白脂素通過AC-cAMP通路調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞功能

尹婷婷,張雅楠,陳 勝,黃倩倩,姜姍姍,袁 媛,龍 鵬,黃起壬

(1.江西省基礎(chǔ)藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;2.南昌大學(xué)藥學(xué)院a.藥理學(xué)教研室;b.2018級,南昌 330006)

肥胖癥是一種能量代謝失衡的慢性營養(yǎng)性疾病,主要是由于脂肪組織過多聚積而導(dǎo)致。肥胖在全世界范圍內(nèi)廣泛流行,它與高血壓、動脈粥樣硬化、2型糖尿病(T2DM)和癌癥等許多代謝性疾病和心腦血管疾病發(fā)病密切相關(guān)[1]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),全球每年約有400萬人死于與肥胖相關(guān)的疾病,其中2/3死于心血管疾病,給社會和家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān),因此肥胖已經(jīng)成為一個緊迫的全球性公共衛(wèi)生問題。目前臨床上對肥胖的治療主要采取控制能量攝入和/或增加能量消耗的防治策略,采取節(jié)食、增加運(yùn)動、肥胖外科手術(shù)和藥物等治療措施,但上述手段可出現(xiàn)生活質(zhì)量降低、難于長期堅(jiān)持、肥胖反彈和藥物諸多的不良反應(yīng)等,收效甚微[2]。因此,尋找其他安全有效的治療途徑十分必要。

脂肪組織是一種重要的內(nèi)分泌器官,其間分布有密集的神經(jīng)組織、豐富的毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)及免疫細(xì)胞,它們共同構(gòu)成脂肪組織的微環(huán)境。在生理狀態(tài)下,脂肪微環(huán)境中的各成員間相互作用相互影響,共同維持微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[3]。若脂肪組織微環(huán)境穩(wěn)態(tài)遭到破壞,就會發(fā)生肥胖和心血管疾病[4]。Asprosin(ASP)由白色脂肪組織分泌的一種肽類激素,其在肥胖患者體內(nèi)水平較高[5]。生理劑量的ASP在維持機(jī)體葡萄糖和能量穩(wěn)態(tài)代謝中發(fā)揮著重要作用[6],但是病理性升高的ASP與心血管疾病、多囊卵巢綜合癥、癌癥、胰島素抵抗和糖尿病等代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7-8]。遺憾的是,脂肪組織分泌的ASP對血管內(nèi)皮功能的影響及其機(jī)制鮮有報(bào)道。本研究應(yīng)用不同濃度的ASP處理血管內(nèi)皮細(xì)胞,觀察ASP對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和血管新生的影響,并探究其是否通過腺苷酸環(huán)化酶(AC)-環(huán)磷酸腺苷(c-AMP)(AC-c AMP)通路調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能,以期為肥胖及肥胖相關(guān)心血管疾病的防治提供新的靶點(diǎn)。

1 材料

1.1 細(xì)胞株及血清培養(yǎng)基

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(HUVECs)購自美國ATCC(Catalog No:CRL1730),胎牛血清購自天津TBD公司,DMEM培養(yǎng)基購自北京索萊寶公司。

1.2 藥品及試劑

ASP購自上海強(qiáng)耀生物科技有限公司(規(guī)格:1.6 mg·m L-1,純度85%),一氧化氮(NO)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所(貨號:A013-2-1),SQ22536(SQ)購自美國APE公司(貨號:B6738),Matrigel基質(zhì)膠購自美國Corning公司(貨號:354248),血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)重組兔多克隆抗體購自杭州華安生物技術(shù)有限公司(貨號:ET1604-28),VEGF受體2(VEGFR2)兔多克隆抗體購自杭州華安生物技術(shù)有限公司(貨號:ER1706-99),eNOS鼠單克隆抗體購自美國CST公司(貨號:5880S),p-eNOS兔單克隆抗體購自美國CST公司(貨號:9570S),β-actin鼠多克隆抗體購自杭州弗德生物科技有限公司(貨號:FD0060)。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)1分為4組:Ctrl組(加入等體積的PBS),10、50、100 nmol·L-1濃度ASP組。

實(shí)驗(yàn)2應(yīng)用AC抑制劑SQ處理內(nèi)皮細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)分為:Ctrl組(加入等體積的PBS)、ASP組(ASP濃度為50 nmol·L-1)、SQ組(SQ濃度為0.25μmol·L-1)、SQ＋ASP組(SQ濃度為0.25μmol·L-1,ASP濃度為50 nmol·L-1)。

2.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

將80%融合的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)按實(shí)驗(yàn)1分組處理,每組設(shè)置3個孔。處理結(jié)束后,取出96孔板,用PBS緩沖液輕輕清洗2遍后,加入90μL無血清培養(yǎng)基。然后再向每個孔中加入10μL CCK-8溶液(避光操作),放入37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1～4 h;孵育結(jié)束后,在450 nm的波長處檢測各組的吸光度值(OD值)。

2.3 劃痕實(shí)驗(yàn)

將HUVECs以每孔2×105個接種于六孔板中,待細(xì)胞長至融合度為90%時,用200μL槍頭沿著預(yù)先畫好的直線劃細(xì)胞,棄培養(yǎng)液,PBS清洗;按實(shí)驗(yàn)1分組處理,用無血清培養(yǎng)基繼續(xù)放入培養(yǎng)箱孵育48 h。分別于倒置顯微鏡下,觀察細(xì)胞培養(yǎng)0、24和48 h時的愈合距離的變化并做好記錄。

2.4 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)

將HUVECs以每室2×104個接種于放置在24孔板中的8 mm Transwell小孔上室中,往其中加入200μL的無血清培養(yǎng)基,然后在24孔板的每孔中加入500μL的含10%血清培養(yǎng)基,按實(shí)驗(yàn)1分組處理,孵育48 h;48 h后取出24孔板,小心取出Transwell小室,棄去培養(yǎng)基,用PBS緩慢清洗,后用甲醇固定15 min,然后用0.1%結(jié)晶紫染色30 min,PBS洗掉染液后用棉簽小心輕輕擦去小孔上室未遷移的細(xì)胞;置于倒置顯微鏡下觀察,并計(jì)算PET膜下表面的細(xì)胞數(shù),取5個視野計(jì)數(shù)的平均值。

2.5 體外血管生成實(shí)驗(yàn)

把Matrigel放入4℃冰箱過夜,第2天待Matrigel凍融后,離心數(shù)分鐘。所有操作均在冰上進(jìn)行。Matrigel用預(yù)冷槍頭混合均勻,EP管提前預(yù)冷,每500μL分裝。96孔板提前預(yù)冷,每孔加入60μL Matrigel,避免產(chǎn)生氣泡,在37℃孵箱放置30 min。取長滿瓶底的HUVECs,先用胰酶消化,再用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。每孔加入50μL細(xì)胞重懸液,每孔約為2.5×104個細(xì)胞。按實(shí)驗(yàn)1分組處理,各組重復(fù)3孔。37℃孵箱孵育,4～8 h后在倒置顯微鏡下觀察。

2.6 qRT-PCR檢測mRNA表達(dá)水平

采用Trizol法提取實(shí)驗(yàn)1各組細(xì)胞的總RNA,隨后將提取到的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。引物序列見表1。PCR擴(kuò)增體系為20μL,其中cDNA為2μL,上下游引物各0.4μL,2×SYBR Green qPCR Master Mix 10μL,PCR循環(huán)數(shù)為42,95℃預(yù)變性15 min,95℃變性15 s,65.1℃退火15 s,72℃延伸30 s。通過qRT-PCR檢測VEGF、VEGFR2的m RNA的水平。

表1 引物序列

2.7 硝酸還原酶法

分別按實(shí)驗(yàn)1和實(shí)驗(yàn)2分組處理細(xì)胞,取各組細(xì)胞上清液至EP管中,分為空白管、標(biāo)準(zhǔn)管和測定管。按照試劑盒說明書操作,取樣本加試劑一200μL,充分混勻,加入試劑二100μL,渦旋充分混勻,然后靜置10 min,3500～4000 r·min-1,離心15 min,吸取上清液160μL于96孔板,再加入80μL顯色劑(顯色劑比例為試劑三∶試劑四∶試劑五＝2.5∶1∶1),混勻,注意不要有氣泡。室溫靜置15 min。用酶標(biāo)儀在550 nm處測定各孔吸光度(OD值),按照公式(測定OD值—空白OD值)/標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(20μmol·L-1)×稀釋倍數(shù)(4倍),計(jì)算NO濃度(μmol·L-1)。

2.8 Western blotting檢測

分別按實(shí)驗(yàn)1和實(shí)驗(yàn)2分組處理細(xì)胞后,棄去培養(yǎng)基后用PBS清洗細(xì)胞2次。使用現(xiàn)配的裂解液裂解細(xì)胞20 min。收集裂解液,離心得到細(xì)胞總蛋白,將總蛋白與上樣緩沖溶液按照一定比例混勻,后煮沸5～10 min。采用BCA蛋白定量法進(jìn)行蛋白定量。用10%的SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離,然后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。濕轉(zhuǎn)結(jié)束后將PVDF膜放入體積分?jǐn)?shù)為7%的脫脂牛奶中,在室溫?fù)u床封閉1.5 h,封閉結(jié)束后用TBST洗去PVDF膜表面牛奶,最后把PVDF膜放入對應(yīng)的一抗中(稀釋倍數(shù)為1∶1000),并置于4℃冰箱孵育過夜。次日將膜取出用TBST清洗,每次6 min,洗5次。清洗完成后,將PVDF膜放入對應(yīng)的二抗中(稀釋倍數(shù)為1∶2000),室溫置于搖床上2 h,TBST洗膜5次,每次6 min,最后用ECL化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測。將PVDF膜放置于Bio-Rad化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)儀中進(jìn)行顯影。最終圖片在Image-J軟件上進(jìn)行灰度值分析,將所得VEGF、VEGFR2、p-eNOS/eNOS蛋白帶的灰度值分別除以對應(yīng)組β-actin的灰度值后,輸入Excel表中。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad Prism 8.0,實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM)表示。2組間比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差(One way ANOVA)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 ASP對內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的影響

與Ctrl組相比,10 nmol·L-1ASP濃度時內(nèi)皮細(xì)胞增殖率和遷移率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),而50、100 nmol·L-1濃度時細(xì)胞增殖率和48 h細(xì)胞遷移率明顯增加,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),如圖1。結(jié)果表明,濃度為10 nmol·L-1的ASP對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移無明顯影響,而超生理濃度的ASP可促進(jìn)細(xì)胞的增殖與遷移。

圖1 不同濃度ASP對HUVECs增殖和遷移的影響(n＝3)

3.2 ASP對血管內(nèi)皮細(xì)胞浸潤侵襲的影響

與Ctrl組相比,10 nmol·L-1ASP濃度時血管內(nèi)皮細(xì)胞浸潤侵襲能力無明顯變化(P＞0.05),而50、100 nmol·L-1濃度時血管內(nèi)皮細(xì)胞的浸潤侵襲能力顯著升高(P＜0.05,P＜0.01),如圖2。

圖2 不同濃度ASP對HUVECs浸潤侵襲影響

3.3 ASP對血管內(nèi)皮細(xì)胞血管新生的影響

與Ctrl組相比,10 nmol·L-1ASP濃度時血管內(nèi)皮細(xì)胞血管新生能力無明顯變化(P＞0.05),而50、100 nmol·L-1濃度時內(nèi)皮細(xì)胞的微血管網(wǎng)絡(luò)交叉點(diǎn)和分支長度顯著增加,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,P＜0.01),如圖3。結(jié)果表明,超生理濃度的ASP可促進(jìn)體外血管的新生。

圖3 不同濃度ASP對HUVECs體外血管新生的影響

3.4 ASP對血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF和VEGFR2表達(dá)的影響

與Ctrl組相比,10 nmol·L-1ASP濃度時內(nèi)皮細(xì)胞的VEGF和VEGFR2表達(dá)量無顯著變化,而50、100 nmol·L-1濃度時內(nèi)皮細(xì)胞VEGF和VEGFR2蛋白和mRNA的表達(dá)量顯著增加,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,P＜0.01),如圖4。結(jié)果表明,超生理濃度的ASP可顯著增高VEGF和VEGFR2表達(dá)水平。

圖4 不同濃度的ASP對HUVECs中VEGFR2和VEGF蛋白和mRNA表達(dá)的影響(n＝3)

3.5 ASP對血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOS表達(dá)和NO分泌的影響

與Ctrl組相比,10 nmol·L-1ASP濃度時內(nèi)皮細(xì)胞p-eNOS/eNOS比率和NO水平無明顯變化,而50、100 nmol·L-1濃度時p-eNOS/eNOS比率和NO水平顯著增加,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01,P＜0.05),如圖5。結(jié)果顯示,超生理濃度的ASP促進(jìn)eNOS的磷酸化激活,增加NO的分泌。

圖5 不同濃度ASP對血管內(nèi)皮細(xì)胞p-eNOS/eNOS表達(dá)和NO水平的影響(n＝3)

3.6 ASP通過AC-c AMP通路調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮功能

與ASP組比較,SQ＋ASP組的VEGF和VEGFR2表達(dá)量、p-e NOS/e NOS和NO水平均降低,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,P＜0.01),如圖6。結(jié)果顯示ASP通過AC-c AMP通路調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能。

圖6 SQ對ASP誘導(dǎo)的VEGF-VEGFR2和eNOS-NO通路激活的影響(n＝3)

4 討論

脂肪是一個高度血管化的器官,脂肪組織的擴(kuò)張需要血管網(wǎng)絡(luò)不斷重塑[9]。脂肪組織中的血管生成有許多不同的可能觸發(fā)因素,血管生成的擴(kuò)張可能是由于脂肪細(xì)胞增殖或擴(kuò)大所發(fā)生的信號,也可能是由代謝信號觸發(fā)的。脂肪組織中的血管為脂肪生長與發(fā)育提供氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)等,血管生成是脂肪組織形成的限速步驟[10]。如果脂肪組織的擴(kuò)張沒有與毛細(xì)管網(wǎng)絡(luò)的生長充分并行,將會導(dǎo)致缺氧、炎癥和胰島素抵抗等一系列問題。有文獻(xiàn)報(bào)道,促進(jìn)血管生成可有效改善由脂肪細(xì)胞快速擴(kuò)張引起的局部缺氧、纖維化和炎癥[11]。將血管生長因子靶向遞送至脂肪組織可增強(qiáng)微血管生長,有效地逆轉(zhuǎn)肥胖、巨噬細(xì)胞浸潤和氧化應(yīng)激[12]。此外,脈管系統(tǒng)很可能促使脂肪細(xì)胞棕色化或米色化,增加其代謝活性,減少代謝疾病發(fā)生的風(fēng)險。更深入地了解脈管系統(tǒng)在脂肪組織中的作用,可能會為肥胖癥的治療提供一種全新的思路。

脂肪組織產(chǎn)生和分泌各種血管生成因子,如血管生成素-2、VEGF以及脂肪因子(瘦素、脂連素)等,影響和調(diào)節(jié)血管生成[13]。ASP是在2016年提出的一種成熟白色脂肪細(xì)胞分泌的蛋白類激素,正常的人體內(nèi)ASP的水平為10 nmol·L-1左右,生理濃度的ASP維持著人體的代謝平衡[5]。ASP主要由成熟脂肪細(xì)胞分泌,前脂肪細(xì)胞幾乎不分泌,且在肥胖人群ASP中含量增高,ASP水平與肥胖和胰島素抵抗成正相關(guān)[5]。本研究數(shù)據(jù)表明ASP在生理濃度時,ASP對內(nèi)皮細(xì)胞的的增殖、遷移及血管新生等無顯著影響,但當(dāng)ASP的濃度為50、100 nmol·L-1時,血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、體外成管均顯著增強(qiáng),這表明超生理濃度的ASP促進(jìn)微血管的生成,為脂肪組織擴(kuò)大或增生提供有利條件。

VEGF是血管生成的核心參與者,是最有利于血管生成的因子之一。VEGF的募集會刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖,直接導(dǎo)致血管生成[14]。VEGF與相應(yīng)的受體結(jié)合后,會激活細(xì)胞內(nèi)的PI3K/AKT通路。PI3K/AKT系列參與多種信號通路,調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和遷移,它與血管生成的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。AKT激活eNOS的下游,促進(jìn)NO釋放和eNOS的磷酸化,啟動內(nèi)皮細(xì)胞分裂、擴(kuò)散和遷移,并促進(jìn)血管生成[15]。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出,ASP會增加VEGF和VEGFR2的表達(dá)、促進(jìn)NO釋放及eNOS的磷酸化。更進(jìn)一步的證明,ASP是一種促進(jìn)內(nèi)皮增殖、遷移的脂肪因子。

ASP通過AC-c AMP通路一方面作用于肝臟促進(jìn)肝糖輸出升高血糖,另一方面作用于下丘腦促進(jìn)食欲引起肥胖[16]。由此推測ASP對血管內(nèi)皮的調(diào)控作用是否也通過此路徑,并應(yīng)用AC抑制劑SQ探究ASP是否通過AC-c AMP通路介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能。結(jié)果表明,加入SQ抑制劑的內(nèi)皮細(xì)胞組,VEGF、VEGFR2的表達(dá)量和eNOS的磷酸化水平顯著降低,表明ASP通過AC-c AMP調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能。

綜上所述,ASP可能是一種促進(jìn)血管新生的脂肪因子,而血管新生又是脂肪組織擴(kuò)展所必須的,這從側(cè)面證實(shí)了ASP與肥胖有密切的關(guān)系。由此,可把抑制ASP分泌或應(yīng)用ASP抗體作為治療肥胖的一種策略,為肥胖癥提供新的治療途徑。當(dāng)然本實(shí)驗(yàn)也存在一些不足,如只在細(xì)胞水平上檢測ASP對血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響,并未在動物水平上去探索ASP對血管功能及血管新生的影響。