SBP2基因突變小鼠模型的制備及甲狀腺表型分析

趙 洋,丁 習(xí),呂宏軍,伍麗萍,鄧雪陽(yáng),浮 姣*

(1西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科,西安 710061;2中國(guó)藥科大學(xué)中藥藥理與中醫(yī)藥學(xué)系;*通訊作者,E-mail:jiao_fu@xjtufh.edu.cn)

硒代半胱氨酸插入序列結(jié)合蛋白2(selenocysteine insertion sequence-binding protein 2, SECISBP2)，又稱SBP2，是硒蛋白合成過程中硒代半胱氨酸插入所必需的反式作用因子[1]。SBP2基因缺陷可阻止硒代半胱氨酸的插入，從而影響硒蛋白的合成，引起一類以甲狀腺激素代謝缺陷為主要特征的臨床綜合征?；颊弑憩F(xiàn)為生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，并具有特殊的甲狀腺功能表型，即血清T4升高、T3降低、rT3升高，而TSH可為正常或輕度增高；重癥患者還可出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)和智力發(fā)育障礙，部分患者還伴有進(jìn)行性肌病、免疫缺陷、糖代謝異常、原發(fā)性不孕、皮膚光過敏以及雷諾氏病等多器官損害[2]。該病2005年首次報(bào)道[3]，迄今已發(fā)現(xiàn)至少9個(gè)患病家系[3-8]。然而，目前尚缺乏用于研究該病致病機(jī)制的突變敲入小鼠模型。

本研究嘗試?yán)猛粗亟M技術(shù)建立Sbp2基因突變小鼠模型以模擬患者的臨床表型。本研究選擇人SBP2 R128X突變[4](即小鼠Sbp2 R129X突變)和人SBP2 R770X突變[5](即小鼠Sbp2 R775X突變)作為轉(zhuǎn)基因位點(diǎn)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步建立R129X/R775X復(fù)合雜合突變小鼠，以模擬攜帶R120X/R770X復(fù)合雜合突變患者的臨床表型[5]。該小鼠模型的建立將不僅有助于研究SBP2基因缺陷復(fù)雜臨床癥候群的潛在機(jī)制，開發(fā)用于該病治療的新藥，同時(shí)對(duì)探索SBP2蛋白的潛在生物學(xué)功能具有深遠(yuǎn)意義。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、細(xì)胞系和主要試劑

野生型C57BL/6J小鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，SYXK-京20170033)；Flpdeletor轉(zhuǎn)基因小鼠B6.129S4-Gt(ROSA)26Sortm1(FLP1)Dym/RainJ strain(美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室，stock #009086)；小鼠胚胎干細(xì)胞R1(源自C57BL/6×C57BL/6-CP雜交F1代胚胎，核型XY)；DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)；RNA提取試劑盒、RT-PCR Mix、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green(大連寶生物工程有限公司)；Southern blot檢測(cè)試劑盒(深圳萊伯克生物科技有限公司)；限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ、MfeⅠ、EcoR Ⅰ、XbaⅠ和SpeⅠ(上海玉博生物科技有限公司)；血清TT4、TT3、TSH和rT3測(cè)定(天津市協(xié)和醫(yī)藥科技集團(tuán)有限公司)。

1.2 打靶載體的構(gòu)建

制備細(xì)菌人工染色體(bacterial artificial chromosomes, BAC)DNA，通過缺口修復(fù)法從BAC上亞克隆小鼠Sbp2基因組片段到pL253質(zhì)粒，采用同源重組技術(shù)通過同源臂擴(kuò)增引物引入Sbp2 R129X和Sbp2 R775X突變位點(diǎn)。線性化缺口修復(fù)載體，熱休克誘導(dǎo)λRed重組蛋白，電轉(zhuǎn)含有線性化缺口修復(fù)載體的菌株進(jìn)行同源重組，篩選重組質(zhì)粒用于顯微注射。Sbp2 R129X和R775X突變敲入打靶載體的示意圖見圖1。

紅色星號(hào)：突變位點(diǎn)；綠色長(zhǎng)方體：NeoR；紅色三角：LoxP位點(diǎn)；黃色橢圓：Frt位點(diǎn)；藍(lán)色長(zhǎng)方體：同源臂圖1 Sbp2 R129X和R775X突變敲入小鼠打靶載體示意圖Figure 1 Schematic diagrams of Sbp2 R129X and R775X mutant knock-in mouse targeting vectors

1.3 打靶載體電轉(zhuǎn)胚胎干細(xì)胞

取小鼠胚胎干細(xì)胞R1單細(xì)胞懸液800 μl，加入50 μg線性化打靶載體DNA，混勻后移入40 mm寬的無菌電穿孔杯中，用BioRad Gene Ⅱ電穿孔系統(tǒng)在240 V 500 μF條件下單脈沖激發(fā)，室溫靜置5 min，將細(xì)胞分入2個(gè)膠原化培養(yǎng)皿中，使細(xì)胞在非選擇型培養(yǎng)基中復(fù)蘇24 h，加入含200 μg/ml G418和2 μmol/L Gancyclovir的選擇性培養(yǎng)基，10 d后挑出藥物抗性克隆，PCR篩選陽(yáng)性克隆。

1.4 胚胎干細(xì)胞陽(yáng)性克隆的Southern blot篩選

設(shè)計(jì)用于Southern blot的5′端和3′端探針并選擇限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(見圖2)。Sbp2 R129X 5′端經(jīng)Hind Ⅲ內(nèi)切酶酶切，野生型等位基因?qū)a(chǎn)生一11.2 kb的片段，而發(fā)生同源重組的等位基因?qū)a(chǎn)生一8.9 kb片段；3′端采用MfeⅠ內(nèi)切酶酶切，野生型等位基因?qū)a(chǎn)生一6.5 kb的片段，而發(fā)生同源重組的等位基因產(chǎn)生一8.4 kb的片段。Sbp2 R775X 5′端經(jīng)SpeⅠ內(nèi)切酶酶切，野生型等位基因?qū)a(chǎn)生一12.1 kb的片段，而發(fā)生同源重組的等位基因?qū)a(chǎn)生一7.5 kb的片段；3′端仍利用SpeⅠ內(nèi)切酶酶切，野生型等位基因?qū)a(chǎn)生一12.1 kb的片段，而發(fā)生同源重組的等位基因?qū)a(chǎn)生一6.4 kb的片段。

利用地高辛標(biāo)記的dUTPs探針，提取胚胎干細(xì)胞克隆DNA，選用圖2所示的限制性內(nèi)切酶消化后，置于0.7%瓊脂糖凝膠緩慢過夜電泳(30～40 V)，毛細(xì)血管轉(zhuǎn)移法過夜轉(zhuǎn)膜，漂洗尼龍膜并用紫外交聯(lián)照射，與變性后的雙鏈DNA探針65 ℃過夜雜交，洗膜后曝光。

紅色星號(hào)：突變位點(diǎn)；紅色三角：LoxP位點(diǎn)；綠色長(zhǎng)方體：NeoR；黃色橢圓：Frt位點(diǎn)；藍(lán)色長(zhǎng)方體：同源臂圖2 Southern blot篩選胚胎干細(xì)胞陽(yáng)性克隆的探針及內(nèi)切酶位點(diǎn)示意圖Figure 2 Schematic diagrams of probes and endonuclease sites for screening embryonic stem cell positive clones by Southern blot

1.5 顯微注射及嵌合體小鼠的育種

經(jīng)Southern blot篩選正確同源重組的中靶胚胎干細(xì)胞克隆，通過囊胚顯微注射將中靶胚胎干細(xì)胞導(dǎo)入受體小鼠囊胚腔，使胚胎在代孕母體內(nèi)發(fā)育成熟，幼鼠斷乳后自尾部提取DNA，PCR鑒定攜帶外源基因的小鼠，稱為嵌合體小鼠。將嵌合體雄鼠與野生型(+/+)C57BL/6J雌鼠交配，獲得F1代雜合突變小鼠(m/+)。再將Flpdeletor工具雄鼠與F1代雜合突變雌鼠(m/+)交配，獲得F2代雜合突變小鼠(m/+)，再將F2代雜合突變雄鼠(m/+)與雌鼠(m/+)交配，獲得不同基因型的F3代小鼠用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 模型小鼠的低硒誘導(dǎo)

選取雄性和雌性F3代60日齡Sbp2 R129X和R775X雜合突變小鼠及野生型對(duì)照小鼠，低硒飼料(硒<0.01 mg/kg)喂養(yǎng)60 d，喂養(yǎng)30 d和60 d時(shí)每組隨機(jī)選取6只小鼠，解剖并留取血清和小鼠甲狀腺、肝臟、肌肉、脂肪、大腦等組織器官，迅速干冰冷卻后凍存于-80 ℃冰箱備用。

1.7 血清甲狀腺功能的測(cè)定

血清總甲狀腺素(total thyroxine, TT4)、總?cè)饧谞钕僭彼?total triiodothyronine, TT3)、促甲狀腺激素(thyroid-stimulating hormone, TSH)和反三碘甲狀腺原氨酸(reverse T3, rT3)水平利用放射性免疫法進(jìn)行測(cè)定，試劑盒購(gòu)自天津市協(xié)和醫(yī)藥科技集團(tuán)有限公司(批號(hào)：TT4 RA10102、TT3 RA10101、TSH RA10109和rT3 RA10107)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS16.0(Chicago, IL, USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組之間的差異符合正態(tài)分布者采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；多組之間的差異比較采用單因素方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Sbp2基因突變敲入小鼠模型的成功建立

Sbp2 R129X和R775X突變敲入打靶載體電轉(zhuǎn)入胚胎干細(xì)胞，經(jīng)藥物和PCR篩選分別獲得12和23個(gè)在5′端和3′端同時(shí)發(fā)生正確同源重組的陽(yáng)性克隆。利用Southern blot進(jìn)一步篩選陽(yáng)性克隆，Sbp2 R129X 5′端和3′端Southern blot雜交鑒定結(jié)果見圖3A和3B，選取3珠陽(yáng)性克隆(#76、#89和#146)放大培養(yǎng)后進(jìn)行囊胚顯微注射；Sbp2 R775X 5′端和3′端Southern blot雜交鑒定結(jié)果見圖3C和3D，選取3珠陽(yáng)性克隆(#26、#29和#103)放大培養(yǎng)后進(jìn)行囊胚顯微注射。

76，89，114，146和184為經(jīng)藥物和PCR篩選的陽(yáng)性克隆;14，15，19為野生型克隆對(duì)照；103，29，26，16，49為經(jīng)藥物和PCR篩選的陽(yáng)性克隆;4，5，6為野生型克隆對(duì)照?qǐng)D3 Southern Blot雜交鑒定篩選胚胎干細(xì)胞陽(yáng)性克隆Figure 3 Southern Blot identification and screening of embryonic stem cell positive clones

經(jīng)Southern Blot篩選后的陽(yáng)性胚胎干細(xì)胞克隆注射假孕母鼠囊胚腔，獲得36只Sbp2 R129X和27只Sbp2 R775X嵌合體雄鼠。按1.5的流程進(jìn)行育種，所獲得F3代小鼠各基因型的數(shù)量及比例見表1。F2代Sbp2 R129X雜合突變(R129X/+)雄鼠與雌鼠交配獲得的F3代小鼠共88只，其中野生型33只(+/+，37.5%)，雜合突變型55只(R129X/+，62.5%)，純合突變型0只(R129X/R129X，0.0%)；F2代Sbp2 R775X雜合突變(R775X/+)雄鼠與雌鼠交配后獲得的F3代小鼠共99只，其中野生型31只(+/+，31.3%)，雜合突變型68只(R775X/+，68.7%)，純合突變型(R775X/ R775X)0只；F2代Sbp2 R129X和R775X雜合突變(R129X/+和R775X/+)的雄鼠和雌鼠交配后獲得的F3代小鼠共71只，其中野生型25只(+/+，35%)，R129X雜合突變型21只(R129X/+，30%)，R775X雜合突變型25只(R775X/+，35%)，R129X/R775X復(fù)合雜合突變型(R129X/R775X)0只。上述結(jié)果顯示，所獲得的F3代小鼠無一例呈純合突變型或復(fù)合雜合突變型，提示其在胚胎期死亡。

2.2 低硒誘導(dǎo)Sbp2 R129X和R775X雜合突變小鼠的甲狀腺表型

SBP2基因缺陷呈常染色體隱性遺傳，然而與患者不同，Sbp2 R129X和R775X純合突變或復(fù)合雜合突變的小鼠均在胚胎期死亡，于是本研究首先對(duì)F3代Sbp2 R129X和R775X雜合突變小鼠的甲狀腺功能進(jìn)行了檢測(cè)，但是在充足硒喂養(yǎng)條件下其甲狀腺功能與野生型小鼠相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本研究進(jìn)一步嘗試限制Sbp2 R129X和R775X雜合突變小鼠的飲食硒攝入量，以評(píng)估硒缺乏是否可能加重雜合突變小鼠硒蛋白合成功能的缺陷而使其呈現(xiàn)患者的臨床表型。結(jié)果顯示，低硒誘導(dǎo)后Sbp2 R129X雜合突變雌鼠的血清T4、T4/T3和rT3均不同程度高于野生小鼠組，部分差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖4)。然而，低硒誘導(dǎo)對(duì)Sbp2 R129X雜合突變雄鼠的甲狀腺功能影響相對(duì)較小，僅低硒30 d時(shí)T4和rT3的增高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖5)。

表1 F3代小鼠各基因型的數(shù)量及比例 只(%)Table 1 Proportion of F3 generation model mice with different genotypes cases(%)

結(jié)果顯示，與野生雌鼠相比，低硒誘導(dǎo)Sbp2 R775X雜合突變雌鼠的血清T4、T4/T3和rT3均呈不同程度增高，其中T4和T4/T3的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖6)，符合SBP2缺陷患者的甲狀腺功能特點(diǎn)。同樣，與野生雄鼠相比，低硒誘導(dǎo)Sbp2 R775X雜合突變雄鼠的甲狀腺表型亦顯示與雌鼠相同的趨勢(shì)，其中低硒誘導(dǎo)30 d和60 d時(shí)T4/T3和rT3的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖7)。因此，Sbp2 R775X雜合突變雌鼠和雄鼠均可通過低硒飲食誘導(dǎo)顯示SBP2缺陷患者的甲狀腺表型。與R129X雜合突變小鼠相比，R775X雜合突變小鼠在低硒誘導(dǎo)下，顯示更為嚴(yán)重的甲狀腺表型。

與野生型比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001圖4 低硒誘導(dǎo)的Sbp2 R129X雜合突變雌鼠的甲狀腺功能Figure 4 Thyroid function of Sbp2 R129X heterozygous mutant female mice with low selenium food

與野生型比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001圖5 低硒誘導(dǎo)的Sbp2 R129X雜合突變雄鼠的甲狀腺功能Figure 5 Thyroid function of Sbp2 R129X heterozygous mutant male mice with low selenium food

與野生型比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001圖6 低硒誘導(dǎo)的Sbp2 R775X雜合突變雌鼠的甲狀腺功能Figure 6 Thyroid function of Sbp2 R775X heterozygous mutant female mice with low selenium food

與野生型比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001圖7 低硒誘導(dǎo)的Sbp2 R775X雜合突變雄鼠的甲狀腺功能Figure 7 Thyroid function of Sbp2 R775X heterozygous mutant male mice with low selenium food

3 討論

SBP2基因缺陷可引起一類以生長(zhǎng)發(fā)育遲緩和甲狀腺功能異常為特點(diǎn)的復(fù)雜臨床癥候群。SBP2是硒蛋白合成過程中硒代半胱氨酸插入的必需元素，由此推測(cè)患者的臨床表型很可能與硒蛋白功能的異常有關(guān)[2]。然而，25種硒蛋白在機(jī)體內(nèi)的合成存在特殊的“等級(jí)制度”，即當(dāng)硒蛋白合成過程受阻時(shí)，機(jī)體將優(yōu)先保證生物學(xué)功能重要的硒蛋白的合成[9,10]。因此，當(dāng)SBP2功能異常時(shí)，一些生物功能重要的硒蛋白仍然能夠正常合成。

為探究SBP2基因缺陷的潛在機(jī)制，本研究利用同源重組工程技術(shù)建立Sbp2基因突變敲入的小鼠模型。SBP2的羧基端是其主要的功能區(qū)域，包含硒代半胱氨酸插入序列(selenocysteine insertion sequence, SECIS)RNA結(jié)合和核糖體插入結(jié)構(gòu)域，在人和小鼠間高度同源；氨基端的功能尚有待闡明[1]。本研究分別選取位于氨基酸的R129X和位于羧基端的R775X突變位點(diǎn)，成功獲得了Sbp2 R129X和R775X雜合突變小鼠模型，然而R129X和R775X純合突變小鼠和復(fù)合雜合突變小鼠均在胚胎期死亡。與本研究結(jié)果類似，德國(guó)一研究團(tuán)隊(duì)利用基因捕獲技術(shù)成功建立了Sbp2基因敲除的小鼠模型，其純合敲除小鼠亦在原腸胚形成前死亡[11]。由此推測(cè)，呈常染色體隱性遺傳的SBP2基因缺陷患者體內(nèi)很可能不同程度地保留了SBP2的部分生物學(xué)功能。體外研究表明，攜帶K438X和IVS8ds29 G>A復(fù)合雜合突變的患者可保留24%的SBP2轉(zhuǎn)錄功能[3]。SBP2 R128X和R120X突變可從其下游的3個(gè)甲硫氨酸合成小亞型，從而使SBP2羧基末端的功能結(jié)構(gòu)域得到保留[4,5]。因此，SBP2基因缺陷患者所呈現(xiàn)的復(fù)雜臨床癥候群很可能是SBP2功能的部分保留，以及硒蛋白合成時(shí)的“等級(jí)制度”共同參與的結(jié)果。

為研究不同基因突變位點(diǎn)對(duì)SBP2功能的影響，本研究首先成功建立了Sbp2 R129X和R775X雜合突變小鼠模型，然而其在充足硒喂養(yǎng)條件下的甲狀腺功能與野生型小鼠無差異。為更好地模擬SBP2基因缺陷患者的臨床表型，本研究通過限制飲食硒的攝入量，進(jìn)一步阻礙Sbp2 R129X和R775X雜合突變小鼠硒蛋白的合成。結(jié)果顯示，與R129X雜合突變小鼠相比，R775X雜合突變小鼠在低硒誘導(dǎo)下，顯示更為典型的甲狀腺表型，即T4/T3、rT3和T4水平的增高。如前所述，位于SBP2基因氨基端的突變可從其下游的3個(gè)甲硫氨酸合成小亞型，從而使SBP2羧基末端的功能結(jié)構(gòu)域得到保留[4,5]，本研究中低硒誘導(dǎo)的R775X雜合突變小鼠較R129X雜合突變小鼠顯示更為典型的甲狀腺表型，此結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)Sbp2的主要功能區(qū)域位于其羧基端[1]。

本研究首次構(gòu)建了Sbp2基因突變敲入的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，其中低硒誘導(dǎo)的Sbp2 R775X雜合突變小鼠可基本模擬SBP2基因缺陷患者的甲狀腺表型。因此，該小鼠模型的構(gòu)建有利于研究SBP2基因缺陷對(duì)甲狀腺功能的影響及其作用機(jī)制，同時(shí)進(jìn)一步探討該基因突變對(duì)小鼠各器官系統(tǒng)功能的影響，以闡明該病復(fù)雜臨床癥候群的潛在機(jī)制，亦對(duì)探索SBP2的潛在生物學(xué)功能具有深遠(yuǎn)意義。