樺褐孔菌乙酸乙酯萃取物對朊病毒復制的抑制作用

王 琳，姚 強，楊 微，陳 嘉，胡 超，夏 影，陳志寶 ，陳 操,6,7,

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學生命科學技術學院，黑龍江大慶 163000；2.廣東海洋大學深圳研究院，廣東深圳 518108；3.中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所，北京 102206；4.中國動物疫病預防控制中心，北京 100125；5.傳染病預防控制國家重點實驗室，北京 102206；6.中國科學院生物安全大科學研究中心，湖北武漢 430071；7.衛(wèi)生部醫(yī)學病毒和病毒病重點實驗室，北京 102206）

朊病毒?。≒rion Disease）又稱為傳染性海綿狀腦?。═SEs）是由朊病毒引起的一類影響人類及多種動物的致死性神經(jīng)退行性疾病[1-2]。這些神經(jīng)退行性疾病還包括致死性家族性失眠癥（FFI）、吉斯特曼-斯特勞斯綜合征（GSS）、庫魯?。↘uru）、克雅氏?。–JD）以及羊瘙癢?。⊿crapie）、瘋牛?。˙SE）等[3]。感染朊病毒后宿主通常以死亡轉歸，目前臨床上還未見有效治療朊病毒病的特效藥[4]。

樺褐孔菌（Inonotus obliquus）是一種白色寄生真菌，主要分布在 45°N～50°N 緯度的國家和地區(qū)[5]，有“樺木天鵝絨”[6]和“西伯利亞靈芝”[5]之稱。樺褐孔菌通常寄生在樺樹上，具有燒焦木炭的外觀[7]。這種真菌長期暴露在季節(jié)性極低的環(huán)境溫度下生長十分緩慢，并在生長多年后形成直徑25～40 cm的瘤狀菌核，呈黃褐色至黑色，含有豐富的維生素、礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)、高纖維以及碳水化合物[8]。研究表明樺褐孔菌的藥理學活性是藥物作用的基礎，它具有抗氧化[9]、抗菌[10]、抗炎[11]、抗過敏[12]、抗疲勞[13]、抗腫瘤[14]等作用以及免疫調(diào)節(jié)功能[15]。因其具有較強的醫(yī)療保健價值，故在俄羅斯、中國和日本樺褐孔菌也被用作食品、營養(yǎng)食品和傳統(tǒng)草藥使用，從而預防和治療各種疾病，如胃腸道疾病、糖尿病、結核病和心血管疾病[7,16]。

本課題組前期研究結果顯示，樺褐孔菌乙醇粗提物通過其抗氧化活性對朊病毒的復制產(chǎn)生抑制作用[17]。在前期研究基礎上，本文進一步比較了樺褐孔菌醇提物的不同極性部位萃取物對朊病毒復制的抑制作用，并對其抗氧化活性及作用機制進行研究，為篩選有效抑制朊病毒復制的藥物和深層次挖掘樺褐孔菌的藥用價值提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

細胞株朊病毒Chandler株持續(xù)感染的SMB-S15細胞系 英國羅斯林研究所；CCK-8活細胞檢測試劑盒（CK04-500） 日本DOJINDO公司；DCFDA細胞活性氧檢測試劑盒（ab113851） 英國Abcam公司；過氧化氫檢測試劑盒（S0038）、超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測試劑盒（S0103）、總谷胱甘肽檢測試劑盒（S0052）、SDS-PAGE 試劑盒（P0012A） 中國Beyotime 公司；蛋白酶K（Proteinase K）（1245680100）德國Merck公司；ECL顯影液（EL105001EA）美國 Perkin-Elmer公司；PrP 抗體（6D11）（sc-58581）美國 Santa Cruz公司；β-actin 抗體（TA-09） 中國 ZSGB-Bio公司；HO-1抗體（66743-1-Ig）、GCLC抗體（12601-1-AP） 美國 Proteintech公司；Goat Anti-Mouse IgG（H+L）二抗（115-035-003） 美國Jackson Immuno Research公司。

371高溫滅菌CO2細胞培養(yǎng)箱（配有HEPA過濾器和高溫干熱滅菌技術）、D11971超純水器（配有超濾柱和雙波長紫外燈氧化技術) 美國Thermo Scientific公司；DYY-6C穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、DYCP-40C半干式電轉儀 北京六一生物科技有限公司；EnSpire多功能酶標儀（配有高精度四光柵模塊和超敏感化學發(fā)光檢測技術）、Operetta CLS高通量高內(nèi)涵活細胞共聚焦（配有高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)） 美國PerkinElmer公司；6000化學發(fā)光成像儀 中國上海勤翔科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樺褐孔菌二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物提取 參考師苑等[18]的方法，將塊狀的樺褐孔菌子實體粉碎，60 ℃熱風干燥至恒重，用75%濃度乙醇浸泡提取3次，經(jīng)減壓濃縮得乙醇浸提物。用水將乙醇提取物分散成懸濁液，依次用有機溶劑二氯甲烷（98.5%）、乙酸乙酯（98%）和正丁醇（99.8%）分別萃取，濃縮得二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物。

1.2.2 供試樣品的制備與處理 稱量干燥的二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物及正丁醇萃取物粉末，在無菌條件下，以二甲基亞砜（DMSO）為溶劑，制備成10 mg/mL母液，并過0.22 μm微孔濾膜過濾，分裝后放置于暗處留存。

1.2.3 SMB-S15細胞培養(yǎng)及藥物處理 細胞培養(yǎng)：使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，將細胞瓶按十字形搖晃，水平置于33℃，含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞培養(yǎng)密度至80%左右時，依照1:2～1:5的比例傳代。

細胞加藥處理：細胞傳代后過夜培養(yǎng)，待貼壁后，更換含有溶劑或藥物的培養(yǎng)基，空白對照組不作處理，溶劑組添加0.1%濃度的DMSO作為對照，藥物組添加不同濃度的二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物，處理后繼續(xù)培養(yǎng)細胞不同時間點并進行Western blot及相關試劑盒檢測。

1.2.4 CCK-8法檢測細胞活性 按照1.2.3項下條件培養(yǎng)細胞，接種細胞懸液于96孔細胞培養(yǎng)板中，過夜貼壁后，加入不同濃度藥物并設置實驗孔及空白孔，繼續(xù)培養(yǎng)細胞1、3 d[19]，參照試劑盒說明書中方法進行后續(xù)檢測。

1.2.5 DCFDA法檢測細胞內(nèi)活性氧 按照1.2.3項下條件培養(yǎng)細胞，接種細胞懸液于96孔板中，藥物處理后繼續(xù)培養(yǎng)細胞3 d，棄掉96孔板中培養(yǎng)基，加入終濃度為20 μmol/L的DCFDA溶液，37 ℃避光孵育30 min，PBS洗兩次，用Operetta高內(nèi)涵細胞成像系統(tǒng)觀察細胞內(nèi)活性氧熒光強度。

1.2.6 SMB-S15細胞裂解液制備 棄去細胞培養(yǎng)液，加入0.025%胰蛋白酶消化細胞，消化完畢后棄胰酶，使用PBS吹下細胞，將獲得的細胞懸液收集至1.5 mL離心管，1000 r/min離心5 min，棄上清，收集細胞沉淀，加入細胞裂解液RIPA以及蛋白酶抑制劑，冰上裂解30 min，5000 r/min離心3 min，小心收集上清，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 Western blot檢測 取5×蛋白上樣緩沖液加入已制備好的細胞裂解液中，使終濃度為1×，置于沸水浴中煮樣5～10 min，變性后進行SDS-PAGE電泳，利用半干式電轉至NC膜，室溫封閉2 h，再分別與 PrP（1:1000稀釋）、β-actin（1:2000稀釋）、HO-1（1:1000 稀釋）、GCLC（1:10000 稀釋），4 ℃ 孵育過夜。漂洗3次×10 min，然后與相應的HRP標記羊抗鼠（1: 5000稀釋）IgG抗體室溫孵育2 h，漂洗3次，使用化學發(fā)光液顯色，數(shù)據(jù)采集儀自動曝光[20]。

細胞PK消化：使用終濃度20 μg/mL的PK酶處理細胞裂解液，37 ℃水浴消化1 h后參照上述方法進行PrP特異性Western blot測定。

1.2.8 過氧化氫水平測定 參照1.2.6項下方法收集細胞沉淀至1.5 mL離心管，加入過氧化氫檢測裂解液，隨后充分勻漿以破碎并裂解細胞，4 ℃約12000×g 離心 3～5 min，取上清[21]，遵循試劑盒說明書進行檢測，最終計算出樣品中過氧化氫濃度。

1.2.9 超氧化物歧化酶活性檢測 按照Luo等[22]的方法，使用WST-8法進行測定。收集細胞樣品，用4 ℃的PBS或生理鹽水洗滌1～2遍。沉淀用預冷的PBS在4 ℃進行勻漿，勻漿液4 ℃離心，取上清作為待測樣品。取96孔板每孔加入20 μL樣品，并設定空白對照孔1、2、3，依次加入SOD檢測緩沖液、WST-8/酶工作液以及反應啟動工作液，37 ℃孵育30 min，使用酶標儀450 nm處測定吸光度值。WST-8可以和黃嘌呤氧化酶催化產(chǎn)生的超氧化物陰離子反應產(chǎn)生水溶性的甲臜染料，該反應步驟可以被SOD所抑制，故通過對抑制百分率的分析即可進一步計算SOD酶活力。抑制百分率計算公式如下：

式中：A空白對照1表示不加入樣品空白對照組吸光度；A空白對照2表示不加入樣品和反應啟動工作液空白對照組吸光度；A空白對照3表示加入樣品但不加入反應啟動工作液空白對照組吸光度。

SOD酶活力單位的定義：按照此檢測方法，當反應體系抑制百分率為50%時，SOD酶活力定義為一個酶活力單位（unit）。SOD酶活力按如下公式計算：

1.2.10 總谷胱甘肽水平檢測 參照1.2.6項下方法收集新鮮的細胞，加入細胞沉淀體積3倍量的蛋白去除試劑S溶液，利用-20 ℃冰箱和37 ℃水浴對樣品進行兩次快速的凍融，4 ℃，10000×g離心10 min，取上清作為待測樣品[23]。按照試劑盒說明書對總谷胱甘肽的含量（μmol/L）進行測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Image J軟件對免疫印跡圖像進行灰度分析，利用Columbus軟件對活性氧熒光強度結果進行定量分析，利用T檢驗比較兩組間差異。P＜0.05認為有統(tǒng)計學意義，*代表P＜0.05，**代表P＜0.01，***代表P＜0.001。

2 結果與分析

2.1 SMB-S15細胞系的鑒定

朊病毒病的致病因子為PrPSc，它具有抗蛋白酶消化的能力[24-25]。為評估SMB-S15細胞中是否存在PrPSc，對細胞進行PrP特異性Western blot測定。實驗結果（圖1）顯示，SMB-S15細胞中存在PrP特異性條帶，說明該細胞中存在大量具有蛋白酶抗性的PrPSc。本實驗結果表明SMB-S15細胞模型有效，可用于后續(xù)研究。

圖1 SMB-S15細胞PK酶處理前后PrP特異性條帶Fig.1 PrP-specific bands before and after PK treatment with SMB-S15 cells

2.2 樺褐孔菌二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物以及正丁醇萃取物的細胞毒性評價

研究顯示，樺褐孔菌水提物和醇提物均具有不同程度的毒性[26]，為確定二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物以及正丁醇萃取物處理SMB-S15細胞的最大安全濃度和最佳作用時間，本研究采用CCK-8法對幾種萃取物的細胞毒性進行評價。結果顯示，不同濃度的萃取物作用于SMB-S15細胞1 d和3 d后，與對照組相比，給藥組的細胞生存率均隨著濃度的增加而降低。且二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物以及正丁醇萃取物濃度為0.1×2-8mg/mL時，其在1 d和3 d相應的細胞存活率分別為94.67%、93.67%，90.33%、92.00%和96.33%、90.67%，且與對照組相比，細胞存活率無統(tǒng)計學差異（圖2 A，B，C）。綜上所述，幾種萃取物的最大安全濃度范圍為0.1×2-14～0.1×2-8mg/mL。

圖2 樺褐孔菌二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物細胞毒性評價Fig.2 Evaluation of the cytotoxicity of dichloromethane extracts, ethyl acetate extracts, n-butanol extracts from Inonotus obliquus

2.3 樺褐孔菌二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物以及正丁醇萃取物對朊病毒復制的影響

前期研究表明，樺褐孔菌醇提物具有抑制朊病毒復制的作用效果[17]。為繼續(xù)探究幾種萃取物對SMB-S15細胞內(nèi)朊病毒復制的影響，選取安全范圍內(nèi)的藥物處理濃度作用細胞1 d和3 d，并對處理后的SMB-S15細胞進行PK后的PrP特異性Western blot檢測。由圖3實驗結果顯示，在二氯甲烷萃取物和正丁醇萃取物分別處理1 d和3 d時，不同藥物處理濃度下的PrPSc水平?jīng)]有顯著差異；乙酸乙酯萃取物處理1 d后細胞內(nèi)的PrPSc水平?jīng)]有顯著差異，而使用乙酸乙酯萃取物連續(xù)處理3 d時，SMB-S15細胞內(nèi)的PrPSc水平略有變化，與空白對照組相比，有一定的下降趨勢。定量分析結果顯示，0.1×2-8mg/mL的乙酸乙酯萃取物連續(xù)處理3 d后PrPSc信號的平均灰度值與未處理組相比具有統(tǒng)計學顯著差異（P＜0.01，圖3 B）。上述實驗結果表明，乙酸乙酯萃取物具有抑制SMB-S15細胞中朊病毒復制的能力。

圖3 樺褐孔菌二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物對細胞模型中朊病毒復制的影響Fig.3 Inhibition of prion replication in cell model by dichloromethane extracts, ethyl acetate extracts,n-butanol extracts from Inonotus obliquus

2.4 樺褐孔菌乙酸乙酯萃取物的活性氧和過氧化氫水平分析

以往的研究結果證實在朊病毒感染SMBS15細胞中活性氧水平顯著上調(diào)[27]。為評價樺褐孔菌乙酸乙酯萃取物的抗氧化活性，使用藥物處理SMB-S15細胞3 d，利用DCFDA熒光探針檢測細胞內(nèi)活性氧水平。實驗結果表明，SMB-S15細胞中活性氧熒光信號強度呈下調(diào)趨勢，且呈顯著的劑量依賴性（圖4A）。在 0.1×2-10mg/mL（P＜0.05，圖4B）和0.1×2-8mg/mL（P＜0.01，圖4B）藥物濃度下與未處理組相比，活性氧水平有統(tǒng)計學差異；進一步探究了乙酸乙酯萃取物處理3 d后細胞內(nèi)的過氧化氫水平。結果顯示0.1×2-8mg/mL乙酸乙酯萃取物的過氧化氫水平顯著降低，且與對照組相比具有統(tǒng)計學顯著差異（P＜0.01，圖4C）。以上結果表明樺褐孔菌乙酸乙酯萃取物可能通過降低活性氧水平來緩解氧化應激，具有較強的抗氧化活性。

圖4 樺褐孔菌乙酸乙酯萃取物處理SMB-S15細胞后活性氧和過氧化氫水平Fig.4 Levels of ROS and H2O2 in SMB-S15 cells treated with ethyl acetate extracts from Inonotus obliquus

2.5 樺褐孔菌乙酸乙酯萃取物相關抗氧化信號通路探究

研究顯示，樺褐孔菌多糖提取物可通過介導Nrf2信號通路調(diào)節(jié)氧化應激，對抗L-Glu損傷的HT22細胞和APP/PS1小鼠中阿爾茲海默?。ˋlzheimer's Disease，AD）的疾病進程[28]。另有研究顯示，樺褐孔菌提取物能夠清除活性氧活性，抑制過氧化氫誘導的細胞凋亡以及過氧化氫或紫外線誘導的早衰[29]。為探究乙酸乙酯萃取物是否通過激活Nrf2信號通路抵抗氧化應激，使用乙酸乙酯萃取物處理SMB-S15細胞3 d，分析血紅素加氧酶（HO-1）和谷胱甘肽合成酶催化亞基（GCLC）相關抗氧化蛋白水平變化。結果顯示與對照組相比，HO-1和GCLC水平在乙酸乙酯萃取物濃度為0.1×2-8mg/mL時增加，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05，圖5B）；超氧化物歧化酶（SOD）對調(diào)節(jié)細胞內(nèi)環(huán)境和維持穩(wěn)定正常的細胞功能非常重要，是強大的抗氧化酶。使用乙酸乙酯萃取物處理SMBS15細胞3 d后，細胞內(nèi)SOD活性呈劑量依賴性增加，與對照組相比藥物濃度在0.1×2-10mg/mL和0.1×2-8mg/mL 時具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05，圖5C）；谷胱甘肽作為細胞中主要的可溶性抗氧化劑，也是一些解毒酶的輔助因子。同時，在乙酸乙酯萃取物處理3 d后，總谷胱甘肽水平也增加，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05，圖5D）。以上結果表明，樺褐孔菌乙酸乙酯萃取物通過激活Nrf2信號通路增加相關抗氧化蛋白表達并上調(diào)SOD和總谷胱甘肽水平抵抗氧化應激。

圖5 樺褐孔菌乙酸乙酯萃取物處理SMB-S15細胞后抗氧化因子水平檢測Fig.5 Levels of antioxidant factors in SMB-S15 cells treated with ethyl acetate extracts from Inonotus obliquus

3 討論與結論

朊病毒病在全世界的發(fā)病率約為百萬分之一，盡管罕見，每年仍有成千上萬人死于此類疾病，因此尋求一種安全、有效的抗朊病毒的化合物或疫苗是十分必要的。朊病毒病的發(fā)病機制與主要在腦中表達的正常朊蛋白PrPC轉化為異常朊蛋白PrPSc有關，由于這種轉化是朊病毒病發(fā)生發(fā)展的主要觸發(fā)事件，因此抑制轉化是一種主要的治療策略[30-31]。本文的數(shù)據(jù)顯示，一定濃度的乙酸乙酯萃取物處理降低了朊病毒感染細胞內(nèi)PrPSc水平，同時氧化應激也得以緩解。

氧化應激（Oxidative stress）是細胞在受到內(nèi)源或外源性刺激后短時間內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧（Reactive oxygen species, ROS），破壞細胞內(nèi)環(huán)境平衡，并最終導致機體發(fā)生氧化損傷的過程[32]。過氧化氫是一種在生物體內(nèi)發(fā)揮廣泛生物介質(zhì)作用的活性氧代表化合物。乙酸乙酯萃取物處理后顯著降低的活性氧和過氧化氫水平表明了該化合物具有抗氧化活性。HO-1是受Nrf2信號通路轉錄調(diào)節(jié)的抗氧化蛋白，可與血紅素降解產(chǎn)物共同發(fā)揮抗氧化的防御作用[33]。GCLC能夠促進體內(nèi)谷胱甘肽的合成，增強機體內(nèi)的抗氧化能力。SOD作為生物體中天然存在的超氧自由基清除者，可將超氧自由基轉化為H2O2。本實驗使用乙酸乙酯萃取物處理SMB-S15細胞后，通過檢測到HO-1和GCLC等Nrf2下游抗氧化因子水平的顯著升高，以及細胞內(nèi)總谷胱甘肽和超氧化物歧化酶活性的上調(diào)，揭示了乙酸乙酯萃取物在激活細胞防御系統(tǒng)，抵抗朊病毒感染細胞中氧化應激的作用。

綜上所述，樺褐孔菌乙酸乙酯萃取物具有抑制朊病毒復制作用，其作用機制可能與激活Nrf2信號通路有關，這可能為朊病毒病提供新的研究靶點和治療方法。但朊病毒病致病機理較為復雜，樺褐孔菌作為一種功能性食品或藥物，在抑制朊病毒復制的作用機制方面還值得進一步的研究。