基于SIRT3/β-catenin/PPARγ信號通路探討丹皮酚對急性心肌梗死模型大鼠的治療作用

徐 明，侯 靜，趙麗娜

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是高發(fā)病率和高致死率的心血管疾病，因心肌缺血引起多種活性氧物質(zhì)生成增加，誘導(dǎo)體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生，并啟動(dòng)多種炎性因子、趨化因子大量表達(dá)，造成心肌細(xì)胞損傷及凋亡，臨床表現(xiàn)為持久劇烈的胸骨后疼痛及心肌酶活性增高，并常伴有心律失常，威脅病人生命安全[1-3]。AMI進(jìn)展過程中，沉默信息調(diào)節(jié)因子3(silent information regulator 3，SIRT3)/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)/過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ)信號通路在調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和炎性因子水平、保護(hù)心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞方面具有重要的作用[4]。丹皮酚是中藥牡丹皮中主要的酚酸類有效成分，具有改善血管內(nèi)皮功能、保護(hù)心肌細(xì)胞及抗炎、抗心律失常等藥理作用[5]，但丹皮酚與SIRT3/β-catenin/PPARγ信號通路的關(guān)系尚未明確。本研究通過建立AMI大鼠模型，觀察丹皮酚對大鼠AMI后的保護(hù)作用，基于SIRT3/β-catenin/PPARγ信號通路探討其作用機(jī)制，以期為臨床治療AMI的用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無特定病原體(SPF)級雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量200～220 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。動(dòng)物合格證號：202010208；動(dòng)物許可證號：SCXK(京)2020-2-006；動(dòng)物批號：202010108。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑 丹皮酚注射液(批號：20190603)購自寧波天真制藥有限公司；RIPA裂解液及二喹啉甲酸(BCA)試劑盒購于上海碧云天生物科技有限公司；卡托普利(批號：180102)購自江蘇平光制藥有限公司；白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒購自武漢EIAAb公司；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSP-Px)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；兔源β-actin抗體、兔抗SIRT3一抗、β-catenin抗體、兔抗PPARγ一抗及HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗購自美國Abbiotec公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 VisualSonics Vevo770 型動(dòng)物心臟超聲儀購自美國GE公司；AU2700 全自動(dòng)生物化學(xué)分析儀購自日本奧林巴斯公司；SW1022-ProfiBlot 48型全自動(dòng)蛋白印跡分析儀購自Bioneer公司；IX73倒置熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯光學(xué)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 AMI模型大鼠的建立 參照相關(guān)文獻(xiàn)[6]，采用左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎法建立AMI模型：50只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，10%水合氯醛腹腔麻醉，氣管插管后連接呼吸機(jī)并監(jiān)測心率，在左側(cè)第3肋間、第4肋間橫向切開皮膚1 cm左右，打開胸腔暴露心臟，采用4號縫合線在左冠狀動(dòng)脈前降支起源2～3 mm處結(jié)扎；另設(shè)10只SD大鼠作為假手術(shù)組，只穿線不結(jié)扎。若此時(shí)心電圖提示胸導(dǎo)ST段弓背向上抬高、T波高聳及QRS波電壓增高伴波幅增寬提示結(jié)扎建模成功，之后將心臟送回胸腔并縫合胸壁，待大鼠生命體征穩(wěn)定后再撤掉呼吸機(jī)，建模大鼠連續(xù)3 d腹腔注射青霉素鈉20×104U預(yù)防感染，每日1次。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 將上述建模成功的SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、卡托普利組、丹皮酚低劑量組、丹皮酚中劑量和丹皮酚高劑量組，每組10只；另設(shè)10只健康雄性SD大鼠為對照組。建模成功后開始進(jìn)行丹皮酚及陽性藥干預(yù)，連續(xù)2周，每日1次，依次給予4 mg/kg、8 mg/kg、16 mg/kg的丹皮酚和10 mg/kg的卡托普利灌胃；對照組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃。末次給藥后次日，空腹12 h后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測定。

1.2.3 心功能指標(biāo)測定 末次給藥后次日采用多普勒超聲診斷儀測量大鼠左室功能。參照相關(guān)文獻(xiàn)[7]，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，取仰臥位將大鼠固定在操作臺上，使用超聲心動(dòng)儀及高頻探頭行超聲心動(dòng)圖檢查，指標(biāo)包括左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左室短軸縮短率(LVFS)和左室質(zhì)量指數(shù)(LVMI)。

1.2.4 蘇木精-伊紅(HE)染色檢測大鼠心臟組織病理學(xué)變化 各組大鼠心功能檢測結(jié)束后，迅速分離冠狀動(dòng)脈及左心室組織，參照相關(guān)文獻(xiàn)[8]進(jìn)行HE染色：4%甲醛溶液固定24 h，二甲苯透明，石蠟包埋，蘇木素及伊紅染色，利用光學(xué)顯微鏡觀察心肌組織病理學(xué)改變，并進(jìn)行圖像采集。

1.2.5 血清心肌損傷指標(biāo)檢測 各組大鼠超聲心動(dòng)圖檢測完成后，使用負(fù)壓管心尖穿刺法取血，血樣于4 ℃靜置20 min后，以2 000 r/min離心20 min，之后抽取上清，分裝后于-80 ℃保存待測。采用全自動(dòng)生化分析儀檢測血清肌酸激酶(creatine kinase，CK)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme，CK-MB)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)水平及心肌肌鈣蛋白T(cardiac troponin T，cTnT)和心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)水平[9]。

1.2.6 血清炎性因子水平測定 根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒說明書，檢測各組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量[10]。每孔中加入10 μL樣品及40 μL樣本稀釋液，采用酶標(biāo)儀于450 nm處測量吸光度并按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算IL-1β、IL-6、TNF-α濃度。

1.2.7 心肌組織氧化損傷指標(biāo)測定 分離上述各組大鼠左心室梗死邊緣區(qū)心肌組織，參照相關(guān)文獻(xiàn)[11]制備心肌勻漿：勻漿器中，按照心肌質(zhì)量/體積為1∶9加入預(yù)冷的生理鹽水，制備成10%心肌組織勻漿，以3 500 r/min 4 ℃離心20 min，之后取上清液，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，采用ELISA檢測心肌組織MDA、SOD、GSP-Px水平。

1.2.8 心肌組織SIRT3/β-catenin/PPARγ信號通路蛋白的測定 分離上述各組大鼠左心室心肌組織，參照相關(guān)文獻(xiàn)[12]制備左心室心肌勻漿，RIPA裂解后提取心肌總蛋白，BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。之后常規(guī)上樣、聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉，隨后依次加入兔源單克隆SIRT3(1∶500)、β-catenin(1∶500)、PPARγ(1∶500)、pAkt(1∶500)、GAPDH(1∶500)一抗及辣根過氧化物酶標(biāo)志鼠抗兔二抗(1∶2 000)，化學(xué)底物發(fā)光法顯色，圖像掃描分析，采用Image-QuaNT軟件測量其光密度，以GAPDH為內(nèi)參對照分析。

2 結(jié) 果

2.1 丹皮酚對AMI大鼠心功能的影響 與對照組比較，模型組、卡托普利組和丹皮酚各劑量組LVEF、LVFS降低(P<0.01)，LVMI增加(P<0.05)。與模型組比較，卡托普利組及丹皮酚中劑量組、丹皮酚高劑量組LVEF、LVFS增加(P<0.05或P<0.01)，LVMI降低(P<0.05)，且隨著丹皮酚劑量增加，大鼠LVEF、LVFS及LVMI改善明顯。丹皮酚低劑量組LVEF、LVFS較模型組增加(P<0.05)。詳見表1。

表1 丹皮酚對AMI大鼠心功能的影響(±s)

2.2 丹皮酚對AMI大鼠左室組織病理學(xué)的影響 對照組左室心肌組織心肌橫紋清晰，細(xì)胞排列整齊規(guī)則，無纖維斷裂及炎性細(xì)胞浸潤。模型組大鼠心肌組織可見心肌纖維腫脹斷裂，細(xì)胞排列紊亂，心肌間質(zhì)可見大量炎性細(xì)胞浸潤，并出現(xiàn)明顯的心肌細(xì)胞壞死。與模型組比較，卡托普利組及丹皮酚高劑量組心肌細(xì)胞排列較整齊，心肌橫紋無明顯改變，心肌間質(zhì)存在輕度炎性細(xì)胞浸潤；丹皮酚中劑量組可見少量心肌纖維腫脹，心肌細(xì)胞有炎性細(xì)胞浸潤，細(xì)胞呈輕度腫脹；丹皮酚低劑量組心肌細(xì)胞排列、心肌纖維腫脹及炎性細(xì)胞浸潤均有一定改善。詳見圖1。

圖1 各組大鼠左室組織病理學(xué)光鏡圖

2.3 丹皮酚對AMI大鼠血清心肌損傷指標(biāo)的影響 與對照組比較，模型組、卡托普利組及丹皮酚各劑量組血清CK、CK-MB、LDH及cTnT、cTnI水平均增加(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較，卡托普利組及丹皮酚各劑量組血清CK、CK-MB、LDH及cTnT、cTnI水平均降低(P<0.05或P<0.01)，且隨著丹皮酚劑量增加，大鼠體內(nèi)CK、CK-MB、LDH及cTnT、cTnI水平逐漸降低。詳見表2。

表2 丹皮酚對AMI大鼠血清心肌損傷指標(biāo)的影響(±s)

2.4 丹皮酚對AMI大鼠血清炎性因子水平的影響 與對照組比較，模型組、卡托普利組及丹皮酚各劑量組血清IL-1β、IL-6及TNF-α水平均增加(P<0.01)。與模型組比較，卡托普利組及丹皮酚各劑量組血清IL-1β、IL-6及TNF-α水平均降低(P<0.05或P<0.01)，且隨著丹皮酚劑量增加，大鼠體內(nèi)血清IL-1β、IL-6及TNF-α水平逐漸降低。詳見表3。

表3 丹皮酚對AMI大鼠血清炎性因子水平的影響(±s) 單位：ng/L

2.5 丹皮酚對AMI大鼠心肌組織氧化損傷指標(biāo)的影響 與對照組比較，模型組、卡托普利組及丹皮酚各劑量組心肌SOD、GSP-Px水平均降低(P<0.05或P<0.01)，MDA增加(P<0.05)。與模型組比較，卡托普利組及丹皮酚中劑量組、丹皮酚高劑量組心肌SOD、GSP-Px水平均增加(P<0.01)，MDA降低(P<0.05)，且隨著丹皮酚劑量增加，大鼠SOD、GSP-Px及MDA水平明顯改善。丹皮酚低劑量組GSP-Px水平較模型組增加(P<0.05)。詳見表4。

表4 丹皮酚對AMI大鼠心肌組織氧化損傷指標(biāo)的影響(±s)

2.6 丹皮酚對AMI大鼠心肌組織SIRT3/β-catenin/PPARγ信號通路的影響 與對照組比較，模型組、卡托普利組及丹皮酚各劑量組心肌SIRT3、β-catenin及PPARγ相對表達(dá)量均增加(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較，卡托普利組及丹皮酚中劑量組、丹皮酚高劑量組心肌SIRT3和β-catenin相對表達(dá)量均增加(P<0.05)，PPARγ相對表達(dá)量均降低(P<0.05)，且隨著丹皮酚劑量變化，大鼠SIRT3、β-catenin及PPARγ表達(dá)量變化量越明顯。詳見表5。

表5 丹皮酚對AMI大鼠心肌組織SIRT3/β-catenin/PPARγ信號通路蛋白的影響(±s)

3 討 論

AMI多由動(dòng)脈粥樣硬化斑塊脫落聚集形成血栓，冠狀動(dòng)脈血流中斷所致，進(jìn)而引起心肌缺血缺氧，心功能受損[13]。中藥作為我國特有的醫(yī)藥寶庫，從中尋找可有效抑制AMI后心肌組織損傷的藥物意義重大。丹皮酚作為傳統(tǒng)中藥牡丹皮的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化、改善心血管疾病等藥理作用[14]。本研究結(jié)果顯示，AMI模型大鼠經(jīng)丹皮酚干預(yù)后LVEF、LVFS增加，LVMI降低，提示丹皮酚可改善左室收縮功能和心肌收縮力，提高心排血量，與相關(guān)報(bào)道[15]一致；組織形態(tài)學(xué)證實(shí)丹皮酚對心肌的保護(hù)作用，丹皮酚干預(yù)可減輕心肌細(xì)胞炎癥浸潤及水腫，抑制AMI模型大鼠心肌病理性改變。CK、CK-MB、LDH及cTnT、cTnI作為心肌損傷敏感的生物標(biāo)志物，心肌發(fā)生缺血損傷時(shí)，血液中上述特異性心肌酶升高[16]，經(jīng)丹皮酚干預(yù)后，AMI模型大鼠CK、CK-MB、LDH及cTnT、cTnI水平均減低，提示丹皮酚具有心臟保護(hù)作用，可對抗AMI所致心臟損傷。

AMI后心肌損傷與氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)引起的心肌細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。心肌梗死發(fā)生時(shí)，心肌線粒體氧自由基損傷產(chǎn)生大量脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)物MDA，并不斷消耗胞漿SOD、GSH-Px等抗氧化酶，伴隨大量IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子產(chǎn)生，因此，治療AMI的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[17-18]。為揭示丹皮酚對AMI大鼠的保護(hù)作用機(jī)制，本研究檢測了血清氧化應(yīng)激指標(biāo)、炎性因子變化情況，結(jié)果顯示，AMI模型大鼠經(jīng)丹皮酚干預(yù)后血清IL-1β、IL-6及TNF-α水平均減低，心肌SOD、GSP-Px水平均增加、MDA降低，證明丹皮酚通過提高SOD、GSH-PX及降低MDA水平，減輕AMI過程中氧化應(yīng)激誘發(fā)的心肌損傷，同時(shí)降低炎性因子水平，緩解AMI進(jìn)程。

SIRT3作為一種去乙?；福c心肌肥厚和心肌梗死關(guān)系密切，SIRT3基因敲除后心血管平滑肌增殖加快，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化及AMI發(fā)生[19]。SIRT3與β-catenin相互調(diào)控促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并與PPARγ核受體結(jié)合參與糖脂代謝、炎癥反應(yīng)、脂肪細(xì)胞分化等多種生命活動(dòng)，且抑制PPARγ，激活SIRT3/β-catenin表達(dá)，可能有益于改善動(dòng)脈粥樣硬化中的炎癥反應(yīng)[20]。有研究顯示，調(diào)節(jié)SIRT3/β-catenin/PPARγ信號通路可改善AMI大鼠心室重構(gòu)，降低炎癥反應(yīng)，發(fā)揮心肌保護(hù)作用[4]。本研究中，AMI模型大鼠經(jīng)丹皮酚干預(yù)后心肌SIRT3及β-catenin相對表達(dá)量均增加，PPARγ相對表達(dá)量均降低，表明AMI大鼠給予丹皮酚干預(yù)后可下調(diào)PPARγ，激活SIRT3及β-catenin表達(dá)，減輕AMI大鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)，從而保護(hù)心肌細(xì)胞。

綜上所述，丹皮酚可改善AMI大鼠心功能，抑制氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，其作用可能與調(diào)控心肌組織SIRT3/β-catenin/PPARγ通路活性有關(guān)。