變質(zhì)原料乳中假單胞菌的分離鑒定及產(chǎn)蛋白酶特性研究

胡少震，李蓮瑞

1 塔里木大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300

2 塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300

3 塔里木畜牧科技兵團(tuán)重點(diǎn)試驗(yàn)室，新疆阿拉爾 843300

關(guān)鍵字：變質(zhì)原料乳；假單胞菌；分離鑒定；蛋白酶活力

0 引言

原料乳是各種乳制品的基本原料，其質(zhì)量是保證乳制品安全的關(guān)鍵因素[1]。原料乳中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是天然的微生物培養(yǎng)基，極適合微生物的生長(zhǎng)繁殖[2]。隨著冷鏈技術(shù)在食品運(yùn)輸中的廣泛應(yīng)用，嗜熱鏈球菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌等一些嗜溫、嗜熱微生物生長(zhǎng)受到抑制，而具有嗜冷特性的細(xì)菌可以在低溫下繼續(xù)生長(zhǎng)，成為原料乳中的優(yōu)勢(shì)菌[3]，該菌可通過在MPC瓊脂板上6.5 ℃培養(yǎng)10 d進(jìn)行靶向分離。假單胞菌作為原料乳的主要污染嗜冷菌，80%的假單胞都攜帶aprX基因位點(diǎn)[4]，該基因可以表達(dá)胞外金屬蛋白酶，這些酶具有熱不敏感性，即使通過135 ℃ 1 min熱處理，酶殘留率仍超過20%以上[5]，這些殘留的蛋白酶會(huì)導(dǎo)致乳制品在貨架期出現(xiàn)乳樣變酸、乳清析出、蛋白聚集、脂肪上浮等不良現(xiàn)象，嚴(yán)重破壞乳品品質(zhì)，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[6]。本研究通過對(duì)變質(zhì)原料乳中嗜冷微生物分離鑒定，明確造成原料乳發(fā)生質(zhì)量問題的關(guān)鍵微生物，并測(cè)定了其蛋白酶活力，對(duì)原料乳的變質(zhì)機(jī)理提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 試劑和設(shè)備

1.1.1 試劑

異常原料乳樣品：出現(xiàn)蛋白水解、脂肪上浮、變酸等現(xiàn)象，用于污染菌株的分離鑒定，由廣東省恒遠(yuǎn)市規(guī)模化牧場(chǎng)提供。

培養(yǎng)基：MPC瓊脂培養(yǎng)基，北京依珊匯通科技有限公司；LB液體培養(yǎng)基、脫脂乳瓊脂培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

試劑：蛋白胨鹽溶液，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒、Lysozyme （50 mg/mL）、Trans2K? Plus II DNA Marker、2x Taq PCR Master Mix，天根生化科技（北京）有限公司；瓊脂糖、GeneGreen核酸染料，金連寶生物技術(shù)（北京）有限公司；PBS 緩沖液（50 mmol/L）、溴酚藍(lán)、β-巰基乙醇、2x Laemmli Sample Buffer、甲醇、冰醋酸、考馬斯亮藍(lán)有R-250，北京廣達(dá)恒益科技有限公司；偶氮酪蛋白，上海源葉生物科技有限公司；SurePAGE， Bis-Tris， 10%， 10 wells、Tris-MOPS-SDS Running Buffer Powder，南京金斯瑞生物科技有限公司。

偶氮酪蛋白（15 g/L）：取0.15 g偶氮酪蛋白用10 mL無菌水定容。

考馬斯亮藍(lán)溶液：稱取0.125 g考馬斯亮藍(lán)R-250溶于dd H2O中，加入30 mL甲醇，10 mL冰醋酸，最后加ddH2O定容至100 mL。

脫色液：甲醇30 mL，冰乙酸10 mL，加dd H2O至100 mL。

1.1.2 設(shè)備

超凈工作臺(tái)，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海恒科技有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；水浴鍋，寧波新芝科技有限公司；ABI 9700 PCR儀，ThermoFisher公司；高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，北京維根技術(shù)有限公司；TACAN全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，帝肯（上海）貿(mào)易有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原料乳中蛋白質(zhì)的水解測(cè)定

通過SDS-PAGE凝膠電泳對(duì)原料乳中蛋白質(zhì)水解進(jìn)行測(cè)定[7]，具體方法如下：

樣品準(zhǔn)備：（1）a液：原料乳與去離子水按照1∶15混合為樣品處理液（a液）。（2）b液：溴酚藍(lán)與β-巰基乙醇按照1∶1混合。（3）c液：b液與2x Laemmli Sample Buffer 按照1∶1混合。（4） d液：c液與樣品處理液（a液）各取20 μL混合。（5）將上述d液于水浴鍋中100 ℃加熱5 min，備用。

電泳：將加熱處理后的d液用移液槍吸取10 μL在SurePAGE， Bis-Tris，10%，10 wells中進(jìn)行點(diǎn)樣，點(diǎn)樣后放置在Tris-MOPS-SDS Running Buffer Powder中110 V電泳30 min。

染色，洗脫：使用Coomassie亮藍(lán)溶液對(duì)凝膠進(jìn)行染色1 h，脫色液過夜脫色。

1.2.2 原料乳中假單胞的分離純化鑒定

樣品處理：為保證平板上長(zhǎng)出單一菌落，將變質(zhì)原料乳按10倍梯度連續(xù)稀釋3 次，將稀釋后樣品均勻涂布在MPC瓊脂板培養(yǎng)基上，6.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 d。

分離純化：將大小形態(tài)不一樣的單菌落于營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)48 h，連續(xù)培養(yǎng)兩代，對(duì)分離的細(xì)菌進(jìn)行制片，革蘭氏染色，觀察其形態(tài)。此外，把生長(zhǎng)為對(duì)數(shù)期的菌株用25%（v/v）的甘油保存至-20 ℃冰箱。

DNA提取：按照細(xì)菌基因組提取試劑盒說明書提取培養(yǎng)細(xì)菌的DNA，放置-20 ℃冰箱保存。

P C R擴(kuò)增：利用上述提取的基因組作為模板，1 6 S r D N A通用引物（2 7 F：5' - AGAGTTGATCCTGGCTCAG - 3' 和 1492R： 5' - CGGTACCTTGTTACGACTT - 3'）進(jìn)行細(xì)菌16S rDNA全長(zhǎng)的擴(kuò)增。擴(kuò)增體系和條件如表1、圖1所示，擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技有限公司測(cè)序。

圖1 PCR擴(kuò)增條件

表1 PCR擴(kuò)增體系

序列比對(duì)：將測(cè)序序列進(jìn)行拼接，完整的16S rDNA序列在NCBI上進(jìn)行核苷酸序列比對(duì)，確定該菌的種屬。

1.2.3 蛋白酶活力檢測(cè)

本試驗(yàn)分別采用10%的脫脂奶粉平板對(duì)菌液中蛋白酶進(jìn)行可視化檢測(cè)，偶氮酪蛋白法對(duì)菌液中蛋白酶活力進(jìn)行定性檢測(cè)[8]。

蛋白酶的可視化檢測(cè)：（1）菌株的活化：將甘油保存的菌株接種至LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)24 h，傳代兩次。（2）脫脂乳平板的配置：稱取10 g脫脂奶粉，1.5 g瓊脂粉于錐形瓶中加去離子水至100 mL，115 ℃滅菌10 min，倒平板備用。（3）菌液的接種：滅菌的牛津杯放置平板中，吸取200 μL菌液接種牛津杯中，將平板放入28 ℃培養(yǎng)箱中24 h，觀察其水解圈。

蛋白酶殘留率測(cè)定：（1）將活化后菌液經(jīng)135 ℃加熱5 s，熱處理后立即冰浴，用于蛋白酶耐熱性研究，對(duì)照組為未熱處理的菌液。（2）各取100 μL熱處理菌液和未處理菌液于2 mL無菌離心管中。（3）分別加入500 μL PBS 緩沖液（50 mmol/L），100 μL偶氮酪蛋白溶液（15 g/L）振蕩混勻，37 ℃反應(yīng)60 min。（4）加入500 μL TCA（0.2 g/mL）室溫下靜置 30 min終止反應(yīng)后。（5）將終止反應(yīng)液于10 000 r/min、4 ℃條件下離心5 min。（6）取100 μL上清至96孔板中，對(duì)照組采用100 μL無菌 PBS代替上清液，在366 nm下將96孔板于酶標(biāo)儀中測(cè)定吸光值。

蛋白酶耐熱性以酶活殘余率表示，酶活殘余率（RA）按照下述公式進(jìn)行計(jì)算：

其中，RA：酶活殘余率（%）；HA：熱處理后蛋白酶活力（ΔΑ/h·mL）；IA：未處理初始蛋白酶活力（ΔΑ/h·mL）；蛋白酶活以每毫升的粗酶液每小時(shí)吸光度的增加值表示（ΔΑ/h·mL）。

2 結(jié)果與分析

2.1 變質(zhì)原料乳中蛋白質(zhì)的水解測(cè)定

通過SDS-PAGE凝膠電泳對(duì)變質(zhì)原料乳中的蛋白進(jìn)行表征，結(jié)果如圖2所示。其中，變質(zhì)原料乳的乳鐵蛋白、血清白蛋白無電泳條帶，κ-酪蛋白電泳條帶極其淺，ɑ-酪蛋白、β-酪蛋白、β-乳白蛋白、ɑ-乳白蛋白有較清晰的電泳條帶。結(jié)果表明乳鐵蛋白、血清白蛋白已經(jīng)完全被水解，K-酪蛋白、β-乳白蛋白、ɑ-乳白蛋白有部分被水解，說明原料乳中微生物產(chǎn)生的蛋白酶較復(fù)雜，含有多個(gè)蛋白的識(shí)別位點(diǎn)，可將多種蛋白質(zhì)水解成多種氨基酸小分子物質(zhì)[9]。

圖2 原料乳蛋白質(zhì)水解圖

2.2 分離、純化、染色結(jié)果

將原料乳進(jìn)行梯度稀釋后，6.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，結(jié)果如圖3所示。菌落比較單一，菌落形態(tài)為白色、表面光滑、隆起、有光澤、不透明。挑取兩株菌（S1、S2）28 ℃培養(yǎng)24 h，傳代兩次革蘭氏染色如圖4，該菌株為革蘭氏陰性菌、形狀為短桿狀。

圖3 菌落形態(tài)

圖4 革蘭氏染色結(jié)果

2.3 分離純化的菌株16S rDNA 擴(kuò)增結(jié)果

提取分離菌株的DNA，用細(xì)菌通用引物16S rDNA對(duì)其擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖5。該菌的16S rDNA 基因大小約為1 500 bp，與預(yù)期大小相符，送至北京六合華大基因科技有限公司測(cè)序。

圖5 電泳結(jié)果

2.4 分離菌株的鑒定結(jié)果

將測(cè)序序列在NCBI上進(jìn)行核苷酸序列比對(duì)，判定分離菌株的物種，比對(duì)結(jié)果見表2，兩株分離菌株均為霍氏假單胞菌。通過對(duì)提交的序列進(jìn)行進(jìn)化樹的繪制，如圖6所示。該菌株與登陸號(hào)為NR_024911.1霍氏假單胞菌序列相似度為100%，可以確定這兩株分離菌株為霍氏假單胞菌。

表2 兩株菌BLAST結(jié)果

圖6 分離菌株的進(jìn)化樹

2.5 蛋白酶活力檢測(cè)結(jié)果

圖7為霍氏假單胞菌的可視化鑒定結(jié)果，該菌株的水解圈為（15.35±0.56）mm。通過135 ℃加熱5 s后，蛋白酶殘留率為43.63%，說明該菌產(chǎn)生的蛋白酶即使經(jīng)過高溫鈍化仍保持較高的酶活力，它的存在會(huì)水解乳中的蛋白質(zhì)，造成一定的質(zhì)量問題，因此應(yīng)該加大對(duì)該菌的防控。

圖7 蛋白酶對(duì)脫脂乳的水解圈

3 討論

隨著冷鏈技術(shù)在食品領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，嗜溫微生物生長(zhǎng)受到抑制。嗜冷菌在長(zhǎng)期進(jìn)化中通過膜蛋白的磷酸化、去磷酸化等體內(nèi)的一切復(fù)雜代謝反應(yīng)完成對(duì)溫度的感知，減少冷休克蛋白生產(chǎn)，防止非必要的蛋白生成，可以在低溫下生長(zhǎng)，成為原料乳的優(yōu)勢(shì)菌[10]。目前，已有人從低溫冷藏的原料乳中鑒定出隸屬于61 個(gè)屬169 個(gè)種的分離株，其中假單胞菌為主要的嗜冷菌[11]。它可以分泌一些胞外蛋白酶，這些酶具有熱不敏感性，即使通過高溫處理仍有較高的酶殘留率，會(huì)對(duì)長(zhǎng)期保存的乳及乳制品持續(xù)破壞，出現(xiàn)凝膠、沉淀、苦味或酸味等現(xiàn)象[12]。

原料乳隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，假單胞菌的豐度不斷升高。大多數(shù)假單胞菌的存在會(huì)產(chǎn)生水解原料乳的蛋白酶，且該菌株的總數(shù)和蛋白酶活力呈現(xiàn)正相關(guān)[13]。徐煜等[14]對(duì)原料乳中嗜冷菌進(jìn)行分離鑒定及蛋白酶活力檢測(cè)，結(jié)果顯示，在分離到的假單胞菌中，66.67%（36/54）假單胞菌都能產(chǎn)生胞外蛋白酶，并且所產(chǎn)的蛋白酶都有一定的耐熱能力，將分離鑒定的假單胞菌按照濃度為103CFU/mL接種到脫脂奶中，6 ℃培養(yǎng)5 d就能使脫脂乳溶液產(chǎn)生沉淀。本試驗(yàn)結(jié)果與前人相似，變質(zhì)原料乳中分離到的微生物為霍氏假單胞菌，并且該菌有較強(qiáng)的蛋白水解能力。因此，原料乳變質(zhì)的原因可能是該菌產(chǎn)生的胞外蛋白酶分解乳中的蛋白質(zhì)，從而使原料乳出現(xiàn)蛋白水解現(xiàn)象。牧場(chǎng)應(yīng)加大對(duì)假單胞菌的防范措施。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過對(duì)變質(zhì)原料乳中的微生物進(jìn)行分離、純化、鑒定，發(fā)現(xiàn)可能引發(fā)原料乳變質(zhì)的細(xì)菌為霍氏假單胞菌，并且該菌有較強(qiáng)的蛋白水解能力。