肺腺癌預后相關壞死性凋亡基因標志物的構建及驗證

羅 亭,歐陽錦,余石群,曾凡凡,高麗云,黃邵鑫,汪 鑫

(1.南昌大學公共衛(wèi)生學院,江西省預防醫(yī)學重點實驗室,南昌 330006;2.九江學院基礎醫(yī)學院精準預防醫(yī)學實驗室,江西 九江 332000)

肺癌嚴重危害人們的健康和生命。2020年肺癌的發(fā)病率和病死率分別位居全球癌譜第二和第一位,且患者的5年生存率只有10%～20%[1]。2022年我國約有87萬肺癌新發(fā)病例和近77萬因肺癌死亡病例,而且肺癌在癌癥負擔中的比例最高[2]。根據(jù)病理類型,肺癌主要可以分為2大類:小細胞肺癌與非小細胞肺癌(NSCLC)。臨床上約85%的肺癌患者屬于NSCLC,而肺腺癌(LUAD)是NSCLC中最常見的組織學亞型[3]。盡管目前針對LUAD的綜合治療方法如化療、放療和分子靶向治療已經(jīng)被開發(fā)出來,但患者的總生存率仍然很低,復發(fā)率很高[4]。因此,尋找有效的LUAD預后標志物在其防治中具有重要意義。

許多腫瘤對細胞凋亡逐漸產(chǎn)生抗性,因此誘導凋亡以外的其他細胞死亡成為一種新的癌癥治療策略[5]。壞死性凋亡是一種新型的細胞程序性死亡,其中壞死性刺激所形成的壞死體在啟動壞死性凋亡過程中發(fā)揮關鍵作用,而受體互作蛋白(RIP)1和RIP3是壞死體的核心組成部分;在壞死體中,RIP3可引起混合譜系激酶樣結構域(MLKL)發(fā)生磷酸化,導致MLKL寡聚并轉運到質膜上,而在質膜上的MLKL可形成可滲透的離子通道,引起細胞變化,從而破壞質膜的完整性[6]。壞死性凋亡是一種高度炎癥性的細胞死亡形式,在癌癥的發(fā)生、發(fā)展和轉移中具有非常復雜的作用[7]。近期有研究[8]發(fā)現(xiàn),壞死性凋亡相關基因(NRGs)的表達水平可作為預測肺鱗狀細胞癌患者生存的重要指標。而壞死性凋亡基因是否可預測LUAD患者的預后,目前尚未見相關報道。本研究旨在通過公共數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)篩選和構建肺腺癌預后相關的壞死性凋亡基因標志物并對其進行驗證,為LUAD預后標志物庫的建立提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料來源

在KEGG通路數(shù)據(jù)庫(https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)中以關鍵詞“necroptosis”進行檢索篩選NRGs,共篩選出159個NRGs。通過UCSC xena網(wǎng) 站(https://xenabrowser.net/datapages)下載TCGA數(shù)據(jù)庫中LUAD樣本(LUAD組)和正常樣本(正常組)中NRGs的RNA測序數(shù)據(jù)和對應患者的臨床數(shù)據(jù),其中LUAD組487例,正常組58例。從GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中篩選出1個LUAD數(shù)據(jù)集(GSE31210),其中LUAD組226例、正常組20例。以TCGA-LUAD數(shù)據(jù)集作為訓練隊列,建立NRGs的LUAD預后標志物,另以GSE31210數(shù)據(jù)集作為驗證隊列,檢驗預后標志物的預測能力。

1.2 研究方法

1.2.1 差異表達NRGs的篩選與功能富集分析

采用R語言中的“DESeq2”和“l(fā)imma”R包分別對TCGA-LUAD數(shù)據(jù)集和GSE31210數(shù)據(jù)集中NRGs進行差異分析,按照|log2FC|＞1和調整后P＜0.05的標準從中篩選出差異表達的壞死性凋亡相關基因(DENRGs)。使用“cluster Profiler”R包對DENRGs進行GO、KEGG與GSEA功能富集分析。

1.2.2 與LUAD預后相關的NRGs的構建

在訓練隊列中,以OS為臨床終點,采用“survival”R包對DENRGs進行單因素Cox回歸分析,確定與LUAD預后相關的DENRGs;使用“glmnet”R包,采用Lasso Cox回歸篩選關鍵DENRGs;結合關鍵DENRGs的表達水平及其相應Lasso Cox回歸系數(shù),采用公式計算每個LUAD患者的風險評分并構建預后標志物。風險評分＝基因1表達水平×基因1系數(shù)＋基因2表達水平×基因2系數(shù)2＋……＋基因n表達水平×基因n系數(shù)。以風險評分的中位數(shù)作為分界點,將其分為低風險組和高風險組,使用“survival”R包對2組進行Kaplan-Meier生存分析以評估2組在OS上是否存在差異。log-rank統(tǒng)計方法檢驗其顯著性,“survminer”R包用于可視化。采用“timeROC”R包對預后標志物進行時間依賴受試者工作特征分析(timeROC),并使用“ggplot2”R包繪制ROC曲線。分析不同風險評分與患者的生存時間、生存狀態(tài)及預后標志物基因表達變化的關系,并繪制風險曲線三圖(曲線圖、生存狀態(tài)圖和熱圖)。同理,在驗證隊列中采用相同的基因和公式計算LUAD患者風險評分,并對其進行生存分析和timeROC分析,從外部驗證該預后標志物預測的準確性。

1.2.3 獨立預后分析和臨床預測列線圖的構建

采用“survival”R包對預后標志物和其他傳統(tǒng)臨床特征進行單因素和多因素Cox回歸分析,以評估預后標志物是否可以獨立預測LUAD患者的OS,“forestplot”R包用于結果的可視化。同時采用“survival ROC”R包對預后標志物和各項臨床特征做timeROC分析并進行可視化。結合生存時間、生存狀態(tài)、臨床因素和預后標志物的數(shù)據(jù),使用“rms”R包建立列線圖預測LUAD患者1、3、5年的生存率。通過一致性指數(shù)(C-index)和校準曲線評價該列線圖對LUAD患者預后的預測準確性。

1.2.4 統(tǒng)計學方法

使用R(http://www.R-project.org)軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析。所有統(tǒng)計檢驗均為雙側。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 差異表達的NRGs

差異表達分析顯示,LUAD組和正常組間有26個DENRGs表達存在差異,其中13個基因(PARP1、TRAF5、PGAM5、PLA2G4A、TRAF2、JAK3、CHAMP4C、CAMK2B、ZBP1、RNF103-CHMP3、PLA2G4D、IFNG、IFNB1)表達上調和13個基因(PLA2G4F、IL33、TLR4、CYBB、TNFAIP3、CAMK2A、PYGM、MAPK10、IL1B、ALOX15、IL1A、IFNA21、IFNA5)表達下調?；虿町惐磉_的火山圖見圖1A。箱線圖揭示了這些DENRGs在LUAD與正常組間的具體表達情況。見圖1B。

圖1 NRGs的差異表達分析

2.2 DENRGs的功能富集和通路分析

對26個DENRGs的GO功能注釋結果顯示:在生物過程中主要富集的條目包括“細胞因子介導的信號通路”、“白細胞增殖”和“適應性免疫反應的調節(jié)”;在細胞成分中主要富集于“細胞質膜的胞質側”;在分子功能方面,主要富集于“細胞因子受體結合”等條目。見圖2A。KEGG分析結果發(fā)現(xiàn),26個DENRGs參與的代謝通路主要有壞死性凋亡、結核病、核苷酸寡聚結構域樣受體信號通路以及脂質和動脈粥樣硬化。見圖2B。

圖2 DENRGs的功能富集與通路分析

2.3 NRGs相關LUAD預后標志物的構建與驗證

對DENRGs進行單因素Cox回歸分析篩選出6個與LUAD預后相關的基因(均P＜0.05)。見圖3A。Lasso Cox回歸分析顯示6個基因均與LUAD預后顯著相關,可直接用于構建預后標志物。見圖3B—C。風險評分顯示,高風險組(風險評分＞-0.581 3)243例、低風險組(風險評分≤-0.581 3)244例。Kaplan-Meier生存分析顯示,高風險組和低風險組中位生存時間分別為3.2年和4.7年,其差異有統(tǒng)計學意義(log-rankP＜0.001)。見圖3D。timeROC分析結果顯示:該預后標志物對LUAD患者1年、3年、5年生存率的AUC值分別為0.672、0.631和0.624。見圖3E。隨著風險評分的升高,LUAD患者的生存時間逐漸減少,PLA2G4F、IL33、TLR4和ALOX15基因的表達量呈下降趨勢,而RNF103.CHMP3和IL1A基因的表達量呈上升趨勢。見圖3F。

圖3 NRGs相關LUAD預后標志物的構建與驗證

2.4 預后標志物是LUAD患者中的獨立預后因子

單因素Cox回歸分析的結果發(fā)現(xiàn):預后標志物、腫瘤分期、T、N、M分期均與LUAD患者的OS相關。見圖4A。多因素Cox分析,只有預后標志物與LUAD患者OS顯著相關(HR:2.30,95%CI:1.30～4.00,P＜0.01)。見圖4B。timeROC分析顯示:預后標志物的AUC值(0.689)雖較低于腫瘤分期(0.712),但高于年齡(0.465)、性別(0.551)、腫瘤T(0.647)、N(0.666)、M(0.505)分期。見圖4C。

圖4 預后標志物的獨立預測分析

圖3(續(xù))

2.5 預測LUAD患者生存率的臨床列線圖

結合風險評分、腫瘤分期、T分期和N分期構建了一個臨床預測列線圖。見圖5A。對于1例特定LUAD患者,可根據(jù)該患者的這4個特征值分別向上畫1條垂直線,即可得到其對應的分數(shù)。最后將所有的分數(shù)相加得到總分,并以總分為基礎向下畫1條垂直線,即可得到該患者對應的未來1年、3年和5年的生存率。C-index分析顯示該列線圖總體的Cindex為:0.71(95%CI:0.68～0.75,P＜0.000 1),其1年、3年和5年校準曲線顯示該列線圖所估計的病死率與實際病死率接近。見圖5B—D。

圖5 預測LUAD患者生存率的臨床列線圖

2.6 GEO數(shù)據(jù)集中預后標志物的外部驗證

對GSE31210數(shù)據(jù)集中DENRGs的GSEA分析結果顯示:顯著富集的壞死性凋亡相關通路主要包括P53信號通路、通過NF-KB傳遞TNFA信號通路、凋亡通路、同種異體移植排斥和炎癥應答。見圖6A。風險評分顯示,高風險組(風險評分＞-0.458 1)113例、低風險組(風險評分≤-0.458 1)113例。Kaplan-Meier生存分析顯示高風險組的OS短于低風險組(log-rankP＜0.001),如圖6B所示。同時,ROC分析結果中其AUC值為0.750。見圖6C。

圖6 預后標志物的驗證

3 討論

目前LUAD的發(fā)病機制尚不明確[9],且其預后的影響因素眾多,故LUAD患者的預后不佳[10]。有研究[11]發(fā)現(xiàn)相比于單一的基因生物標志物,將多個生物標志物整合而成的綜合標志物可以提高對腫瘤預后的預測準確性,并有助于制定個體化治療計劃來改善預后。

壞死性凋亡是一種新型的非半胱天冬酶的程序性細胞死亡[12],在各種疾病中發(fā)揮重要作用[13]。壞死性凋亡在腫瘤中是一把“雙刃劍”[12]:一方面,壞死引起的炎癥環(huán)境會促進腫瘤的發(fā)展和轉移[14];另一方面,壞死可促進腫瘤微環(huán)境中樹突狀細胞的成熟和CD8＋T細胞的交叉激活,從而抑制腫瘤的發(fā)展[15]。

壞死性凋亡在LUAD發(fā)生和發(fā)展過程中的作用目前研究不多。本研究基于公共數(shù)據(jù)庫中LUAD患者測序數(shù)據(jù),從159個NRGs中篩選出6個與LUAD預后密切相關的基因,并成功構建綜合預后標志物。該預后標志物的AUC值均大于0.6,說明其不僅能夠預測LUAD患者的生存率,而且預測性能較好。同時,風險熱圖顯示PLA2G4F、IL33、TLR4和ALOX15對于LUAD可能是保護基因,而RNF103.CHMP3和IL1A基因則與LUAD預后不良相關。先前研究[16-20]也提示該預后標志物中的6個基因均與腫瘤相關。其中,IL1A、IL33和TLR4與NSCLC的發(fā)生發(fā)展密切相關;PLA2G4F在口腔癌的花生四烯酸代謝通路中發(fā)生了突變[16];RNF103.CHMP3基因在三陰性乳腺癌細胞中顯著下調;ALOX15的表達在結直腸癌中出現(xiàn)明顯下調[18];IL1A是NSCLC的診斷性生物標志物[19];IL-33可通過調控miR-128-3p/CDIP1信號通路從而促進NSCLC細胞的生長[20];TNF家族中的死亡受體TLR4與干擾素受體的結合可以觸發(fā)壞死[12],提示TLR4的表達可能與LUAD的預后不良相關。

本研究中單因素和多因素Cox回歸分析結果顯示該預后標志物的HR值均大于1,說明該預后標志物是影響LUAD患者OS的危險因素,在臨床實踐中可作為LUAD患者的重要獨立預測因子。此外,本研究基于該預后標志物結合臨床特征建立了預測列線圖,且該預測列線圖的校準曲線與標準曲線接近,說明該列線圖在預測LUAD患者的生存風險方面具有較高的準確度。而且GSE31210數(shù)據(jù)從外部驗證該預后標志物預測LUAD患者的預后具有較高的準確性。但是,后期研究應在臨床LUAD患者中進一步驗證該預后標志物的預測價值及穩(wěn)定性。

綜上所述,本研究成功構建NRGs相關的綜合預后標志物庫,可用于預測LUAD患者的預后,并通過GEO數(shù)據(jù)庫對該標志物庫加以驗證,結果表明其在預測LUAD患者預后方面具有較好的能力。