H型高血壓首發(fā)腦梗死病人MTHFR C677T基因多態(tài)性及部分促炎因子水平表達

宋玲玲，樊志勇，丘 宇，溫德樹，馬莉琴

原發(fā)性高血壓是常見的心血管疾病之一，占高血壓病人的90%以上，發(fā)病率和死亡率逐年升高，且呈年輕化趨勢[1]。H型高血壓是原發(fā)性高血壓的一種類型，主要特點為病人血漿同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)水平≥10 μmol/L[2]。根據(jù)6城市(北京、上海、南京、沈陽、哈爾濱、西安)高血壓人群調(diào)查顯示，成年高血壓病人中H型高血壓約占75%，其中男性比例高于女性[3]。有研究表明，血漿Hcy水平每升高5 μmol/L，心腦血管疾病發(fā)生風險約增加59%[4]。因此，Hcy水平升高可作為腦梗死發(fā)生的重要危險因素，且控制H型高血壓對防治心腦血管疾病的發(fā)生具有重要的臨床意義。亞甲基四氫葉酸還原酶(methylene tetrahydrofolate reductase，MTHFR)是蛋氨酸循環(huán)中的一個關(guān)鍵酶，在葉酸代謝通路中可將5，10-亞甲基四氫葉酸(5，10-methylene tetrahydrofolate，5，10-CH2-THF)轉(zhuǎn)化為具有生物學功能的5-甲基四氫葉酸(5-methyltetrahydrofolate，5-MTHF)，其中堿基突變多發(fā)生在667位點[5]。MTHFR C677T基因多態(tài)性導致丙氨酸被纈氨酸取代，從而引起酶活性降低和Hcy水平升高，包括野生CC基因型、純合突變TT基因型和雜合突變CT基因型3種類型[6]。目前，關(guān)于基因多態(tài)性與高血壓或腦卒中相關(guān)的研究報道較多[7-8]，MTHFR C677T基因多態(tài)性與H型高血壓和腦梗死的報道較少。本研究通過對2018年1月—2020年1月我院收治的120例腦梗死病人進行研究，探討H型高血壓首發(fā)腦梗死病人MTHFR C677T基因多態(tài)性及部分促炎因子水平表達?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年1月—2020年1月我院收治的腦梗死病人120例，其中男77例，女43例；年齡46～70(56.78±1.20)歲；高血壓病程8～20(14.33±3.65)年。根據(jù)是否發(fā)生H型高血壓將病人分為腦梗死組和H型高血壓首發(fā)腦梗死組，其中腦梗死組67例，H型高血壓首發(fā)腦梗死組53例；同時選取我院同期健康體檢者60名作為對照組。所有研究對象或家屬對本研究內(nèi)容完全知情，均簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準 腦梗死符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2010》[9]中的相關(guān)診斷標準，經(jīng)頭部CT、MRI或彌散加權(quán)成像(DWI)證實；H型高血壓符合中國高血壓防治指南修訂委員會修訂的《中國高血壓防治指南2010》[10]中的相關(guān)診斷標準，即收縮壓≥140 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)和(或)舒張壓≥90 mmHg，同時Hcy≥10 μmol/L。對照組為血壓、血糖、肝功能、腎功能等實驗室檢值和影像學體檢無異常，且未發(fā)現(xiàn)臨床疾?。慌R床資料完整。

1.2.2 排除標準 心、腦、腎等器官功能嚴重障礙；近期服用過維生素、葉酸、銀杏葉制劑等影響Hcy代謝藥物的病人；合并腫瘤、痛風、糖尿病、肝腎疾病或周圍血管??；腦卒中病史。

1.3 實驗儀器和試劑 臺式水銀血壓計購自江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司；Hcy測定使用日立公司的7180型全自動生化分析儀；C反應(yīng)蛋白(CRP)測定使用基蛋生物科技股份有限公司的Getein 1600熒光免疫定量分析儀；白細胞介素6(IL-6)測定使用羅氏cobase411全自動化學發(fā)光分析儀?；蚪MDNA提取試劑盒及Applied Biosystems7300/7300plus/7500/7500Fast實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)系統(tǒng)購自賽默飛世爾科技公司，并由深圳泰樂德醫(yī)學檢驗實驗室完成MTHFR基因檢測。

1.4 標本收集 記錄所有研究對象性別、年齡等一般資料，采用符合計量標準校正過的臺式水銀血壓計測量血壓?？崭?2～14 h，抽取靜脈血，其中一管為血清生化管，采集5 mL，肝素抗凝，1 h內(nèi)以3 000 r/min離心10 min，分離血漿檢測生化指標；另一管采集5 mL，EDTA抗凝，置于4 ℃冰箱保存，用于提取DNA；一管為血清生化管，采集5 mL，肝素抗凝，4 ℃下靜置2 h，分層出現(xiàn)血清時，以3 000 r/min離心15 min，吸取上層血清，置于-80 ℃冰箱保存，檢測促炎因子水平。

1.5 觀察指標

1.5.1 血漿 Hcy 測定 采用7180型全自動生化分析儀通過循環(huán)酶法測定血漿Hcy含量。實驗步驟嚴格按照說明書進行操作。

1.5.2 生化指標 采用P-800全自動生化分析儀測定總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、空腹血糖(FBG)、尿酸(UA)、肌酐(Cr)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)等，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.5.3 促炎因子 采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒檢測病人血清IL-6、CRP水平。實驗步驟嚴格按照說明書進行操作。

1.6 MTHFR C677T基因多態(tài)性

1.6.1 DNA提取 使用血液基因組DNA少量抽提試劑盒法提取人類白細胞基因組DNA，操作嚴格按照說明書進行，提取后的DNA置于-20 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 設(shè)計引物 使用美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)查詢MTHFR C677T基因所在的DNA序列信息，明確其前后序列：TTGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGAG[C/T]CGATTTCATCATCACGCAGCTTTTC，再利用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0軟件進行PCR引物設(shè)計。正向引物序列：5′-GGAGAAGGTGTCTGCGGGAG-3′，反向引物序列：5′-CAAAGAAAAGCTGCGTGATGATGATGA-3′。由深圳泰樂德醫(yī)學檢驗實驗室合成后溶解待用。

1.6.3 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增 采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性技術(shù)(PCR-RFLP)擴增目的基因片段。PCR反應(yīng)體系為25 μL，常規(guī)配制，包括模板DNA 3.0 μL，正向、反向引物(10 μmol)各0.5 μL，PCR master mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。應(yīng)用PCR梯度基因擴增儀擴增目的基因片段。擴增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性60 s，59 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，36個循環(huán)。之后72 ℃延伸5 min。取PCR產(chǎn)物5 μL，使用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.6.4 限制性內(nèi)切酶分型 反應(yīng)體系為32 μL，包括PCR擴增產(chǎn)物10 μL，限制性內(nèi)切酶Hinf Ⅰ 2 μL，10×Buffer R 2 μL，ddH2O 18 μL。37 ℃下消化過夜，待酶切反應(yīng)終止后，將其產(chǎn)物用90 g/L聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，室溫恒壓100 V下電泳9 min后，使用硝酸銀染色35 min，之后在凝膠成像儀下觀察并照相，對進行基因分型。

1.6.5 PCR產(chǎn)物基因測序 隨機選取不同基因型的PCR產(chǎn)物，送至深圳泰樂德醫(yī)學檢驗實驗室測序分析，驗證電泳結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 3組臨床資料比較 3組性別、年齡、TC、TG、LDL-C、HDL-C、FBG、Cr、ALT、AST比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。腦梗死組和H型高血壓首發(fā)腦梗死組收縮壓、舒張壓、脈壓均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；腦梗死組收縮壓、舒張壓、脈壓均高于H型高血壓首發(fā)腦梗死組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表1。

2.2 基因PCR檢測及基因型結(jié)果 PCR擴增后，得到198 bp的片段。經(jīng)過限制性內(nèi)切酶Hinf Ⅰ酶切后，凝膠成像儀發(fā)現(xiàn)3種基因型：野生CC基因型，即酶切后產(chǎn)生一個198 bp的片段，在成像儀下可見一個198 bp的條帶；純合突變TT基因型，即酶切后產(chǎn)生175 bp和23 bp 2個片段，在成像儀下僅見一個175 bp的條帶；雜合突變CT基因型，即酶切后產(chǎn)生198 bp、175 bp和23 bp 3個片段，在成像儀下僅見198 bp和175 bp的兩個條帶。詳見圖1。

圖1 各基因型PCR擴增圖

2.3 3組MTHFR C677T多態(tài)性基因型和等位基因頻率分布 各組3種基因型總體分布頻率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。腦梗死組和H型高血壓首發(fā)腦梗死組CC基因型頻率均低于對照組，TT、CT基因型頻率均高于對照組，等位基因T頻率高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。腦梗死組CC基因型頻率高于H型高血壓首發(fā)腦梗死組，CT基因型頻率低于H型高血壓首發(fā)腦梗死組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。H型高血壓首發(fā)腦梗死組等位基因T頻率高于等位基因C頻率，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 3組MTHFR C677T多態(tài)性基因型和等位基因頻率分布 單位：例(%)

2.4 3組促炎因子水平比較 H型高血壓首發(fā)腦梗死組血清IL-6、Hcy和CRP水平高于腦梗死組和對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；腦梗死組血清IL-6、Hcy和CRP水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 3組促炎因子水平比較(±s)

2.5 促炎因子與Hcy水平的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示：血清IL-6、CRP水平與Hcy水平呈正相關(guān)(r值分別為0.221，0.208，P<0.05)。

3 討 論

國際上將成年人空腹血漿Hcy水平>10 μmol/L定義為高同型半胱氨酸血癥，并將伴有高同型半胱氨酸血癥的原發(fā)性高血壓稱為H型高血壓[11]。多項研究表明，血漿Hcy與心腦血管疾病的發(fā)生風險密切相關(guān)，且高同型半胱氨酸血癥是心腦血管疾病發(fā)生的獨立危險因素，且高同型半胱氨酸血癥和高血壓在增加心腦血管病風險上具有協(xié)同作用，因此，H型高血壓病人易發(fā)生心腦血管疾病[12-13]。Hcy是一種人體內(nèi)的含硫氨基酸，是蛋氨酸和半胱氨酸代謝過程的中間產(chǎn)物，本身并不參與蛋白質(zhì)合成，其含量主要與遺傳、營養(yǎng)、雌激素水平、年齡等因素有關(guān)[14]，MTHFR、胱硫醚縮合酶(CBS)、甲硫氨酸合成酶(MS)3種關(guān)鍵酶缺乏或活性降低可影響Hcy代謝。目前臨床研究較多的是輕中度高同型半胱氨酸血癥，而MTHFR基因 C677T位點突變是發(fā)生高同型半胱氨酸血癥常見的一個遺傳因素[15]，主要機制：5-MTHF是Hcy主要代謝途徑中再甲基化過程的甲基供體，在MTHFR作用下由5，10-CH2-THF代謝生成；若MTHFR缺乏或活性下降，減少5-MTHF生成，抑制Hcy再甲基化過程，造成Hcy在細胞內(nèi)蓄積，從而導致Hcy濃度升高。

血糖、血脂異常是心血管疾病的主要危險因素，與動脈粥樣硬化具有共同的生物代謝基礎(chǔ)[16]。本研究結(jié)果顯示：H型高血壓首發(fā)腦梗死組和腦梗死組TC、TG、LDL-C、HDL-C、FBG、Cr、ALT、AST水平比較，差異無統(tǒng)計學意義。說明H型高血壓未導致病人血脂、血糖異常。目前，Hcy導致心血管疾病發(fā)生的機制尚未完全明確，可能與以下機制有關(guān)：①Hcy造成內(nèi)皮細胞功能失調(diào)，導致內(nèi)皮素過度分泌，可直接和間接促進一氧化氮合酶輔助因子氧化，從而導致一氧化氮濃度降低，血管舒張功能異常[17]。②Hcy可引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生過氧化氫和超氧化物，損傷內(nèi)皮細胞，降低轉(zhuǎn)甲基化反應(yīng)，促進平滑肌細胞增殖，激活粒細胞和血小板黏附、聚集[18]。③Hcy可產(chǎn)生過氧化氫和超氧化物，刺激平滑肌細胞增殖，導致血管內(nèi)膠原成分增加，微纖維成分減少，從而使血管壁增厚，并破壞血管順應(yīng)性。④Hcy可誘導腎動脈血管重構(gòu)，抑制胱硫醚-γ-裂合酶(CGL)活性，減少內(nèi)源性H2S生成，導致血管功能進一步受損[19]。MTHFR C677T基因多態(tài)性與高血壓、腦梗死易感性有關(guān)，TT、CT基因型可增加罹患高血壓及腦梗死風險[20]。本研究結(jié)果顯示，3組3種基因型總體分布頻率存在差異，且基因型分布以雜合突變CT基因型最多，與劉宇等[21]研究結(jié)果一致。腦梗死病人TT、CT基因型頻率及等位基因T頻率高于正常人群，所有腦梗死人群TT基因型Hcy水平高于CT基因型和CC基因型，說明TT基因型可能是腦梗死發(fā)生的風險基因型，攜帶等位基因T人群發(fā)生腦梗死可能性高于未攜帶人群。本研究結(jié)果顯示，H型高血壓首發(fā)腦梗死組CT基因型頻率高于腦梗死組，且CT基因型腦梗死發(fā)病率高于CC基因型和TT基因型，說明CT基因型可能是腦梗死病人發(fā)生H型高血壓的風險基因型。

H型高血壓病人存在高血壓及高同型半胱氨酸血癥心腦血管疾病的危險因素，雙重作用下可進一步活化炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進炎性因子釋放，從而損傷動脈血管內(nèi)皮細胞，導致動脈壁彈性降低，形成粥樣斑塊，與腦梗死的發(fā)生密切相關(guān)[22]。IL-6、Hcy、CRP是重要的炎性因子，具有強大的促炎活性，在機體免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用，可促進炎性細胞在血管內(nèi)膜浸潤及動脈粥樣硬化斑塊形成[23-24]。IL-6是一種多效應(yīng)細胞因子，主要參與適應(yīng)性免疫調(diào)控，且一定程度受IL-1β分泌的影響，在炎癥反應(yīng)急性期可抑制TNF-α合成[25]。本研究結(jié)果顯示，H型高血壓首發(fā)腦梗死組血清IL-6、Hcy、CRP水平均高于腦梗死組和對照組，且IL-6、CRP水平與Hcy呈正相關(guān)，說明高同型半胱氨酸血癥可過度激活炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)，并參與腦梗死病人H型高血壓發(fā)生過程。

綜上所述，H型高血壓首發(fā)腦梗死病人MTHFR C677T基因多態(tài)性與IL-6、Hcy、CRP水平有一定的相關(guān)性，且在高血壓首發(fā)腦梗死病人中進行Hcy水平檢測和MTHFR C677T基因多態(tài)性測定，有助于早期發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化，為心血管疾病的早期預(yù)防和危險人群的篩選提供新思路。