UFLC法測(cè)定齊墩果酸粘附膠囊有效成分含量

劉麗君

（重慶市第九人民醫(yī)院，重慶 400700）

齊墩果酸（簡(jiǎn)稱OA），在食用植物和藥用植物中分布廣泛[1-2]，市售原料藥的來源主要從含此類成分的中藥材中提取生產(chǎn)；OA 具有豐富的藥理作用[3]，臨床可應(yīng)用于多種疾病的防治，如：肝炎、“三高”、心腦血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、癌癥等[3-5]。而今市售齊墩果酸制劑較少，臨床療效沒有充分發(fā)揮。另外，筆者通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)齊墩果酸含量檢測(cè)方法主要是高效液相色譜法報(bào)道較多[4，6]，此方法檢測(cè)時(shí)間一般在10 min 以上，耗時(shí)較長(zhǎng)。因此，筆者研制了OA新粘附劑型，并建立超快速液相色譜法，縮短OA 粘附制劑中藥物含量的測(cè)定時(shí)間，為其制劑的質(zhì)量控制及其他類似成分的檢測(cè)提供科學(xué)依據(jù)與借鑒。

1 材料

1.1 儀器

超快速液相色譜儀（Prominence UFLC 型，LC-20A，日本島津公司），LC Solution 色譜工作站，超聲波清洗機(jī)（CQ250A-TS，上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)機(jī)械廠）。

1.2 藥物與試劑

齊墩果酸（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110709-201808）；齊墩果酸原料藥（貴州益康制藥有限公司，批號(hào)：20201105）、齊墩果酸粘附膠囊（含量：30 mg，批號(hào)：20200619，自制）；乙腈：色譜純；水：純凈水；其余試劑為分析純；藥用乳糖、聚乙烯比咯烷酮K30（上海運(yùn)宏化工輔料制劑技術(shù)有限公司）；羥丙甲基纖維素、卡伯姆（上?？房倒荆?。

2 方法與結(jié)果

2.1 OA 粘附制劑的制備流程

精密稱取卡波姆971：10 mg，HPMC K4M：40 mg，乳糖15 mg，將OA 原料藥30mg 加入其中，過80 目篩后混勻，8%聚乙烯吡咯烷酮k30（100 mL的95%乙醇溶液中含PVPk 308 g）制作軟材，20 目過篩制濕顆粒，45 ℃烘干后整粒，取95 mg 的顆粒裝膠囊即可[7]。共制備1 000 顆膠囊劑。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

（1）色譜柱：Onyx Monolithic C18 柱（規(guī)格：100 mm×4.6 mm；飛諾美公司）；

（2）以乙腈∶0.5%冰醋酸水溶液（80∶20）為流動(dòng)相，等度洗脫；

（3）流速：1.0 mL/min；

（4）檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；

（5）柱溫：35 ℃；

（6）進(jìn)樣體積：10 μL；

（7）理論塔板數(shù)按齊墩果酸的含量峰計(jì)算，均超過3 000。

（8）保留時(shí)間約為4.5 min，用外標(biāo)法進(jìn)行定量。

2.3 溶液的配制

2.3.1 對(duì)照品溶液

（A）取OA 標(biāo)準(zhǔn)品，精密稱定0.312 mg，置于量瓶中，加甲醇超聲溶解，配制成濃度為0.031 2 mg/ mL 的對(duì)照品溶液。

2.3.2 供試品溶液（B）

取樣品10 粒，傾出內(nèi)容物，混勻，研細(xì)，精密稱定30 mg 粉末于容量瓶中，加甲醇稀釋，超聲處理溶解，放冷濾過后，將續(xù)濾液1 mL 置于10 mL 容量瓶?jī)?nèi)，用甲醇稀釋制得濃度為0.03 mg/mL 的供試品溶液。

2.3.3 陰性供試品溶液（C）

按2.1 節(jié)制備除齊墩果酸原料藥外的陰性樣品，并按2.3.2 節(jié)制成陰性樣品溶液。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 專屬性試驗(yàn)

將對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性供試品溶液各注入超快速液相儀10 μL，按2.2 節(jié)進(jìn)樣分析。實(shí)驗(yàn)顯示：在此條件下，供試品溶液與對(duì)照品溶液保留時(shí)間一致，陰性供試品溶液在相應(yīng)位置無干擾。見圖 1。

圖1 UFLC 色譜圖Fig.1 UFLC chromatogram

2.4.2 線性關(guān)系考察

精密稱定OA 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品10 mg，置于10 mL 量瓶中，用甲醇超聲充分溶解后冷卻，制備濃度分別為0.001、0.005、0.015、0.025、0.035、0.045 mg/mL 的溶液，在“2.2”條件下測(cè)定，記錄縱坐標(biāo)峰面積Y，橫坐標(biāo)藥物濃度X，得回歸方程：Y= 2 958 513.51X+1 448.55（r= 0.999 2）。實(shí)驗(yàn)顯示：OA 在1～45 μg/ mL濃度范圍內(nèi)與其吸收度線性關(guān)系較好。

2.4.3 進(jìn)樣精密度實(shí)驗(yàn)

取2.3.1 節(jié)下同一樣品，用不同濃度制備的A溶液，在2.2 節(jié)條件下，分別注入U(xiǎn)FLC 液相色譜儀10 μL，持續(xù)測(cè)定6 次。結(jié)果顯示，按OA 吸收峰統(tǒng)計(jì)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD＜2.65%，提示儀器精密度較好。

2.4.4 耐用性考察

精密量取2.4.3 節(jié)的同一份供試品溶液，放置在室溫條件，分別于0、3、6、9、12、18 h 時(shí)，按2.2節(jié)色譜方法，注入10 μL 檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)得OA 平均峰面積RSD＜1.7%。試驗(yàn)結(jié)果提示：供試品的樣品溶液在18 h 內(nèi)都比較穩(wěn)定。

2.4.5 重復(fù)性考察

相同一個(gè)批次樣品（批號(hào)：2020619），按2.3.2節(jié)操作，精密量取樣品溶液，用UFLC 色譜儀吸取10 μL，檢測(cè)其峰面積大小，計(jì)算OA 的平均含量是29.42 mg/粒，RSD＜1%，試驗(yàn)結(jié)果顯示：本方法重復(fù)性良好。

2.4.6 加樣回收率考察

根據(jù)2.1 節(jié)不同成份配比，按照2.3.2 節(jié)方法，分別制備三種不同濃度梯度9 個(gè)平行樣品溶液，在2.2節(jié)條件下，精確量取各10 μL，注入色譜儀檢測(cè)，記錄其特征吸收峰面積，代入2.4.2 節(jié)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算OA 的濃度，統(tǒng)計(jì)加樣回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。實(shí)驗(yàn)顯示，本處方輔助用料不影響OA 的測(cè)定，試驗(yàn)回收率在98.64%、100.64%、99.6%，而其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差＜2%，表明此法精準(zhǔn)度良好。如表1所示。

表1 OA 回收率測(cè)定結(jié)果Tab.1 OA recovery measurement results

2.5 樣品的測(cè)定

取2.3.2 節(jié)10 份樣品分別注入U(xiǎn)FLC 色譜儀10 μL 進(jìn)行含量測(cè)定分析，記錄峰面積數(shù)據(jù)，以O(shè)A吸收主峰面積統(tǒng)計(jì)樣品溶液中齊墩果酸的含量，結(jié)果如表2所示。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=10）Tab.2 Sample content determination results（n=10）

3 討論

3.1 波長(zhǎng)的選擇

在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中筆者對(duì)OA 進(jìn)行了紫外掃描，發(fā)現(xiàn)OA 在吸收波長(zhǎng)205～210 nm 范圍內(nèi)有較強(qiáng)反應(yīng)；同時(shí)，流動(dòng)相使用的溶劑也有末端紫外吸收，為減少溶劑帶給齊墩果酸峰的影響，增加此試驗(yàn)的的靈敏度和可操作性，通過查閱有關(guān)研究[8-10]，筆者最終采用紫外210 nm 處的吸收波長(zhǎng)作為實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

3.2 色譜柱的篩選

為了達(dá)到所需的良好分離度，在前期中我們?cè)?jīng)采用Onyx Monolithic C18，Phenomenex Gemini C18 等型號(hào)色譜柱做對(duì)比試驗(yàn)，以柱效來評(píng)價(jià)優(yōu)劣，結(jié)果表明用Onyx Monolithic C18 柱不論從系統(tǒng)穩(wěn)定性、吸收峰形方面，還是從分離度好壞，齊墩果酸峰的理論塔板數(shù)方面，均表現(xiàn)較優(yōu)。藥物濃度與峰面積線性關(guān)系良好，精密度也符合測(cè)定要求。

3.3 流動(dòng)相的確定

為了得到流動(dòng)相的最佳組合，筆者又對(duì)乙腈或甲醇分別與不同濃度的甲酸銨、甲酸、磷酸等試劑進(jìn)行篩選重組；結(jié)果，以乙腈與0.5%的冰醋酸配比80∶20，其吸收峰形狀、分離度、響應(yīng)速率等均能達(dá)到最優(yōu)，且無雜質(zhì)影響；同時(shí)，樣品的測(cè)定周期較快，僅4.5 分鐘就可以出峰。

3.4 方法耐受性的試驗(yàn)

通過改變色譜條件包括改變柱溫、流速、流動(dòng)相比例以及改變色譜柱等來考察系統(tǒng)適應(yīng)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在改變色譜條件后，OA 的對(duì)稱因子與理論塔板數(shù)都變化不明顯，說明該制劑的分析測(cè)試不需要很苛刻的條件，一般的分析方法即可。

3.5 齊墩果酸溶解度的考察

為了獲得合適的助溶試劑，筆者對(duì)齊墩果酸的溶解性進(jìn)一步進(jìn)行評(píng)價(jià)[11]，通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)OA 在甲醇、無水乙醇中極易溶解、在丙二醇、丙三醇中易溶，在水中因極難溶解而超出其檢測(cè)限檢測(cè)不到。因此，考察其溶解性質(zhì)，對(duì)選擇溶劑有重要指導(dǎo)作用，在對(duì)齊墩果酸進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，可先用一定量甲醇助溶，再用溶出介質(zhì)稀釋至所需濃度。

3.6 齊墩果酸油/水分配系數(shù)（Papp）的測(cè)定

通過了解藥物在水和有機(jī)溶劑中的溶解性能，有助于預(yù)測(cè)藥物在體內(nèi)的吸收活性，此檢測(cè)試驗(yàn)對(duì)生物藥劑學(xué)和制劑設(shè)計(jì)具有重要的指導(dǎo)意義[12]。因此，筆者采用正辛醇—水體系測(cè)定OA 的油水分配系數(shù)，結(jié)果表明隨pH 值的增大系數(shù)變化不是特別明顯，說明齊墩果酸在不同生理pH 條件下相對(duì)穩(wěn)定。不會(huì)隨著pH 值的改變而改變，由logPapp結(jié)果可知，其脂溶性較強(qiáng)。但是藥物的吸收與P值的大小并不是簡(jiǎn)單地呈線性關(guān)系，因?yàn)樗€受分子量大小、化合物結(jié)構(gòu)及生物膜本身特性等諸多因素影響，實(shí)際的吸收情況還有待于進(jìn)一步考察。

3.7 齊墩果酸穩(wěn)定性的評(píng)價(jià)

筆者通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，OA 分別在pH 值為：1.0，3.0，4.5，6.8，7.8 數(shù)值下均較穩(wěn)定，這可能與其化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)，齊墩果酸為五環(huán)三萜類化合物，理化性質(zhì)較穩(wěn)定，幾乎不受酸、堿、酶的破壞和影響[13]。人體胃腸道正常生理范圍為胃：pH 值 1～3，十二指腸：pH 值 4～5，空腸和回腸：pH 值 6～7，大腸：pH 值7～8，由穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，OA 在胃腸道的生理pH 條件下均有很好的穩(wěn)定性。在生理pH 下齊墩果酸的表觀油/水分配系數(shù)Papp和logPapp值可用于預(yù)測(cè)胃腸道不同部位對(duì)藥物的吸收情況，而胃腸道最佳的吸收logPapp值范圍是0.5～2.0。試驗(yàn)研究結(jié)果表明，OA 在各生理pH 條件下的logPapp 值均大于2，說明其極性小，親脂性強(qiáng)，跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)吸收比較困難，這也是它胃腸道吸收較差的原因之一。

4 結(jié)論

通過上述各項(xiàng)試驗(yàn)，證明本文所建立UFLC 快速分析測(cè)試方法可作為齊墩果酸粘附膠囊有效成分含量的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。此法簡(jiǎn)單快捷，能很好地對(duì)該制劑進(jìn)行含量評(píng)價(jià)。同時(shí)，通過本文的論證也為含有齊墩果酸成分或其他相似成分的中草藥、保健品、食品與藥品等物質(zhì)的深入研究與開發(fā)提供重要的參考意義。