神經(jīng)生長因子對脛骨骨折大鼠骨力學、骨強度及骨橋蛋白及下游相關(guān)因子水平的影響

王曉晨，胡海燕，向繼林，譚曉秋

中國每年約有440萬人經(jīng)歷過創(chuàng)傷性骨折，且骨折發(fā)生率呈上升趨勢[1-2]。骨折愈合過程一直受到學者們關(guān)注，5%～10%的骨折患者存在骨折愈合不良情況[3]。臨床研究[4]發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元損傷可導致骨折斷端骨痂過度生長甚至在肌肉中出現(xiàn)異位骨化，說明神經(jīng)因子對骨折愈合有影響。隨著研究的不斷深入，神經(jīng)營養(yǎng)因子促進骨折愈合的作用逐漸得到證實[5]。神經(jīng)營養(yǎng)因子是一類對神經(jīng)元的發(fā)育、存活和凋亡起重要作用的蛋白質(zhì)，神經(jīng)生長因子(NGF)是神經(jīng)營養(yǎng)因子中被發(fā)現(xiàn)最早的，具有神經(jīng)元營養(yǎng)和促突起生長雙重生物學功能的一種神經(jīng)細胞生長調(diào)控因子，它對中樞及周圍神經(jīng)元的發(fā)育、生長等表達有重要調(diào)控作用。已有研究[6-7]證實，NGF通過促進大鼠骨形態(tài)發(fā)生蛋白2和血管內(nèi)皮生長因子表達，誘導成骨細胞增殖，從而促進脛骨骨折愈合。骨橋蛋白(OPN)是一種蛋白質(zhì)，參與了組織修復、自身代謝等。關(guān)于NGF的具體作用機制及對OPN的影響等暫未可知。因此，本實驗給予脛骨骨折大鼠NGF，觀察其對骨生物力學、骨強度、OPN及下游相關(guān)因子水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物42只SPF級SD雌性懷孕大鼠，由湖南斯萊克景達實驗動物公司提供，動物合格證SCXK(湘)2017-0025，體重270～390(330±120) g。分籠飼養(yǎng)于溫度19～25(23±6)℃、濕度45%～50%、12 h明暗交替的實驗動物中心。產(chǎn)后24 h內(nèi)進行實驗。實驗動物符合《實驗動物管理條例》規(guī)定，本研究符合四川省骨科醫(yī)院動物倫理委員會要求。

1.2 儀器、試劑及藥物萬能材料力學測試機購于濟南中路昌試驗機制造公司；Hologic型雙能X線骨密度儀購于上海企晟醫(yī)療器械公司；蛋白電泳儀購于北京德元國際科技公司；一抗、二抗均購于上海高創(chuàng)化學科技有限公司；NGF凍干粉購于武漢益普生物科技公司。

1.3 分組和建模將42只大鼠按照隨機數(shù)字表法分為生理鹽水組(A組)和NGF組(B組)，每組21只。脛骨骨折模型的建立：42只大鼠用2%戊巴比妥鈉麻醉，仰臥位于手術(shù)臺，固定右下肢，脫毛，常規(guī)消毒，在脛骨結(jié)節(jié)上方2 mm處做長1.5 cm的縱向切口，切開皮膚、皮下組織，暴露上半段脛骨，剝離肌肉，于脛骨結(jié)節(jié)下1.0 cm處橫行切斷脛骨，以? 1 mm克氏針做髓內(nèi)固定，逐層閉合切口。術(shù)后持續(xù)3 d給予大鼠肌肉注射共10萬U青霉素。

1.4 干預方法建模后第2天，B組每天用2 ml生理鹽水稀釋NGF并肌肉注射0.2 ml，注射部位為兩側(cè)腓腸肌，連用2周。A組以相同的方法肌肉注射等量生理鹽水。

1.5 觀察指標術(shù)后第 1、3、5 周分別從兩組中隨機各選取7只大鼠麻醉后處死，記錄相關(guān)觀察指標。

1.5.1骨痂大小、骨折愈合情況 攝右側(cè)脛骨骨折處X線片，觀察骨痂大小、骨折愈合情況。

1.5.2骨生物力學相關(guān)指標 取大鼠右側(cè)脛骨，仔細剔除軟組織及關(guān)節(jié)突起，在不損害骨痂的前提下采用粗砂紙打磨使骨表面平滑。取出“1.3”項目中插入的克氏針，采用萬能材料力學測試機檢測其3點彎曲生物力學指標。將大鼠的長柱體脛骨放置在試驗機支座上以1.0 mm/s的速度給予脛骨骨痂加壓力載荷至斷裂，測試系統(tǒng)自動記錄載荷變形曲線，根據(jù)曲線得到脛骨在受彎情況下的最大載荷、彈性載荷和最大撓度等生物力學檢測指標。

1.5.3脛骨骨強度相關(guān)指標 取大鼠右側(cè)脛骨，采用Hologic型雙能X線骨密度儀測量脛骨組織骨密度(BMD)和骨礦含量(BMC)。

1.5.4脛骨骨折形態(tài) 分離脛骨組織，剔除表面多余組織后進行固定和脫鈣，自來水沖洗,乙醇脫水，二甲苯固定,石蠟包埋,切片,二甲苯脫蠟,乙醇水化,HE染色,鹽酸乙醇溶液中分化,自來水沖洗返藍,伊紅染色，中性樹膠進行封片，顯微鏡下觀察脛骨骨折形態(tài)變化。

1.5.5Western blot法檢測脛骨組織OPN和局部黏著斑激酶(FAK)蛋白表達 取大鼠100 mg右側(cè)脛骨的組織，裂解后提取總的核蛋白，并測量核蛋白濃度，分裝后低溫保存。將提取出的蛋白溶液和緩沖溶液按照4 ∶1的比例進行混勻，然后進行SDS-PAGE凝膠電泳。在電泳板內(nèi)注入50 μl的蛋白混合液進行電泳處理，然后將處理后的蛋白混合液轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，在組織中加入脫脂奶粉后封閉1 h。把一抗OPN(1 ∶500)和FAK(1 ∶500)加入其中，用磷酸鹽緩沖液(PBS)進行漂洗，每次漂洗10 min，共漂洗3次，最后加入二抗稀釋溶液，室溫下再次封閉1 h。把PVDF膜取出后，再次用TBST(Tris-HCl+NaCl+吐溫20)緩沖液進行漂洗，每次漂洗10 min，共漂洗3次，經(jīng)顯色等步驟用成像系統(tǒng)對印跡條帶的光密度進行分析。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參。

圖1 兩組大鼠右側(cè)脛骨骨折處術(shù)后不同時間的X線檢查結(jié)果

2 結(jié)果

2.1 兩組骨痂大小、骨折愈合情況比較見圖1。① 術(shù)后1周：A組骨折線仍清晰可見，未見明顯骨痂生長；B組骨折線模糊，可見骨痂形成。② 術(shù)后3周：A組可見斷端骨痂形成，骨痂未完全連接骨折兩端，骨痂較B組明顯??；B組骨折線模糊，骨折斷端大量骨痂，骨痂連接骨折兩端。③ 術(shù)后5周：A組仍可見模糊骨折線，骨痂連接骨折兩端，骨痂重塑未完成；B組脛骨骨折基本完成重塑，骨折線消失，骨折愈合。兩組結(jié)果比較顯示，B組大鼠骨折愈合更快，更早地完成了骨痂重塑，且愈合過程中形成的骨痂更大。

2.2 兩組生物力學檢測結(jié)果比較見表1。最大載荷、彈性載荷、最大撓度：術(shù)后1、3、5周B組均明顯大于A組(P<0.05)；A組術(shù)后各時間點比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；B組隨時間推移逐步升高(P<0.05)。

表1 兩組大鼠生物力學檢測結(jié)果比較

2.3 兩組脛骨骨強度比較見表2。① BMD：術(shù)后1、3、5周B組均明顯大于A組(P<0.05)；A組術(shù)后各時間點比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；B組隨時間推移逐步升高(P<0.05)。② BMC：術(shù)后1、3、5周B組均明顯少于A組(P<0.05)；A組術(shù)后各時間點比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；B組隨時間推移逐步降低(P<0.05)。

表2 兩組大鼠脛骨骨強度比較

2.4 兩組脛骨骨折形態(tài)比較見圖2。① 第1周：A組骨折區(qū)有大量成纖維細胞，無新生骨小梁；B組開始出現(xiàn)骨小梁，可見造血細胞灶。② 第3周：A組骨基質(zhì)形成；B組可見骨性骨痂形成，有骨板形成，排列紊亂。③ 第5周：A組有板層樣骨形成，排列較紊亂；B組可見骨基質(zhì)中有大量骨細胞沉積。兩組比較結(jié)果表明，B組骨痂組織中軟骨組織形成更早，面積更大，軟骨組織向骨組織轉(zhuǎn)化的過程更快。

圖2 兩組大鼠右側(cè)脛骨骨折處組織HE染色結(jié)果比較(×200)

2.5 兩組OPN及FAK蛋白表達比較見表3。OPN、FAK蛋白表達：術(shù)后1、3、5周B組均明顯大于A組(P<0.05)；A組術(shù)后各時間點比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；B組隨時間推移逐步升高(P<0.05)。

3 討論

3.1 NGF的作用骨生物力學是骨強度、骨結(jié)構(gòu)、骨量的綜合體現(xiàn)，其性能降低是骨折發(fā)生的重要原因之一[8-10]。對骨組織在外力作用下的力學特性和骨在受力后的生物學效應進行的骨生物力學研究，是對骨質(zhì)量進行評定的一種可靠方法，可以評定骨脆性和預測骨折危險性[11-12]。研究[13-14]證實，NGF對骨的生成具有促進作用，可與成骨細胞結(jié)合，使骨愈合能力增強。而且，NGF可以抑制骨吸收，通過抑制破骨細胞分泌酸性和基質(zhì)金屬蛋白酶減少骨鈣吸收和骨膠原的降解作用，保持骨的機械性能和生物功能。本研究中，B組最大載荷、彈性載荷、最大撓度在術(shù)后不同時間段均高于A組，這提示脛骨骨折經(jīng)過NGF干預后，脛骨承受外力的能力和抵抗骨折的能力都得到提高。有研究[15]在治療大鼠肋骨骨折時發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過NGF干預后，骨痂生成增多，骨痂的剛度和抗折彎強度增加，促進了骨折的愈合。BMD是骨質(zhì)量的重要衡量指標，骨質(zhì)量具有較強的促進骨折愈合的作用，在骨折的早、中、晚期均可以有效縮短骨折愈合時間，提高愈合質(zhì)量。NGF能夠促進骨折愈合，促進骨痂中膠原的吸收[16]。初步的臨床研究[17]也證明，NGF可加快骨折患者的愈合過程。本研究中，與A組相比，B組在骨折后各時間段BMD升高，BMC下降，提示在經(jīng)過NGF的干預后，調(diào)控了BDM、BMC水平，提高了骨質(zhì)量，促進了骨折愈合。此外，X線片結(jié)果與HE染色結(jié)果均顯示，B組大鼠骨折愈合更快，更早地完成了骨痂重塑，且愈合過程中形成的骨痂更大，這也證實了NGF可加快骨折愈合。

表3 兩組大鼠OPN及FAK蛋白表達比較

3.2 OPN的作用生理狀態(tài)下，骨形成和骨吸收處于平衡狀態(tài)，當失去平衡時，就有可能出現(xiàn)骨代謝相關(guān)的疾病。OPN是一種廣泛存在于人體組織中的多功能磷酸化蛋白，是分泌型磷酸化糖蛋白的一種，廣泛分布在細胞間質(zhì)，參與體內(nèi)的多個代謝過程，能調(diào)節(jié)多種細胞因子的分泌和表達，參與細胞的增殖和分化，在組織細胞中的分布具有特異性，且在骨代謝中有著重要作用[18-19]。OPN能夠?qū)γ氀艿纳L產(chǎn)生促進作用，使成骨細胞從活躍生長狀態(tài)向成熟狀態(tài)轉(zhuǎn)化。楊渝勇 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，OPN是皮質(zhì)骨骨折的重要影響因子，骨中OPN水平的降低可增加髖部脆性骨折的發(fā)生。本研究中，B組術(shù)后不同時間段OPN、FAK蛋白表達均大于A組，這提示NGF可能是通過調(diào)控OPN、FAK水平作用于骨形成細胞，促進軟骨及成骨細胞增殖、分化從而促進骨愈合。

綜上所述，NGF可以提高脛骨的最大載荷、彈性載荷、最大撓度，提高抵抗骨折的能力，減少骨折的發(fā)生，同時還可提高OPN的表達水平，為骨折治療的臨床研究提供了新思路。本研究不足：僅從骨生物力學和骨強度方面觀察NGF對骨愈合的影響，對骨折6周后的情況及不同劑量對骨折愈合的影響也未做進一步觀察；NGF對骨痂組織的成分和結(jié)構(gòu)等方面的影響及其影響機制還有待進一步的研究。