陳化烤煙葉片不同發(fā)酵時間微生物多樣性及代謝組分析

張文友，顏朗，賴先軍*，段旺軍，張義正

陳化烤煙葉片不同發(fā)酵時間微生物多樣性及代謝組分析

張文友1，顏朗1，賴先軍1*，段旺軍2，張義正3

1 西昌學(xué)院農(nóng)業(yè)科學(xué)學(xué)院，攀西特色作物研究與利用四川省重點實驗室，四川省西昌市安寧鎮(zhèn)學(xué)府路1號 615013；2 四川中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，成都市龍泉驛區(qū)國家成都經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)成龍大道龍泉段2號 610066；3 四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，分子生物學(xué)及生物技術(shù)四川省重點實驗室，四川省成都市一環(huán)路南一段24號 610064

【目的】了解不同陳化發(fā)酵時間煙葉中微生物菌群與代謝產(chǎn)物的關(guān)系，探究多年陳化發(fā)酵過程中微生物對煙葉發(fā)酵品質(zhì)的影響?！痉椒ā窟x取4個陳化發(fā)酵時間（陳化0年，1年，4年，7年）的上部煙葉（B2F），采用Illumina高通量測序技術(shù)和UPLC-ATOF MS液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，對不同發(fā)酵時間的煙葉表面微生物多樣性以及差異代謝物進(jìn)行分析。【結(jié)果】相比其他陳化發(fā)酵時間，發(fā)酵4年的煙葉中微生物種類最多、多樣性最高。在細(xì)菌屬分類水平上，泛菌屬（）和假單胞菌屬（）為發(fā)酵4年煙葉的優(yōu)勢細(xì)菌。結(jié)合OPLS-DA模型以及數(shù)據(jù)庫檢索，4個發(fā)酵時期兩兩比較共篩選到173個顯著差異代謝物，KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)差異代謝物參與氨基酸代謝、脂肪酸代謝、類固醇生物合成等多條代謝途徑。其中，發(fā)酵4年樣本中高豐度的差異代謝物主要富集在脂肪酸降解途徑?！窘Y(jié)論】復(fù)烤煙葉在陳化發(fā)酵不同時間微生物多樣性及代謝物質(zhì)具有顯著差異，上部葉片陳化發(fā)酵4年煙葉的內(nèi)在品質(zhì)最佳。

復(fù)烤煙葉；陳化發(fā)酵；微生物多樣性；代謝組；煙葉品質(zhì)

復(fù)烤煙葉陳化發(fā)酵過程中品質(zhì)變化的主要原因是煙葉中化合物的分解和轉(zhuǎn)化。例如，不具備香味特性的大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化為具有香味特性的小分子化合物，從而影響煙葉的香氣和吃味品質(zhì)[1-2]。煙葉微生物可代謝產(chǎn)成酸類、單萜類、酯類和氮雜環(huán)類等多種小分子物質(zhì)或中間產(chǎn)物，從而增加致香化合物生成、轉(zhuǎn)化與積累的效率和速度，因此，探索煙葉發(fā)酵過程中微生物群落演替及代謝產(chǎn)物的變化是提高發(fā)酵煙葉品質(zhì)的重要途徑[3-4]。

前人對發(fā)酵煙葉微生物的變化的研究主要基于微生物分離鑒定的方法，然而多數(shù)微生物因無法純培養(yǎng)而未能被檢測[5]。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，科研人員能夠以更低的成本和更短的時間對復(fù)雜菌群進(jìn)行深入精準(zhǔn)的鑒定，解決傳統(tǒng)方法存在的不足[6]。本研究利用高通量測序技術(shù)，結(jié)合代謝組學(xué)分析，解析了發(fā)酵煙葉中的微生物組和代謝物譜，為進(jìn)一步提高陳化煙葉品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試品種為紅花大金元，產(chǎn)自四川省涼山州烏東德鎮(zhèn)新馬鄉(xiāng)，煙葉等級為B2F。各年份貯藏?zé)熑~在入庫前均采用近紅外檢測其內(nèi)在質(zhì)量（表1），各指標(biāo)在不同年份入庫煙葉間差異不顯著（顯著性分析基于SPSS軟件LSD最小顯著性差異法完成）。煙葉封箱后進(jìn)入同一倉庫的同一貯藏高度儲存，倉庫位于四川省涼山州德昌縣煙葉復(fù)烤廠區(qū)，庫內(nèi)相對空氣濕度控制在（60±2）%，溫度控制在（30±5）℃。

表1 各年份煙葉入庫前內(nèi)在成分含量表（等級B2F）

Tab.1 Chemical composition of tobacco leaves in different years before storage (grade B2F)

1.2 實驗方法

1.2.1 取樣方法

以復(fù)烤后片煙封箱入庫的時間作為起始發(fā)酵時間，分別選取陳化0年（Nt2020）、1年（Nt2019）、4年（Nt2016）和7年（Nt2013）的樣品進(jìn)行取樣，將樣品隨機(jī)分為3個生物學(xué)重復(fù)分裝至樣品袋內(nèi)密封，4℃保存。

1.2.2 DNA提取和PCR擴(kuò)增

利用DNA提取試劑盒（美國MOBIO公司）對發(fā)酵煙葉樣品中微生物基因組DNA進(jìn)行抽提，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA質(zhì)量，隨后稀釋至3.5 ng/μL并保存于-20℃條件下用于PCR擴(kuò)增。使用通用引物338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAG CA-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3’）擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因的 V3-V4 區(qū)域[7]。

1.2.3 文庫構(gòu)建和測序

PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、等摩爾濃度定量富集和均一化形成測序文庫，經(jīng)文庫純化、質(zhì)檢后，委托北京百邁客生物科技有限公司完成MiSeq測序。

1.2.4 測序數(shù)據(jù)分析

使用Trimmomatic v0.33軟件[8]對Raw Reads進(jìn)行過濾，Cutadapt 1.9.1軟件進(jìn)行引物序列的識別與去 除[9]，Usearch v10軟件[10]進(jìn)行拼接，UCHIME v4.2軟件[11]鑒定并去除嵌合體序列，最后對數(shù)據(jù)進(jìn)行劃分Feature（OTUs、ASVs）、多樣性分析、差異分析、相關(guān)性分析及功能預(yù)測分析。使用R/Bioconductor包edgeR[12]中trimmed mean of M values（TMM）方法對OTU矩陣進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，得到OTU相對豐度矩陣。使用 RDP Classifier 軟件（v2.2，置信度閾值0.8）[13]并基于Silva分類學(xué)數(shù)據(jù)庫對OTU進(jìn)行分類學(xué)注釋。

1.2.5 菌群多樣性統(tǒng)計與顯著性分析

細(xì)菌菌群多樣性分析采用實驗室自編程序完成。采用R語言edgeR包中g(shù)lmfit函數(shù)進(jìn)行OTU豐度差異分析并采用stats包中wilcox.test函數(shù)進(jìn)行Wilcoxon秩和檢驗。使用R中g(shù)gplot2包完成文中所有配圖。在微生物功能預(yù)測中，使用PICRUSt2軟件進(jìn)行物種注釋[14]，使用IMG微生物基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行功能信息輸出，推測樣本的功能基因組成。使用STAMP[15]中的G-TEST檢驗方法進(jìn)行兩兩樣本間的顯著性差異檢驗，-value閾值為0.05。使用KEGG數(shù)據(jù)庫[16]完成微生物代謝功能的富集。

1.2.6 代謝物提取和色譜質(zhì)譜分析

稱取50 mg樣本，加入1000 μL含有2 μL內(nèi)標(biāo)L-2-氯苯丙氨酸（中國阿拉丁公司）的提取液，渦旋混勻后加入瓷珠45 Hz研磨處理10 min，冰水浴超聲10 min，-20℃靜置1 h。4℃下，12000 r/min離心15 min后，取500 μL上清，在真空濃縮器中干燥提取物，再加入160 μL提取液復(fù)溶，渦旋后冰水浴超聲10 min，4℃下12000 r/min離心15 min。取120 μL上清于2 mL進(jìn)樣瓶，同時從每個樣本各取10 μL混合后上機(jī)檢測。

使用液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)（超高效液相色譜：Waters UPLC Acquity I-Class PLUS，美國Waters公司；高分辨質(zhì)譜：Waters UPLC Xevo G2-XS QTof，美國Waters公司）完成色譜質(zhì)譜分析。正負(fù)離子模式掃描下，流動相 A為0.1%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸乙腈，進(jìn)樣體積為1 μL，梯度洗脫條件見表2[17]。

表2 流動相梯度洗脫條件

Tab.2 Gradient elution conditions of mobile phase

1.2.7 代謝組數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

采集的原始數(shù)據(jù)通過Progenesis QI軟件進(jìn)行峰提取、峰對齊等數(shù)據(jù)處理操作[18]?；赑rogenesis QI軟件在線METLIN數(shù)據(jù)庫進(jìn)行代謝物鑒定，最后以兩組間代謝物差異的顯著性（-value<0.05，t檢驗）和OPLS-DA模型的VIP值（VIP>1）為標(biāo)準(zhǔn)篩選獲得差異代謝物，并使用MetaboAnalyst結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行代謝通路分析[19-20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同陳化發(fā)酵時間煙葉感官質(zhì)量評價

對不同陳化發(fā)酵時間煙葉樣本的內(nèi)在質(zhì)量評價結(jié)果表明（表3），Nt2016（發(fā)酵4年樣本）較其他年份樣本煙葉香氣質(zhì)及香氣量顯著提高，表明煙葉香氣質(zhì)和香氣量在陳化4年時間后達(dá)到最佳。進(jìn)一步延長陳化時間，煙葉內(nèi)含物質(zhì)進(jìn)一步分解，煙葉的香氣量降低。

表3 陳化后煙葉感官質(zhì)量評價表（等級B2F）

Tab.3 Evaluation of sensory quality of flue-tobacco leaves at different fermentation stages (grade B2F)

注：各指標(biāo)均分值采用9分制。

Note: The average score of each index adopts the 9-point system.

2.2 不同陳化發(fā)酵時間煙葉微生物菌群多樣性

對不同發(fā)酵時間煙葉菌群物種豐富度和多樣性的測定結(jié)果表明（圖1），隨著測序深度增加，稀釋曲線基本達(dá)到飽和，說明測序數(shù)據(jù)能夠反映發(fā)酵煙葉中的微生物多樣性。不同發(fā)酵時間樣本稀釋曲線的分布結(jié)果表明，Nt2016樣本中細(xì)菌菌群多樣性最高，其次為Nt2013和Nt2019樣本，復(fù)烤后陳化時間不足1年的Nt2020樣本中細(xì)菌菌群多樣性最低。

圖1 發(fā)酵煙葉測序樣品稀釋曲線

進(jìn)一步分析每個樣本的Coverage覆蓋度指數(shù)、Chao1豐富度指數(shù)、Shannon多樣性指數(shù)以及Simpson多樣性指數(shù)。由表4可知，不同發(fā)酵時間的煙葉中的Coverage覆蓋度指數(shù)都大于0.99，表明樣品文庫中的序列基本都被測出，數(shù)據(jù)可用于后續(xù)分析。α多樣性分析表明，隨著發(fā)酵時間的延長，Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)和Shannon指數(shù)先升高后降低。在Nt2016中，物種豐度和多樣性達(dá)到最高。

表4 不同樣本的α多樣性指數(shù)

Tab.4 α-diversity indices of different samples

進(jìn)一步構(gòu)建柱狀圖展示樣本在不同分類水平上的群落結(jié)構(gòu)分布，不同陳化發(fā)酵時間煙葉在細(xì)菌門水平上的多樣性變化情況如圖2A所示。在所有發(fā)酵時間的煙葉中均發(fā)現(xiàn)10個菌門，分別是髕骨細(xì)菌門（Patescibacteria），廣原菌門（Euryarchaeota），綠彎菌門（Chloroflexi），疣微菌門（Verrucomicrobia），酸桿菌門（Acidobacteria），擬桿菌門（Bacteroidetes），放線菌門（Actinobacteria），厚壁菌門（Firmicutes），變形菌門（Proteobacteria）和藍(lán)細(xì)菌門（Cyanbacteria）。其中，藍(lán)細(xì)菌門和變形菌門占主導(dǎo)地位，隨著陳化發(fā)酵時間的延長，藍(lán)細(xì)菌門的相對豐度逐漸降低，在Nt2016發(fā)酵時間降到最低，而隨著發(fā)酵時間的延長，其相對豐度有所回升；變形菌門的相對豐度先升高再降低，在Nt2016發(fā)酵時間達(dá)到峰值。另外，在厚壁菌門、放線菌門和擬桿菌門中，細(xì)菌相對豐度均隨著陳化發(fā)酵時間的延長逐漸增加。

不同發(fā)酵時間煙葉中細(xì)菌屬水平上的多樣性變化情況如圖2B所示，在所有發(fā)酵時間中，占主導(dǎo)作用的優(yōu)勢菌群主要是未培養(yǎng)的含葉綠體細(xì)菌（uncultured bacterium Chloroplast），甲基桿菌屬細(xì)菌（），線粒體中未培養(yǎng)細(xì)菌（uncultured bacterium Mitochondria），泛菌屬細(xì)菌（），鞘脂單胞菌屬細(xì)菌（），腸桿菌科未培養(yǎng)細(xì)菌（uncultured bacterium Enterobacteriaceae），假單胞菌屬細(xì)菌（），腸道菌科未培養(yǎng)細(xì)菌（uncultured bacterium Muribaculaceae），羅爾斯通菌屬細(xì)菌（），不動桿菌屬細(xì)菌（）。其中，泛菌屬細(xì)菌在Nt2019發(fā)酵時間開始相對豐度逐漸增加，特別是在Nt2016發(fā)酵時間豐度激增，而隨著陳化發(fā)酵時間的進(jìn)一步延長其相對豐度驟減。

圖2 不同發(fā)酵時間煙葉細(xì)菌在菌門（A）和菌屬（B）水平上相對豐度變化

2.3 不同陳化發(fā)酵時間煙葉微生物功能分布及差異比較

為了進(jìn)一步探索Nt2016發(fā)酵時間與其他3個發(fā)酵時間煙葉中微生物菌群差異，通過微生物基因功能預(yù)測及KEGG代謝途徑差異分析，確定了Nt2016樣本與其他發(fā)酵時間樣本兩兩間微生物群落的功能基因在代謝途徑上的差異和變化。如圖3所示，隨著陳化發(fā)酵時間的延長，群落樣本為適應(yīng)環(huán)境變化發(fā)生了代謝功能改變，其豐度變化規(guī)律主要可分為兩個類型。其一是在整體代謝圖譜（Global and overview maps）、能量代謝（Energy metabolism）、輔因子與維生素代謝（Metabolism of cofactors and vitamins）方面，隨著發(fā)酵時間的延長，相關(guān)微生物豐度先顯著增加，而在后期發(fā)酵4年和7年又顯著下降。即在Nt2020與Nt2019比較中，Nt2019中微生物豐度比例顯著高于Nt2020，而在Nt2016和Nt2013的相關(guān)微生物豐度均顯著低于Nt2020。其二是在細(xì)胞運動（Cell motility）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（Signal transduction）和碳水化合物代謝（Carbohydrate metabolism）代謝通路中，隨著發(fā)酵時間的延長，相關(guān)微生物豐度先顯著下降，但在發(fā)酵4年時間處理的煙葉顯著增加，后在發(fā)酵7年時間其豐度又有所降低。即在Nt2020與Nt2019比較中，其95%置信度區(qū)間內(nèi)微生物豐度占有較大優(yōu)勢，而在Nt2020與Nt2016的比較中，Nt2016中微生物豐度比例顯著高于Nt2020。Nt2020與Nt2013相比，Nt2013中微生物豐度比例也顯著高于Nt2020，但95%置信度區(qū)間內(nèi)兩者的差異比例小于Nt2016。該結(jié)果表明，隨著發(fā)酵時間的延長，微生物整體代謝活性在不斷降低，而在部分代謝途徑中，Nt2016發(fā)酵時間的相關(guān)微生物較為活躍。

注：圖中A～C左邊所示為不同代謝途徑的微生物在兩兩樣本間的豐度比例，中間所示為95%置信度區(qū)間內(nèi)微生物豐度的差異比例，右邊為顯著性，P<0.05。

2.4 復(fù)烤煙葉陳化不同發(fā)酵時間代謝組分析

對不同發(fā)酵時間煙葉的代謝組分析結(jié)果表明（圖4），正負(fù)離子掃描模式下所有質(zhì)控樣本的變化分布于2STD之內(nèi)，且正負(fù)樣本的PCA分布中所有樣本QC相對集中、組內(nèi)差異不明顯、組間差異明顯、代謝組數(shù)據(jù)質(zhì)量高，可以進(jìn)行后續(xù)分析。利用主成分分析（PCA）方法將多維數(shù)據(jù)降維評估樣品的總體差異發(fā)現(xiàn)（圖4），不同發(fā)酵時間的煙葉樣品組內(nèi)聚集，距離較小，而樣品組間區(qū)分明顯，距離較大。該結(jié)果一方面表明測定結(jié)果重復(fù)性較好，同時表明不同發(fā)酵時間的煙葉樣品具有明顯差異，其體系內(nèi)代謝物發(fā)生明顯變化。其中，Nt2020與Nt2019組間差異較小，Nt2016與Nt2013組間差異也較小，而在Nt2019與Nt2016間代謝物差異較大，表明其代謝物的主要變化時間應(yīng)集中在發(fā)酵2～4年之間。

圖4 不同發(fā)酵時間發(fā)酵煙葉的PCA分析圖

利用OPLS-DA法[21]（orthogonal partial least squares discriminant analysis, OPLS-DA）分析不同發(fā)酵時間煙葉兩兩樣本間代謝物的差異，結(jié)果如圖5所示，正離子模式下，4個發(fā)酵時間每兩組間分離效果良好。模型可靠性驗證表明，6個模型穩(wěn)定，結(jié)果可信度高。

圖5 不同發(fā)酵時間兩組間發(fā)酵煙葉OPLS-DA圖

基于不同發(fā)酵時間兩兩樣本間代謝物豐度經(jīng)t檢驗后的值（<0.05）和OPLS-DA模型的VIP值（VIP>1），篩選出6個比較組間共計173個具有顯著性差異的代謝物，每組分別產(chǎn)生了15～96個顯著差異代謝物，以O(shè)PLS-DA模型的VIP值從高到低排列Top5的顯著差異代謝物如表5所示。在這些差異代謝物中，玉米烯酮在3個Nt2016參與的比較組中都表現(xiàn)出顯著高豐度，1-棕櫚酰-2-羥基-丙三基-3-磷酸乙醇胺和肉毒堿代謝物豐度在2個Nt2016參與的比較組中顯著增高。另外，在Nt2013參與的比較組中，(E)-2-丁烯基-4-甲基-蘇氨酸和β-高脯氨酸的豐度相對于Nt2019和Nt2020樣本中的豐度顯著增高，表明其在長期發(fā)酵過程中不斷積累。去甲丙咪嗪和羅布麻苷在Nt2020樣本中的豐度顯著高于Nt2019和Nt2013樣本，表明其在煙葉初期發(fā)酵中可能發(fā)揮重要作用。

表5 六個比較組中VIP值排名前五的差異代謝物

Tab.5 The top 5 differentially accumulated metabolites with VIP values in 6 comparison groups

續(xù)表5

比較組差異代謝物總數(shù)VIP值前五的差異代謝物L(fēng)og2FCPVIP代謝物類型 Nt2016 vs Nt202096玉米烯酮Zearalenone0.978.09E-041.44聚酮類化合物polyketides 肉毒堿Carnitine1.289.34E-041.43氨基酸及其衍生物Amino acids and derivatives 4-羥基-2,3,9-三甲氧紫檀堿4-Hydroxy-2,3,9-trimethoxypterocarpan1.530.93E-031.42紫檀烷類化合物pterocarpan Halaminol A2.781.06E-041.42 5-甲基-2-巰基尿苷5-Methyl-2-thiouridine1.621.14E-031.42核苷類似物Nucleoside Nt2019 vs Nt202052去甲丙咪嗪Desipramine-5.921.84E-041.63 羅布麻苷Cymarin-3.172.41E-041.62類固醇Steroids 麥角靈-1-吡咯甲醛,8-(羥甲基)-10-甲氧基-6-甲基-Ergoline-1-carboxaldehyde,8-(hydroxymethyl)-10-methoxy-6-methyl-0.259.77E-041.60 N-甲基-D-天冬氨酸N-Methyl-D-aspartic acid1.268.48E-041.60氨基酸及其衍生物Amino acids and derivatives 環(huán)戊醇胺酯Cyclopentolate0.678.94E-041.59抗膽堿類化合物Anticholinergics

利用clusterProfiler軟件選用超幾何檢驗的方法對差異代謝物進(jìn)行KEGG富集，結(jié)果如圖6所示，兩兩比較組中的顯著差異代謝物參與的代謝通路有亞麻酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、色氨酸代謝、脂肪酸生物合成、脂肪酸降解、半乳糖代謝、亞油酸代謝、賴氨酸生物合成、賴氨酸降解、類單萜生物合成、戊糖葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)換、磷酸鹽代謝、嘧啶代謝、類固醇生物合成、?；撬岽x、萜類骨架生物合成。在上述富集的代謝通路中，脂肪酸降解通路在Nt2016樣本與其他樣本相比較都具有顯著差異。另外，類固醇生物合成途徑在Nt2020樣本與其他樣本相比較均有顯著差異，表明其可能是煙葉陳化初期發(fā)酵的主要代謝途徑。

圖6 兩兩樣本比較中的差異代謝物及其參與的代謝途徑網(wǎng)絡(luò)圖

Fig.6 The network between the differentially accumulated metabolites and enriched pathway in six pair-wise groups.

3 討論

煙草吸食品質(zhì)與復(fù)烤煙葉發(fā)酵過程中微生物的作用密切相關(guān)。Li等研究發(fā)現(xiàn)，人工發(fā)酵2周、4周、6周的發(fā)酵煙葉中假單胞菌屬、鞘脂單胞菌屬、甲基桿菌屬、泛菌屬為優(yōu)勢菌屬，隨發(fā)酵時間延長，假單胞菌豐度增加，鞘脂單胞菌屬和甲基桿菌屬豐度降低[22]。龔俊等利用克隆文庫法和高通量測序法對煙葉微生物類群的研究發(fā)現(xiàn)，假單胞菌屬、不動桿菌屬和鞘氨醇單胞菌屬為主要優(yōu)勢細(xì)菌[23]。本研究發(fā)現(xiàn)在陳化發(fā)酵4年后（Nt2016），煙葉中的微生物豐度達(dá)到最大，微生物種類最多，其中，泛菌屬和假單胞菌屬在該樣品中豐度達(dá)到最大。以甲基桿菌屬為代表的菌屬則在新發(fā)酵煙葉（Nt2020）中豐度達(dá)到最大，并隨著發(fā)酵時間的延長其豐度逐漸降低。

前人研究表明，假單胞菌具有降解煙堿的能力，且降解煙堿時以煙堿作為唯一碳源和氮源從而成為優(yōu)勢菌屬[24]。因此，假單胞菌屬在降低煙草吸食危害，改變可燃卷煙的成癮性中起重要作用。鞘氨醇單胞菌作為從假單胞菌屬中分離出來的新菌屬，具有獨特的脂多糖結(jié)構(gòu)，繁殖能力強(qiáng)，廣泛應(yīng)用于生物大分子的降解方面[25]。有研究表明，經(jīng)鞘氨醇單胞菌發(fā)酵處理后，煙葉淀粉含量顯著降低，總糖、還原糖含量增加，同時鞘氨醇單胞菌能夠降解煙草中綠原酸及蕓香苷等多酚物質(zhì)，使煙葉感官質(zhì)量提高[26]。Zhao等證實了泛菌屬微生物可以降解煙葉中的類胡蘿卜素，并生成巨豆三烯酮、二氫大馬酮等香氣物質(zhì)，改善煙草的香氣質(zhì)量[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，這些與煙葉品質(zhì)相關(guān)的優(yōu)勢菌屬在不同發(fā)酵時間的煙葉中豐度存在差異，這可能與不同時間的發(fā)酵煙葉品質(zhì)有關(guān)。同時，本研究利用PICRUSt方法對鑒別到的微生物進(jìn)行代謝功能注釋，結(jié)果表明，隨著發(fā)酵時間的延長，以能量代謝為主的微生物整體代謝活性在不斷降低，而與細(xì)胞能動性、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和碳水化合物代謝相關(guān)特異性微生物豐度在Nt2016中顯著增加，表明陳化發(fā)酵4年時煙葉中微生物代謝活性發(fā)生顯著變化。

本研究通過代謝組學(xué)分析鑒定了不同發(fā)酵時期煙葉中的差異代謝物。其中，玉米烯酮在Nt2016參與的所有比較組中都表現(xiàn)出顯著高豐度。玉米烯酮是常見的霉菌毒素之一，由霉菌產(chǎn)生[28]。早在1933年就有研究發(fā)現(xiàn)，在煙葉陳化發(fā)酵過程中，細(xì)菌和霉菌是煙葉表面主要的兩大類群微生物[29]。本研究中Nt2016的發(fā)酵煙葉產(chǎn)生高豐度的真菌代謝產(chǎn)物，表明在Nt2016的發(fā)酵煙葉中不僅細(xì)菌的多樣性和代謝活性顯著增加，同時也應(yīng)該存在著高豐度的真菌。另外，在Nt2013與其他樣本間的比較組中發(fā)現(xiàn)，蘇氨酸、脯氨酸、天冬氨酰-精氨酸、丙氨酰-苯丙氨酸這些氨基酸分子在組間差異積累顯著。研究表明苯丙氨酸能夠降解生成苯甲醛、苯乙醇及苯乙醛，這些物質(zhì)為煙葉香氣物 質(zhì)[30]，因此長期陳化發(fā)酵確實有利于香氣物質(zhì)的積累。KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)這些差異代謝物參與到氨基酸代謝、脂肪酸代謝等代謝合成途徑。其中，脂肪酸降解途徑在Nt2016的發(fā)酵煙葉與其他時間發(fā)酵煙葉的差異代謝物中均被富集到，且在Nt2016呈現(xiàn)高豐度的差異代謝物，如丙三醇-1-豆蔻酸、肉毒堿、1-棕櫚酰-2-氫氧根-丙三基-3-磷酸乙醇胺、a-羥基十四酸等也確實參與脂肪酸降解途徑。已有研究表明，脂肪酸降解物與多個煙草評析指標(biāo)，如香氣、煙氣濃度、雜氣、刺激性、吃味、勁頭、甜度等均存在顯著或極顯著相關(guān)水平[31]。結(jié)合陳化不同年份煙葉的內(nèi)在質(zhì)量評吸結(jié)果，香氣質(zhì)和香氣量在Nt2016煙葉內(nèi)在品質(zhì)達(dá)到最佳，因此可以推斷，上部煙葉陳化發(fā)酵4年時期，煙葉中以假單胞菌屬和泛菌屬為代表的微生物活性達(dá)到峰值，通過脂肪酸降解途徑相關(guān)的代謝物積累和作用，在提高煙葉化學(xué)成分協(xié)調(diào)性的基礎(chǔ)上顯著增加了煙葉香氣質(zhì)和香氣量，相對于發(fā)酵1年和7年來說應(yīng)為發(fā)酵最佳時期。前人研究中曾采用質(zhì)量評定和化學(xué)分析方法探究煙葉陳化發(fā)酵過程中生化特性的變化規(guī)律，表明不同等級煙葉的理論陳化標(biāo)準(zhǔn)時間有所不同。如余校芳認(rèn)為上桔二最佳貯存期為12～20個月，上桔三為15～23個月[32]；郭俊成等認(rèn)為中三中四煙葉陳化時間兩年為宜，上二煙需要3年時間品質(zhì)才能達(dá)到要求[33]。本研究選用的樣品即是內(nèi)含物質(zhì)較豐富的上部葉片，其相較于中下部葉片結(jié)構(gòu)更緊密，身份更為厚實，其陳化時間理論上應(yīng)比中下部葉片更長。另外，韓錦峰的研究表明在現(xiàn)有技術(shù)條件下烤煙達(dá)到最佳吸味品質(zhì)的最佳自然醇化時間為24～30個月[34]。由于本研究中取樣范圍較大，主要比較了0年、1年、4年和7年的陳化樣本，因此在后續(xù)實驗中還可采用微生物組和代謝組研究手段在1～4年時間段內(nèi)進(jìn)一步研究煙葉陳化發(fā)酵機(jī)理。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)在煙葉復(fù)烤后的不同陳化發(fā)酵時間，煙葉中微生物菌群與代謝產(chǎn)物均會發(fā)生顯著變化。其中，發(fā)酵4年的煙葉中微生物種類最多，多樣性豐值最大，且發(fā)酵4年煙葉中顯著高豐度的差異代謝物主要富集在脂肪酸降解途徑。結(jié)合感官質(zhì)量評價數(shù)據(jù)表明，上部葉片陳化發(fā)酵4年相對于其他發(fā)酵時期煙葉的內(nèi)在品質(zhì)最佳。本研究明確了復(fù)烤煙葉在陳化發(fā)酵不同時間微生物多樣性及代謝物質(zhì)的差異，有利于煙葉發(fā)酵過程中功能微生物的篩選，對煙葉發(fā)酵過程的機(jī)理研究提供一定理論參考，為進(jìn)一步研究煙葉陳化時期與煙草吸味品質(zhì)之間的關(guān)系提供了一定理論基礎(chǔ)。

[1] 單宏英. 陳化煙葉表面有益微生物的分離篩選、鑒定及應(yīng)用研究[D]. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2012.

SHAN Hongying. Studies on screening, identification and application of beneficial microorganisms isolated from aging tobacco surfaces[D]. Northwest A&F University, 2012.

[2] 陳倫旺. 陳化煙葉微生物的分離鑒定及其在煙葉發(fā)酵中的應(yīng)用[D]. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2020.

CHEN Lunwang. Isolation and identification of microorganisms in aged tobacco leaves and their application in tobacco leaf fermentation[D]. Northwest A&F University, 2020.

[3] 趙銘欽，劉云，李芳芳，等. 陳化烤煙葉面優(yōu)勢菌的篩選鑒定與其增香效應(yīng)[J]. 微生物學(xué)報，2009, 49(5): 625-631.

ZHAO Mingqin, LIU Yun, LI Fangfang, et al. Identification of dominant and fragrance-enhancing microorganisms of tobacco leaves during ripening[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2009, 49(5): 625-631.

[4] 伍雪瑩. 陳化烤煙煙葉細(xì)菌群落鑒定及應(yīng)用研究[D]. 廣州：華南理工大學(xué)，2014.

WU Xueying. Identification and application study of bacterial communities on flue-cured tobacco leaves[D]. South China University of Technology, 2014.

[5] Fakruddin M, Mannan KS, Andrews S. Viable but nonculturable bacteria: food safety and public health perspective[J]. ISRN Microbiology, 2013, 2013:703813.

[6] Tamang JP, Watanabe K, Holzapfel WH. Review: Diversity of microorganisms in global fermented foods and beverages[J]. Frontiers in Microbiology, 2016, 7:377.

[7] Huws SA, Edwards JE, Kim EJ, et al. Specificity and sensitivity of eubacterial primers utilized for molecular profiling of bacteria within complex microbial ecosystems[J]. Journal of Microbiological Methods, 2007, 70(3): 565-569.

[8] Bolger AM, Lohse M, Usadel B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data[J]. Bioinformatics,2014, 30(15): 2114- 2120.

[9] Kechin A, Boyarskikh U, Kel A, et al. A new tool for accurate cutting of primers from reads of targeted next generation sequencing[J]. Journal of Computational Biology: a Journal of Computational Molecular Cell Biology, 2017, 24(11): 1138-1143.

[10] Edgar RC. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics, 2010, 26(19): 2460-2461.

[11] Edgar RC, Haas BJ, Clemente JC, et al. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection[J]. Bioinformatics, 2011, 27(16): 2194-2200.

[12] Robinson MD, McCarthy DJ, Smyth GK. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data[J]. Bioinformatics, 2010, 26(1): 139-140.

[13] Lan Y, Wang Q, Cole JR, Rosen GL. Using the RDP classifier to predict taxonomic novelty and reduce the search space for finding novel organisms[J]. PLoS One, 2012, 7(3): e32491.

[14] Douglas GM, Maffei VJ. PICRUSt2 for prediction of metagenome functions[J]. Nature Biotechnology, 2020, 38(6): 685-688.

[15] Parks DH, Tyson GW, Hugenholtz P, et al. STAMP: statistical analysis of taxonomic and functional profiles[J]. Bioinformatics, 2014, 30(21): 3123-3124.

[16] Galperin MY, Kristensen DM, Makarova KS, et al. Microbial genome analysis: the COG approach[J]. Briefings in Bioinformatics, 2019, 20(4): 1063-1070.

[17] Wang J, Zhang T, Shen X, et al. Serum metabolomics for early diagnosis of esophageal squamous cell carcinoma by UHPLC-QTOF/MS[J]. Metabolomics 2016, 12(7): 1-10.

[18] Qi D, Brownridge P, Xia D, et al. A software toolkit and interface for performing stable isotope labeling and top3 quantification using Progenesis LC-MS[J]. Omics : a Journal of Integrative Biology, 2012, 16(9):489-495.

[19] Slade WO, Werth EG, McConnell EW, et al. Quantifying reversible oxidation of protein thiols in photosynthetic organisms[J]. Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 2015, 26(4): 631-640.

[20] Kuhl C, Tautenhahn R, Bottcher C, et al. CAMERA: an integrated strategy for compound spectra extraction and annotation of liquid chromatography/mass spectrometry data sets[J]. Analytical Chemistry, 2012, 84(1):283-289.

[21] Boccard J, Rutledge DN. A consensus orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) strategy for multiblock Omics data fusion [J]. Analytica Chimica Acta, 2013, 769:30-39.

[22] Zhao J, Zhang D, Yang Y, et al. Dissecting the effect of continuous cropping of potato on soil bacterial communities as revealed by high-throughput sequencing[J]. PloS One, 2020, 15(5):e0233356.

[23] 龔俊，劉玉配，李媛媛. 煙葉表面微生物類群兩種檢測方法的比較研究[J]. 華東師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2016(3): 92-101+114.

GONG Jun, LIU Yupei, LI Yuanyuan. Comparative analysis of microbial communities on tobacco leaves between clone library and high-throughput sequencing[J]. Journal of East China Normal University (Natural Science), 2016(3):92-101+114.

[24] Zhong W, Zhu C, Shu M, et al. Degradation of nicotine in tobacco waste extract by newly isolatedsp. ZUTSKD[J]. Bioresource Technology, 2010, 101(18):6935-6941.

[25] 張穎，楊悅，韋慶慧，等. 鞘氨醇單胞菌的特性及應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 化學(xué)與生物工程，2021, 38(3):6-13.

ZHANG Ying, YANG Yue, WEI Qinghui, et al. Research progress in characteristic and application of[J]. Chemistry & Bioenginering, 2021, 38(3):6-13.

[26] 馮穎杰，袁岐山，楊宗燦，等. 一株鞘氨醇單胞菌對復(fù)烤后煙葉多酚物質(zhì)的降解作用[J]. 中國煙草學(xué)報, 2019, 25(1):19-24.

FENG Yingjie, YUAN Qishan, YANG Zongcan, et al. Effect ofsp. strain on degradation of polyphenols in redried tobacco leaves[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2019, 25(1):19-24.

[27] Zhao Y, Zhong GF, Yang XP, et al. Bioconversion of lutein to form aroma compounds by[J]. Biotechnology Letters, 2015, 37(8):1687-1692.

[28] 韋康，黃天輝，白森，等. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定煙葉中的玉米赤霉烯酮[J]. 當(dāng)代化工，2019, 48(7):1623-1625+1629.

WEI Kang, HUANG Tianhui, BAI Sen, et al. Determination of zearalenone in tobacco leaves by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Contemporary Chemical Industry, 2019, 48(7):1623-1625+1629.

[29] 朱宏建，高必達(dá)，易圖永. 煙葉貯藏期霉變原因及防霉技術(shù)研究[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報，2007, 13(15):139-141.

ZHU Hongjian, GAO Bida, YI Tuyong. Study on mildewing causes of tobacco in storage stage and its control technologies [J]. Anhui Agricultural Science Bulletin, 2007, 13(15):139-141.

[30] 吳麗君，石鳳學(xué)，劉晶，等. 煙草香氣成分分析研究進(jìn)展[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2014, 30(21):251-257.

WU Lijun, SHI Fengxue, LIU Jing, et al. Tobacco aroma analysis review[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2014, 30(21):251-257.

[31] 李艷梅. 煙葉在烘烤過程中脂氧合酶活性與脂肪酸、色素降解對品質(zhì)的影響[D]. 鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)；2001.

LI Yanmei. The effect of degradation of faty acid and pigment and quality of tobacco leaf during flu-cured[D]. Henan Agricultural University, 2001.

[32] 余校芳，李明三，肖本炎，等. 煙葉最佳儲存期研究[G]. 國家煙草專賣局科技教育司. 煙草科學(xué)技術(shù)成果匯編第三輯(1993～ 1995). 鄭州：河南科學(xué)技術(shù)出版社，1996.

YU Xiaofang, LI Mingsan, XIAO Benyan, et al. Study on the best storage period of tobacco leaves[G]. Science and Technology Education Department of the State Tobacco Monopoly Administration. Third Series of Tobacco Science and Technology Achievements Collection (1993～1995). Zhenzhou: Henan Science and Technology Press,1996.

[33] 郭俊成，程曉蕾，肖厚榮，等. 皖南烤煙陳化研究[J]. 中國煙草，1996(2): 16-17.

GUO Juncheng, CHENG Xiaolei, XIAO Hourong, et al. Study on aging of flue-cured tobacco in southern Anhui[J]. Chinese Tobacco, 1996(2):16-17.

[34] 韓錦峰，朱大恒，楊素勤，等. 不同陳化時期烤煙幾種酶活性及相關(guān)化學(xué)成分的分析[J]. 中國煙草科學(xué)，1999(1):1-2.

HAN Jinfeng, ZHU Daheng, YANG Suqin, et al. Analysis of enzyme activity and relevant chemical components of flue-cured tobacco in different stages of aging [J]. Chinese Tobacco Science, 1999(1):1-2.

Analysis of microbial diversity and metabolome of flue-cured Tobacco with different fermentation time

ZHANG Wenyou1, YAN Lang1, LAI Xianjun1*, DUAN Wangjun2, ZHANG Yizheng3

1 Sichuan Key Laboratory of Featured Crop Research and Utilization, College of Agriculture Science, Xichang University, Liangshan, 615013, China；2 China Tobacco Sichuan Industrial Co.Ltd., Chengdu 610066, China；3 Sichuan Key Laboratory of Molecular Biology and Biotechnology, College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610064, China

[] This study aims to understand the relationship between microorganisms and metabolites in tobacco leaves with different fermentation time and to explore the influence of microorganisms on tobacco leaf fermentation quality. [] Using Illumina high-throughput sequencing technology and UPLC-ATOF MS liquid-mass spectrometry technology were used to analyze the microbial diversity and differentially expressed metabolites of flue-cured tobacco leaf samples fermented for 0, 1, 4 and 7 years. [] Four-year-fermented tobacco leaves had the most abundant microbial species, which showed the highest microbial diversity. At the level of genus,andare the dominant genus in tobacco leaves in samples fermented for 4 years. Combined with the OPLS-DA model and database searching, a total of 173 significantly different metabolites were identified by pair-wise comparison in 4 fermentation stages. After KEGG enrichment, it was found that the different metabolites were involved in amino acid metabolism, fatty acid metabolism, and steroid biosynthesis. Among them, the high-abundance differentially expressed metabolites in the samples with 4 years of fermentation were mainly enriched in the fatty acid degradation pathway. [] There were significant differences in microbial diversity and metabolites of flue-cured tobacco leaves with different time of fermentation, in which four-year fermentation is the best duration of fermentation.

flue-cured tobacco; fermentation; microbial diversity; metabolomics; tobacco quality

. Email：laixianj@hotmail.com

張文友，顏朗，賴先軍，等. 陳化烤煙葉片不同發(fā)酵時間微生物多樣性及代謝組分析[J]. 中國煙草學(xué)報，2022，28（5）.

ZHANG Wenyou, YAN Lang, LAI Xianjun, et al. Analysis of microbial diversity and metabolome of flue-cured Tobacco with different fermentation time[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2022,28(5).

10.16472/j.chinatobacco. 2021.143

四川中煙工業(yè)有限責(zé)任公司項目“寬窄‘潤甜香’核心煙葉原料內(nèi)涵挖掘與配套技術(shù)研究（微生物菌肥修復(fù)煙草連作障礙與技術(shù)示范方向）”（No. yl2020001）

張文友（1969—），本科，副教授，主要研究方向：煙草栽培學(xué)，Tel：0834-2580077，Email：892748686@qq.com

賴先軍（1986—），Tel：0834-2580077，Email：laixianj@hotmail.com

2021-07-26；

2022-06-30