黃連木多倍體誘導(dǎo)及鑒定1)

李娟娟 鄧偉 許澤楠 張子君 路丙社

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，保定，071000)

黃連木(Pistaciachinensis)是漆樹(shù)科黃連木屬的落葉喬木，其樹(shù)形高大優(yōu)美，枝繁葉茂，樹(shù)冠開(kāi)闊，種子含油率高，是極具開(kāi)發(fā)應(yīng)用的鄉(xiāng)土園林綠化樹(shù)種和木本油料樹(shù)種[1-2]。目前，有關(guān)黃連木的研究主要集中在資源分布[3-4]、生理特性[5-6]、病蟲(chóng)害防治等方面[7]，而有關(guān)黃連木多倍體誘導(dǎo)和新品種培育的研究報(bào)道較少。

多倍體誘導(dǎo)是培育新品種的主要方法，已在花卉、農(nóng)作物以及果樹(shù)等方面廣泛應(yīng)用[8-10]。多倍體誘導(dǎo)的藥劑通常有秋水仙素[11]、胺磺靈[12]等，誘導(dǎo)材料有萌動(dòng)的種子、莖尖、愈傷組織等[13]。Yunus A et al.用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%的秋水仙素浸泡黃花蒿(Artemisiaannua)種子2 h后出現(xiàn)了多倍體植株[14]；孔維一等[8]用秋水仙素處理一串紅(Salviasplendens)的莖尖成功獲得了四倍體植株；周慧文等[15]以木薯(ManihotesculentaGrantz)組培苗單芽莖段為材料，通過(guò)離體誘導(dǎo)成功得到了10個(gè)同源四倍體木薯株系的四倍體植株。大量研究表明，秋水仙素是較好的多倍體誘變劑，不同的植物材料及處理部位對(duì)秋水仙素的敏感程度不同，萌動(dòng)的種子誘變效果較好。程志號(hào)等[16]用5 g/L秋水仙素浸漬火龍果(Pitayapitahaya)萌動(dòng)種子24 h多倍體的誘導(dǎo)率最高；潘宏兵等[17]用0.3%的秋水仙素處理石榴(Punicagranatum)萌發(fā)種子24 h四倍體的誘導(dǎo)率最高。本文以黃連木萌動(dòng)種子為材料，利用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的秋水仙素進(jìn)行不同時(shí)間的誘變處理，以期獲得人工誘變四倍體植株，構(gòu)建黃連木多倍體誘導(dǎo)技術(shù)體系，為黃連木新品種選育提供種質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

種子于2020年9月采自河北省唐縣同一母株(2n=30)。2020年12月中旬對(duì)種子進(jìn)行沙藏處理，2021年3月將種子取出，待萌動(dòng)種子達(dá)到70%時(shí)進(jìn)行處理。

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與處理

參照張虹等[18]的方法,在通風(fēng)櫥搖床上分別用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%、0.2%、0.3%的秋水仙素溶液浸泡萌動(dòng)黃連木種子，浸泡時(shí)間為12、24、36、48 h，每處理50粒種子，3次重復(fù)，以無(wú)菌水浸泡為對(duì)照(CK)。處理結(jié)束后自來(lái)水沖洗4～5次，播于穴盤內(nèi)。之后再將幼苗移植于20 cm×22 cm的無(wú)紡布袋中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2 指標(biāo)測(cè)定方法

出苗率、成苗率和半致死質(zhì)量分?jǐn)?shù)的計(jì)算。參照熊運(yùn)海等[19]的方法，于種子播于穴盤20 d后統(tǒng)計(jì)出苗率、相對(duì)出苗率，50 d后統(tǒng)計(jì)計(jì)算成苗率。參照李映樂(lè)等[20]的方法計(jì)算半致死質(zhì)量分?jǐn)?shù)，在Excel表中導(dǎo)入秋水仙素質(zhì)量分?jǐn)?shù)和相對(duì)出苗率，創(chuàng)建質(zhì)量分?jǐn)?shù)-相對(duì)出苗率的線性回歸方程。

誘導(dǎo)率的計(jì)算。幼苗生長(zhǎng)2個(gè)月后，以未處理的植株為對(duì)照，挑選莖粗、葉面積變大、節(jié)間距變短的植株作為變異株，計(jì)算誘導(dǎo)率。誘導(dǎo)率=(變異植株數(shù)/成活植株數(shù))×100%。

細(xì)胞學(xué)鑒定。參考王煒等[11]的方法進(jìn)行壓片。使用Leica DM4000顯微鏡觀測(cè)黃連木染色體的數(shù)量并拍照記錄。

流式細(xì)胞儀鑒定。參照徐鵬飛等[21]方法。選取葉色加深、葉片加大加厚等有明顯表型變異的植株，取幼嫩新鮮葉片加入細(xì)胞解離液用刀片快速將葉片剁碎，過(guò)濾染色5 min后在LSRFortessa流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè)。

氣孔和保衛(wèi)細(xì)胞大小測(cè)定。參考謝兆森等[22]采用指甲油涂抹撕取法。用Olympus BH-2光學(xué)顯微鏡在40倍物鏡下觀測(cè)氣孔和保衛(wèi)細(xì)胞的長(zhǎng)度和寬度，并統(tǒng)計(jì)氣孔數(shù)量。

株高和葉形指數(shù)的測(cè)定。選取二倍體和四倍體植株各5株，分別測(cè)量它們的株高、葉長(zhǎng)、葉寬和葉片厚度；并各選取5片葉子用Digimizer軟件測(cè)量它們的面積。

葉片色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)和凈光合速率的測(cè)定。參照鄒琦[23]的方法用體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇提取法進(jìn)行測(cè)定。參照賈文飛等[24]的方法，在晴天09:00—11:00選取長(zhǎng)勢(shì)良好的二倍體和四倍體植株各3株，然后每株選取中部的成熟葉片使用CIRAS-3便攜式光合測(cè)定系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Duncan法進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)秋水仙素對(duì)黃連木種子誘導(dǎo)的影響

由表1可知，黃連木種子的出苗率、相對(duì)出苗率和成苗率均與處理質(zhì)量分?jǐn)?shù)和時(shí)間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，而誘導(dǎo)率隨著時(shí)間和質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而逐漸升高。在同一處理時(shí)間下，隨著處理溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，出苗率、相對(duì)出苗率和成苗率逐漸降低；在同一處理質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，隨著處理時(shí)間增加出苗率、相對(duì)出苗率和成苗率逐漸降低。且處理質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，處理時(shí)間越長(zhǎng)，降低地越快。如在處理時(shí)間為48h時(shí)，各處理質(zhì)量分?jǐn)?shù)下的出苗率從54.67%下降到16.00%，相對(duì)出苗率從99.99%下降到36.36%，成苗率從54%下降到14%；在0.3%處理質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，出苗率從28%下降到16%，相對(duì)出苗率從51.22%下降到36.36%，成苗率從23.33%下降到14.00%。由此可知，處理時(shí)間越長(zhǎng)，處理溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，秋水仙素的毒害作用越大，出苗率、相對(duì)出苗率和成苗率就越低，而誘導(dǎo)率在0.3%質(zhì)量分?jǐn)?shù)下處理48 h達(dá)到最大值38.10%。因此，從黃連木的變異率來(lái)看，0.3%的秋水仙素溶液處理48 h為最佳組合。

表1 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)秋水仙素處理對(duì)黃連木種子的誘變效果

以秋水仙素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為自變量x，以相對(duì)出苗率為因變量y，得到關(guān)于兩者的多項(xiàng)式回歸方程，如表2。在處理時(shí)間12、24、36、48 h下的半致死質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.31%、0.25%、0.23%、0.18%。

表2 秋水仙素處理黃連木種子的半致死質(zhì)量分?jǐn)?shù)

2.2 誘變株的篩選與鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

誘變株與對(duì)照株形態(tài)特征的比較如表3所示。由表3可知，誘變株的莖粗比對(duì)照株增加了27.15%，與對(duì)照株相比有極顯著差異(P<0.01)，推測(cè)秋水仙素加倍成功的植株比對(duì)照株的莖粗大；誘變株的節(jié)間距比對(duì)照株小73.01%，與對(duì)照株相比有極顯著差異(P<0.01)，推測(cè)秋水仙素有縮短植株節(jié)間距的作用；誘變株的葉面積比對(duì)照株大48.07%，且與對(duì)照株相比有極顯著差異(P<0.01)，推測(cè)秋水仙素加倍成功的植株其葉面積較大。

2.2.2 根尖染色體計(jì)數(shù)鑒定

通過(guò)壓片法對(duì)對(duì)照(二倍體)和誘變株進(jìn)行染色體數(shù)目觀察(如圖1)。由圖1可知，黃連木二倍體植株的染色體數(shù)為2n=30條，加倍成功的染色體數(shù)為4n=60條。

表3 黃連木誘變株與對(duì)照株形態(tài)特征的比較

2.2.3 不同倍體細(xì)胞DNA含量比較

流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞DNA含量的結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，誘變植株的細(xì)胞DNA含量與對(duì)照植株(二倍體)存在明顯差異。對(duì)照植株(二倍體)熒光強(qiáng)度吸收主峰在50k(k=1 000)左右(圖2a)，四倍體熒光強(qiáng)度吸收主峰在100k左右(圖2b)，是對(duì)照植株(二倍體)細(xì)胞DNA含量的2倍，非整倍體在50k和100k左右均出現(xiàn)吸收主峰的部分植株(圖2c)。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)倍性，除去出現(xiàn)雙峰的非整體植株，共獲得8株四倍體植株。

2.3 二倍體和四倍體植株的比較

氣孔和保衛(wèi)細(xì)胞大小。二倍體和四倍體的氣孔及保衛(wèi)細(xì)胞如表4及圖3。由表4此可知，四倍體的氣孔長(zhǎng)是二倍體氣孔長(zhǎng)的38.19%，氣孔寬是二倍體的61.38%，保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)是二倍體的35.35%，保衛(wèi)細(xì)胞寬是二倍體的63.31%，氣孔數(shù)量是二倍體的89.52%。二者之間均存在極顯著差異(P<0.01)。

由圖3可知，秋水仙素處理得到的四倍體植株的氣孔和保衛(wèi)細(xì)胞都比二倍體的大，單位面積內(nèi)的氣孔數(shù)量比二倍體植株的少。

表4 氣孔及保衛(wèi)細(xì)胞大小的比較

二倍體和四倍體植株株高和葉形指數(shù)。由表5可知，秋水仙素對(duì)植株有矮化作用,四倍體植株的株高比二倍體植株小，同比減少了35.88%，且兩者有極顯著差異(P<0.01)；四倍體植株的葉長(zhǎng)與二倍體植株的葉長(zhǎng)無(wú)顯著差異(P>0.05)；四倍體植株比二倍體植株的葉寬大，同比增加了53.42%，有極顯著差異(P<0.01)；四倍體植株的葉面積較二倍體植株大，同比增加了95.08%，且有極顯著差異(P<0.01)；四倍體植株比二倍體植株的葉片厚，同比增加了72.95%，且有極顯著差異(P<0.01)。

表5 二倍體和四倍體植株株高和葉形指數(shù)的比較

二倍體植株與四倍體植株的葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)和凈光合速率如表6所示。四倍體植株的葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)和光合速率均高于二倍體植株，分別是二倍體植株的1.8和2.6倍，說(shuō)明四倍體植株的葉片具有更好的光合特性。

表6 二倍體和四倍體植株葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)和凈光合速率的比較

3 討論

秋水仙素是誘導(dǎo)多倍體最有效的方法之一，適宜質(zhì)量分?jǐn)?shù)和處理時(shí)間可成功誘導(dǎo)出多倍體植株，質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)高時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)增加材料的死亡率，通常認(rèn)為在半致死質(zhì)量分?jǐn)?shù)下的誘導(dǎo)率最高。李映樂(lè)等[20]用秋水仙素溶液浸泡人參果組培苗時(shí)發(fā)現(xiàn)0.2%和0.4%處理26 h死亡率都達(dá)到100%，0.2%處理18 h的變異率最高，為53.33%，成活率為50%，接近半致死質(zhì)量分?jǐn)?shù)；潘紅兵等[17]用0.3%的秋水仙素溶液浸泡萌動(dòng)紫美石榴萌動(dòng)種子時(shí)發(fā)現(xiàn)處理時(shí)間為36 h時(shí)成活率最低為67.22%，篩選的最佳處理為0.3%的秋水仙素溶液處理24 h，四倍體誘導(dǎo)率為1.11%；張虹等[25]的研究結(jié)果表明，0.1%的秋水仙素處理24 h黑果枸杞萌動(dòng)種子的誘導(dǎo)率最高為33.33%。而本研究的結(jié)果表明，通過(guò)回歸方程計(jì)算在12、24、36和48 h下的半致死質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.31%、0.25%、0.23%和0.18%；0.3%的秋水仙素溶液浸泡48 h誘導(dǎo)效果最佳，其誘導(dǎo)率可達(dá)38.10%。

多倍體的鑒定方法主要有形態(tài)學(xué)鑒定、細(xì)胞學(xué)鑒定、流式細(xì)胞儀鑒定及生理生化法鑒定[26]。形態(tài)學(xué)鑒定依據(jù)植株的莖粗、節(jié)間距以及葉面積等進(jìn)行鑒定，本研究初步從形態(tài)學(xué)對(duì)誘變株進(jìn)行了篩選，獲得了節(jié)間距短、莖粗較粗、葉面積較大的變異株，與任雪羽等[27]的形態(tài)學(xué)篩選方法一致。后期鑒定誘變成功的四倍體植株株高較矮、葉片較寬較厚。四倍體植株的株高普遍比對(duì)照株矮，這可能是因?yàn)樵谇捌谏L(zhǎng)的過(guò)程中，秋水仙素具有毒性所以四倍體植株生長(zhǎng)速度緩慢，待后期恢復(fù)生長(zhǎng)后則會(huì)迅速超越對(duì)照株的生長(zhǎng)速度。形態(tài)學(xué)的鑒定方法簡(jiǎn)單快捷，但結(jié)果不會(huì)太準(zhǔn)確，因此還需進(jìn)一步進(jìn)行鑒定。

染色體計(jì)數(shù)可以精確直觀地鑒定出植株的倍性。本研究在形態(tài)學(xué)初步篩選基礎(chǔ)上，選取了表型變異的植株進(jìn)行了細(xì)胞染色體數(shù)。染色體計(jì)數(shù)分析結(jié)果表明，黃連木二倍體植株的染色體數(shù)2n=30，四倍體植株的染色體數(shù)4n=60，四倍體植株的染色體數(shù)(2n=60)是二倍體植株(2n=30)的2倍。但黃連木的染色體較小，在制片時(shí)難以壓到同一個(gè)平面上，計(jì)數(shù)困難。而流式細(xì)胞儀可簡(jiǎn)單快捷準(zhǔn)確地鑒定出植株的倍性，且已被廣泛應(yīng)用于植株的倍性鑒定[25，27-28]。本研究對(duì)變異植株的流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果表明，誘變植株群體有二倍體、混倍體和四倍體3種類型。二倍體植株的DNA相對(duì)含量在50k處有一道峰值，四倍體植株的DNA相對(duì)含量在100k處有一道峰值，而嵌合體植株的DNA相對(duì)含量在50k和100k處均有峰值。

氣孔密度、保衛(wèi)細(xì)胞大小以及光合速率高低是鑒定多倍體的常用指標(biāo)。與黃連木二倍體植株相比，本研究鑒定的四倍體植株具有氣孔密度變小、保衛(wèi)細(xì)胞變大的特點(diǎn)[29]。四倍體植株葉片葉綠素含量和凈光合速率均顯著高于二倍體植株，說(shuō)明上述形態(tài)和生理指標(biāo)均可用于黃連木誘變植株的多倍體鑒定[30-32]。

4 結(jié)論

多倍體育種是一種創(chuàng)建新種質(zhì)資源的重要方法。本研究利用秋水仙素對(duì)黃連木萌動(dòng)種子進(jìn)行誘變處理，通過(guò)形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)和流式細(xì)胞儀等方法對(duì)處理后的植株進(jìn)行了多倍體鑒定。結(jié)果表明，0.2%的秋水仙素溶液浸泡36 h和0.3%的秋水仙素溶液浸泡12 h為誘導(dǎo)黃連木萌動(dòng)種子的最佳組合。成功誘導(dǎo)鑒定的8株四倍體變異株與二倍體植株相比，表現(xiàn)為莖變粗、節(jié)間縮短、葉色加深、葉片增大增厚，氣孔變大、密度變小，葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加和光合速率增大的特征。綜上，用秋水仙素處理黃連木萌動(dòng)種子可成功誘導(dǎo)出黃連木四倍體植株，此方法可為黃連木四倍體新品種的選育提供參考。