析，酵母菌聯(lián)合乳酸菌發(fā)酵多谷物復配雜糧面包（3-B）的揮發(fā)性有機物質(zhì)種類豐富，而且風味物質(zhì)濃度較高，產(chǎn)品風味更加濃郁?？傊?，適量添加乳酸菌對酵母菌發(fā)酵多谷物復配雜糧面包品質(zhì)改善具有積極作用，該研究結(jié)果為下一步開展功能型雜糧面包產(chǎn)品研發(fā)和深入研究提供了依據(jù)。