紫外可見分光光度法測定化橘紅中總黃酮的含量*

李幸穗，黃淑慧，郭俐麟

(廣州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510000)

我國中醫(yī)藥文化歷史悠久，中醫(yī)藥乃中華優(yōu)秀傳統(tǒng)文化寶庫中非常重要的組成部分，是中華民族的國粹。中草藥是預(yù)防、治療疾病的重要手段，中草藥種類繁多、資源豐富、療效確切，既能防治常見病、多發(fā)病，還可治療疑難病癥。近年，新冠肺炎疫情肆虐，在總結(jié)我國國內(nèi)疫情防控救治工作經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)之上，中國積極分享防控經(jīng)驗(yàn)，贏得了國際社會的普遍贊譽(yù)與高度評價，對中醫(yī)藥的走向世界起到了推動作用。

化橘紅又名“化州橘紅”，是較為常見的止咳化痰中藥，屬于廣東省道地藥材，出產(chǎn)于廣東省茂名市化州市，是中國國家地理標(biāo)志性產(chǎn)品。《本草綱目拾遺》記載化橘紅可以治痰癥、消油膩、谷食積、醒酒、寬中、解蟹毒，《嶺南采藥錄》也記載化橘紅味苦辛、性溫平、無毒?；偌t是一種名貴中藥材，具有散寒燥濕，利氣消疾，止咳、健脾消食等功效，有“南方人參”之稱。2006年，化橘紅被列入國家地理標(biāo)志產(chǎn)品保護(hù)，2012年，化橘紅(中藥文化)入選廣東省非物質(zhì)文化遺產(chǎn)項(xiàng)目，同年化橘紅被列入《美國藥典》。目前化橘紅類的藥材主要包括正毛橘紅、副毛橘紅、光橘紅、光黃橘紅等品種。

化橘紅主要有效成分有黃酮類化合物，還含有香葉醇、芳樟醇、枸櫞酸等成分，其中最主要是柚皮苷、野漆樹苷和新橙皮苷等[2]。前二者含量之和占化橘紅總黃酮類總量的84%以上，因此，在現(xiàn)有的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)中常常把柚皮苷或野漆樹苷作為化橘紅的關(guān)鍵質(zhì)量控制指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)室條件下提取化橘紅黃酮類化合物主要有索氏回流提取法[3]、超聲波法[4]和酶解輔助法[5]等，目前總黃酮含量測定方法有UV、TLC、HPLC、HPLC/MS等方法[6]。為準(zhǔn)確測定化橘紅中總黃酮的含量以及最佳提取工藝，本文選取水浴回流加熱提取法進(jìn)行研究，采取紫外可見分光光度法測定樣品中總黃酮的含量，簡便快捷，適用于化橘紅產(chǎn)品的提取和質(zhì)量控制，為化橘紅制劑開發(fā)提供有效依據(jù)。

1 設(shè)備與實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要設(shè)備

752N紫外可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；KQ-250DE超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；HH-S2數(shù)顯恒溫水浴箱，金壇市醫(yī)療儀器廠；DHG-9203A電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；4500A多功能粉碎機(jī)，永康市速鋒工貿(mào)有限公司；BS224S萬分之一天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

化橘紅，化州市礞石山橘紅發(fā)展有限公司；柚皮苷對照品(批號：110722-201815，含量91.7%)，中國食品藥品檢定研究院；甲醇(分析純)，天津市百世化工有限公司；無水乙醇(分析純)，天津市百世化工有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 對照品溶液的配制

取柚皮苷對照品8.0 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加無水乙醇適量使溶解，并加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得1 mL含柚皮苷80 μg的對照品溶液。

2.2 供試品溶液的配制

將化橘紅去除雜質(zhì)，置80 ℃烘箱干燥4 h至恒重，粉碎，過60目篩，取橘紅粉末適量(約0.5 g)，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密量取無水乙醇50 mL，稱定重量，置水浴中加熱回流70 min，室溫放冷，再稱定重量，用無水乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，精密量取續(xù)濾液0.125 mL，置10 mL量瓶中，加50%乙醇至刻度，搖勻，即得。

2.3 測定波長選擇的方法

以50%乙醇為空白，在200～400 nm 范圍內(nèi)，分別對對照品溶液與供試品溶液進(jìn)行光譜掃描，選擇最大吸收波長作為測定波長。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取2.1項(xiàng)下對照品溶液1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 mL于10 mL量瓶中，用50%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成對照品系列溶液。以50%乙醇為空白，在283 nm處測定吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

精密量取2.1項(xiàng)下對照品溶液2.5于10 mL量瓶中，用50%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻后連續(xù)測定6次，計(jì)算結(jié)果。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取2.2項(xiàng)下供試品溶液，在放置0、10、30、60、90、120 min后，按照“2.4”項(xiàng)下方法在283 nm處分別測定吸光度，計(jì)算結(jié)果。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取2.2項(xiàng)下供試品溶液，每份約 0.5 g，精密稱定，按照2.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法平行制備5份樣品，按照“2.4”項(xiàng)下方法在283 nm處分別測定吸光度，計(jì)算測定結(jié)果。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

按照高、中、低3個質(zhì)量濃度梯度，精密稱取已測含量的化橘紅粗粉(已知總黃酮含量為15.92%)樣品9份，精密加入一定量柚皮苷對照品溶液，至燒瓶中，按照“2.2”項(xiàng)下制備樣品，按擬定方法測定A值，計(jì)算加樣回收率。

3 結(jié) 果

3.1 最佳吸收波長的選擇

通過光譜掃描圖發(fā)現(xiàn)，兩者光譜圖基本一致，且在283 nm(±1 nm)處有最大吸收，因此，選取最大吸收283 nm作為測定總黃酮的測定波長。

3.2 線性關(guān)系考察結(jié)果

按2.4方法進(jìn)行考察，標(biāo)曲曲線測定結(jié)果為，回歸方程：A=0.0252C-0.0103，相關(guān)系數(shù)r=0.9999(A為吸收度；C為濃度，μg·mL-1)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法測定化橘紅中總黃酮含量在12～28 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.3 精密度考察結(jié)果

按2.5方法進(jìn)行精密度考察，測得對照品溶液平均濃度為20.11 μg/mL，RSD為0.1%，表明該方法測定結(jié)果的精密度良好。

3.4 穩(wěn)定性考察結(jié)果

按2.6方法進(jìn)行穩(wěn)定性考察，化橘紅中總黃酮含量平均值為15.96%，RSD為1.1%，結(jié)果表明，該方法測定供試品溶液在2 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.5 重復(fù)性考察結(jié)果

按2.7方法進(jìn)行重復(fù)性考察，化橘紅中總黃酮含量平均值為15.89%，RSD為1.5%，結(jié)果表明，該方法測定化橘紅中總黃酮含量的重現(xiàn)性良好。

3.6 加樣回收率考察結(jié)果

按2.8方法進(jìn)行加樣回收率考察，結(jié)果表明，平均回收率為100.8%，其RSD為1.7%(回收率=測得量-藥材×含量%/對照品加入量×100%)。

表1 加樣回收率試驗(yàn)(n=9)Table 1 Sample recovery test(n=9)

3.7 化橘紅中總黃酮含量測定

按照2.2項(xiàng)下試供品溶液制備方法制備樣品三份，再按照“2.4”項(xiàng)下方法在283 nm處測定吸光度，計(jì)算試供品溶液濃度C，然后按下式計(jì)算總黃酮含量。測定化橘紅中總黃酮平均含量為15.92%。

提取率=C×D(稀釋倍數(shù))×V(提取體積)/原材料質(zhì)量×100%

總黃酮含量=C×D(稀釋倍數(shù))×V(提取體積)

4 討 論

根據(jù)陳永剛等[8]、彭穎等[9]、王雯等[10]、韋英杰[11]和龐瑞等[12]的研究結(jié)果，總黃酮得率差異性很大，究其原因，可能是所用化橘紅品種不同[13]，以及提取方法有差異等有關(guān)?；偌t中黃酮類化合物的提取方法有很多，包括回流提取法、超聲波提取法等，回流提取法使用較多，它利用了黃酮類化合物在有機(jī)溶劑中溶解度較大的原理，將黃酮類化合物直接從化橘紅中萃取出來。根據(jù)黃酮類化合物及其雜質(zhì)的極性大小不同，選取適宜的有機(jī)溶劑，如甲醇、乙醇、乙醚、石油醚等。

超聲波提取法[3]利用了超聲波的空化效應(yīng)、擾動效應(yīng)、擊碎效應(yīng)，熱力效應(yīng)等與傳統(tǒng)溶劑萃取法相結(jié)合的原理，連續(xù)產(chǎn)生的高壓不斷地沖擊細(xì)胞壁，使之破裂，從而使內(nèi)容物釋放至提取溶劑中，物質(zhì)交換次數(shù)隨碰撞次數(shù)不斷增多，使得細(xì)胞膜透過能力也得以增強(qiáng)，從而使得黃酮類化合物溶解進(jìn)入到溶劑的速度增加，此外，化合物在試劑中溶解性的增強(qiáng)可提高其提取率，縮短提取時間。此法操作簡便方便，所需時間相對較少，提取率較高。本研究在進(jìn)行化橘紅最佳提取工藝(試供品溶液制備)確定時，采用均勻設(shè)計(jì)，選用超聲提取法及水浴加熱回流提取法進(jìn)行對比，采用100%乙醇在45 ℃超聲提取提取60 min得出的提取率為10.90%；85%乙醇水浴加熱回流提取50 min得出的提取率為11.05%，100%乙醇水浴加熱回流提取70 min得出的提取率為15.92%，以此確定提取溶劑為100%乙醇，提取方法為加熱回流提取法。

黃酮類化合物檢測方法較多，包括單一的分光光度法、薄層色譜法、高效液相色譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等。在實(shí)際工作中，薄層色譜法適用于藥物的定性分析，也曾經(jīng)用于化橘紅中黃酮單體含量的定量分析，但現(xiàn)在大多被高效液相色譜法所代替，目前該法主要適用于化橘紅的品種鑒定。高效液相色譜法常用于黃酮單體含量的測定，如化橘紅中柚皮苷的含量測定等。高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法是最新的檢測技術(shù)，不僅可用于化橘紅中黃酮類化合物的定性及定量分析，還可以提供黃酮類化學(xué)物豐富的結(jié)構(gòu)信息，具有非常強(qiáng)大的組分鑒定及檢測能力，分析檢測成本較高。紫外可見分光光度法常用于藥物的定性與定量檢測中，具有專屬性較強(qiáng)，操作簡單快捷的特點(diǎn)，可用于總黃酮的測定，是總化合物測定方法的首選方法?；偌t中的總黃酮主要以柚皮苷的形式存在，其含有多個酚羥基，受光照射或暴露在空氣中，容易變色，采用紫外分光光度法測定化橘紅中總黃酮含量可以避免檢測結(jié)果不準(zhǔn)確的現(xiàn)象，且該測定方法操作簡單方便[7,14-16]，在測定化橘紅類產(chǎn)品時能發(fā)揮很好的作用。

5 結(jié) 論

本研究以化橘紅為原料，采用均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化了化橘紅中總黃酮的提取工藝，選擇了提取溶劑、提取體積、提取時間進(jìn)行考察，最佳提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)100%，液料比1:100，提取時間70 min，采用水浴加熱回流提取法。在此條件下，黃酮的平均提取率為15.92%。該提取方式適用于大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室條件，不用石油醚進(jìn)行提取化橘紅總黃酮的最佳提取工藝。將化橘紅提取液濃縮后可用于制備化橘紅顆粒、化橘紅泡騰片等，為化橘紅的資源利用提供了參考。