基于模糊數(shù)學(xué)評價的黑枸杞百香果乳飲料研制及抗氧化性研究

賈慶超，朱 玲

（鄭州科技學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院，河南 鄭州 450064）

百香果（Passionis fructum）含有蛋白質(zhì)、脂肪、糖類和多種維生素及氨基酸等，營養(yǎng)豐富，具有“果汁之王”美稱，含有豐富的膳食纖維和豐富的維生素，具有通便潤腸，清熱解毒，提高身體的免疫力以及美容養(yǎng)顏等功效[1-3]。百香果在食用后，給人一種飽腹感，可以幫助減肥，同時含有很多的超纖維，具有幫助人體排除毒素，防治胃腸炎以及痔瘡等疾病的效果，所以百香果具有一定的藥用價值[4]。黑枸杞（Nigrum wolfberry），屬茄科是中國西部的一種藥用植物，味甘，性平和，有豐富的脂肪、糖類、生物堿和維生素等各種成分，以及豐富的天然水溶性的原花青素，具有較強(qiáng)的抗氧化性，并被譽(yù)名為野生的“藍(lán)色妖姬”[5-6]。它可以延緩衰老，防治糖尿病，易溶于水，屬于天然的水溶性黃酮類降血脂，還可以作滋補(bǔ)身體、降血壓和藥用，并富含多種蛋白質(zhì)[7]。發(fā)酵乳是以生牛乳或乳粉為原料，經(jīng)殺菌、發(fā)酵后制成的pH值降低的產(chǎn)品[8]，牛乳發(fā)酵后，牛奶中的鈣被轉(zhuǎn)化為水溶性鈣，很容易被機(jī)體所吸收利用，具有增強(qiáng)人體免疫力，調(diào)節(jié)機(jī)體生理，預(yù)防疾病等保健功效。另外，由于生物體代謝可產(chǎn)生大量自由基，自由基可攻擊正常細(xì)胞甚至使細(xì)胞癌變，還會引起老年癡呆、動脈粥樣硬化和癌癥等近百種疾病，是導(dǎo)致人體衰老的主要因素，而抗氧化劑在一定程度上可清除自由基，具有自由基清除活性的抗氧化活性物質(zhì)已成為研究熱點(diǎn)[9]。

該研究以黑枸杞、百香果為主要原料制備乳飲料，采用單因素、模糊數(shù)學(xué)評價和響應(yīng)面相結(jié)合的方法，以感官評價和蛋白質(zhì)含量為標(biāo)準(zhǔn)，優(yōu)化黑枸杞百香果乳飲料的工藝條件，測定其抗氧化性能及理化、微生物指標(biāo)，可為黑枸杞發(fā)酵型乳飲料的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

百香果：市售；寧安堡黑果枸杞：寧夏寧安堡土特產(chǎn)品有限公司；新鮮牧場純牛奶：江蘇光明銀寶乳業(yè)公司；蔗糖（一級）：廣西都安永鑫糖業(yè)有限公司；復(fù)配增稠劑（食品級）BDS1005：丹尼斯克（中國）有限公司：菌種ABY-10（200 U/袋）：科漢森（北京）貿(mào)易有限公司；MRS、MC培養(yǎng)基：海博生物技術(shù)；孟加拉紅、平板計數(shù)瓊脂：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；氫氧化鈉、乙酸鉛、磷酸氫二鈉、濃硫酸、硫酸銅、氨水、鹽酸萘乙二胺、亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品、硫酸鉀、乙醚、石油醚、甲醇、乙腈、辛烷磺酸鈉（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純）：武漢中昌國研標(biāo)物科技；氯化鐵、硫酸亞鐵、雙氧水、抗壞血酸、Tris、鄰苯三酚（分析純）：天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）（分析純）：福州飛凈生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV1800紫外分光光度計：南京科捷分析儀器有限公司；Kjeltec8400全自動凱式定氮儀：丹麥福斯分析儀器有限公司；1260高效液相色譜儀、7890B氣相色譜儀：美國安捷倫有限公司；PHB-4型pH計：上海精科儀器有限公司；XG1.CD-300M臥式滅菌鍋：山東新華醫(yī)療器械有限公司；XPE205DR分析天平：瑞士梅特勒公司；N1-50全自動氮吹濃縮儀：廣州儀德精密科學(xué)儀器股份有限公司；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱：上海博訊醫(yī)療生物器械有限公司；FT1乳品快速分析儀：丹麥福斯公司；DH3600B Ⅱ電熱恒溫培養(yǎng)箱：天津市泰斯特儀器有限公司；BX53F顯微鏡：德國蔡司股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑枸杞百香果乳飲料的制備工藝及操作要點(diǎn)[10]

黑枸杞汁的制備[11-12]：選取果實比較豐富飽滿、外表無損壞的優(yōu)質(zhì)黑枸杞，將準(zhǔn)備好的黑枸杞放入純水中清洗，清洗完去除表面的灰塵。然后按照料液比1∶15（g∶mL）的比例稱質(zhì)量后煮沸，然后將料液放入破碎打漿機(jī)中打碎成漿。80目過濾塞過濾，得到枸杞汁。

百香果汁的制備：應(yīng)挑選個頭大、果實飽滿、香味濃郁、光滑，皮薄、成熟度高的果實；將選好的果實用清水反復(fù)清洗干凈，并瀝去果皮表面殘留的水分，去掉外殼；將果肉放入打漿機(jī)中打碎成漿，并放入離心機(jī)中3 000 r/min離心20 min，80目過濾塞過濾，得到百香果汁

乳飲料的制備：以乳飲料的總質(zhì)量為基準(zhǔn)，加入蔗糖和黑枸杞汁以及百香果汁，原料混勻后，將混合液在70 ℃水浴鍋中滅菌20 min，并冷卻至35～40 ℃，加入菌種ABY-10，攪拌均勻，覆蓋保鮮膜隔氧，將混合液置于40 ℃恒溫條件下發(fā)酵，待混合液由液態(tài)變?yōu)楣虘B(tài)凝乳，滴定酸度達(dá)到70 T°結(jié)束發(fā)酵。將發(fā)酵后的乳飲料放于4 ℃的冰箱中后熟24 h即得黑枸杞百香果乳飲料成品。

1.3.2 黑枸杞百香果乳飲料的感官評價標(biāo)準(zhǔn)

邀請10個專業(yè)感官評價人員對于乳飲料的氣味、滋味、狀態(tài)和色澤四個方面進(jìn)行感官評價，滿分10分，感官評價參考國標(biāo)GB 7101—2015《飲料》的方法對乳飲料進(jìn)行評價。黑枸杞百香果乳飲料感官評定標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 黑枸杞百香果乳飲料感官評價標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standards of black wolfberry passion fruit milk beverage

1.3.3 工藝條件優(yōu)化單因素試驗

設(shè)置總添加量為100%，純牛奶添加量隨其他因素添加量的改變而改變，基本條件為增稠劑的添加量均為0.06%[13]，百香果添加量為8%，蔗糖添加量為5%，菌種添加量為0.002%，發(fā)酵時間5 h，黑枸杞汁添加量為7%。

黑枸杞汁添加量分別為5%、7%、9%、11%、13%；百香果汁添加量分別為4%、6%、8%、10%、12%；蔗糖添加量分別為3%、4%、5%、6%、7%；菌種添加量分別為0.001%、0.002%、0.003%、0.004%、0.005%；發(fā)酵時間分別為4 h、5 h、6 h、7 h、8 h。

1.3.4 工藝條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計

依據(jù)單因素的試驗結(jié)果，固定黑枸杞汁的添加量為11%，選擇百香果汁添加量（A）、蔗糖添加量（B）、接種量（C）以及發(fā)酵時間（D）作為主要影響因素，以感官評分R1和蛋白質(zhì)含量R2作為主要響應(yīng)值，根據(jù)Box-behnken基本原理，運(yùn)用Design-Expert 10.0.7軟件設(shè)計響應(yīng)面試驗。響應(yīng)面試驗因素與水平見表2。

表2 黑枸杞百香果乳飲料工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗因素與水平Table 2 Response surface test factors and levels of black wolfberry passion fruit milk beverage

1.3.5 黑枸杞百香果乳飲料感官品質(zhì)的模糊數(shù)學(xué)評價法

（1）因素集和評語集的建立

以氣味、滋味、狀態(tài)和色澤為因素集，以優(yōu)、良、中、差為評語集，因素集F=（氣味，滋味，狀態(tài)，色澤），評語集為V=（優(yōu)，良，中，差）。模糊數(shù)學(xué)評價法模型為Mi=W*Fi，其中Mi是模糊數(shù)學(xué)評價集，W是權(quán)重系數(shù)，F(xiàn)i是模糊矩陣。

（2）權(quán)重集的確定

權(quán)重系數(shù)的確定由10位感官評價人員進(jìn)行，首先是用戶調(diào)查法，然后由感官評價人員根據(jù)因素的重要性采用二元對比法[14-15]，權(quán)重分布見表3。

表3 評價指標(biāo)權(quán)重系數(shù)Table 3 Weight coefficient of evaluation index

1.3.6 抗氧化性的測定

DPPH·清除率的測定：待測樣液的配制參考李靜等[9]的方法，將發(fā)酵前和發(fā)酵后樣液分別稀釋至原濃度的5%、25%、50%、75%、100%（即待測樣液體積分?jǐn)?shù)分別為0.05 mL/mL、0.25 mL/mL、0.50 mL/mL、0.75 mL/mL、1.00 mL/mL），檢測及計算方法參考王文瓊等[16-17]的方法。

1.3.7 理化指標(biāo)以及微生物指標(biāo)的測定

脂肪的測定：參考GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定第三法堿水解法》；乳飲料中蛋白質(zhì)的測定：參考GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定第一法凱氏定氮法》；乳飲料中乳糖、蔗糖的測定：參考GB 5413.5—2016《嬰幼兒食品和乳品中蔗糖、乳糖含量的測定第二法萊茵-埃農(nóng)氏法》；乳飲料中酸度的測定：參考GB 5009.239—2016《食品酸度的測定第一法酚酞指示劑法》；乳飲料中水分的測定：參考GB 5009.3—2016《食品中水分的測定第一法直接干燥法》；乳飲料中脂肪非脂乳固體的測定：參考GB 5413.39—2010《乳和乳制品中非脂乳固體的測定》；乳飲料中亞硝酸鹽的測定：參考GB 5009.33—2016《食品硝酸鹽與亞硝酸鹽的測定第二法分光光度計法》；三聚氰胺的檢測：參考GB/T 22388—2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法第一法高效液相色譜法》。微生物、乳酸菌測定：參考GB 4789.35—2016《食品微生物學(xué)檢驗乳酸菌檢測》；霉菌及酵母計數(shù)：參考GB 4789.15—2016《食品微生物學(xué)檢驗霉菌與酵母計數(shù)》。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

單因素試驗結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”來表示，SPSS21.0用于數(shù)據(jù)方差分析及誤差值的結(jié)果計算，Excel 2013用于誤差折線圖的繪制，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 工藝條件優(yōu)化單因素試驗

工藝條件優(yōu)化單因素試驗結(jié)果見圖1。如圖1a所示，隨著黑枸杞汁添加量的增加，感官評分變化不大，蛋白質(zhì)的含量稍有降低，但變化不大。當(dāng)黑枸杞添加量為5%時，乳飲料色澤較差，呈暗灰色，隨著黑枸杞汁的增加色澤逐漸改善，當(dāng)黑枸杞汁的添加量為11%時，感官評分最高，呈誘人的淺咖啡色，有枸杞和百香果清淡的香味，香氣協(xié)調(diào)；當(dāng)黑枸杞汁添加量＞11%時，顏色較深，色澤不佳。綜上所述，黑枸杞汁添加量對乳飲料的影響不大，綜合選擇黑枸杞汁添加量為11%。如圖1b所示，隨著百香果汁添加量的增加，蛋白質(zhì)的含量逐漸降低。感官評分先上升后下降的趨勢，當(dāng)百香果汁添加量為4%時，百香果風(fēng)味較淡；當(dāng)百香果添加量為6%時，有百香果的清香味，感官評分最高；當(dāng)百香果汁添加量＞6%時，乳飲料呈酸澀味，且隨著百香果汁的增加，澀味增加，光澤也逐漸降低，故選擇百香果汁添加量為6%。如圖1c所示，隨著蔗糖量的增加，感官評價先增加后降低，當(dāng)蔗糖量達(dá)到6%時，乳飲料的感官評價達(dá)到最高，此時蛋白質(zhì)的含量相對較高，當(dāng)蔗糖的含量低于或高于6%時，乳飲料的甜味不協(xié)調(diào)，感官評價相對偏低?？赡苁翘怯昧窟^多，產(chǎn)品甜感明顯，百香果味易被掩蓋，百香果特點(diǎn)不突出[18-19]。綜合選擇蔗糖添加量為6%。如圖1d所示，隨著接種量的增加，感官評價先增加后降低，當(dāng)接種量達(dá)到0.003%時，其感官評價達(dá)到最大，蛋白質(zhì)含量此時也相對偏高一些。當(dāng)添加量少于這個添加量時，乳飲料狀態(tài)不好，稍有乳清析出，添加量大于這個數(shù)值時，乳飲料偏酸，影響感官評價。接種量過低時，由于其基數(shù)少，菌的數(shù)量增加相對緩慢；接種量過高時，由于較高酸度又會抑制乳酸菌的繼續(xù)繁殖與生長[20-21]。選擇的接種量為0.003%。如圖1e所示，隨著產(chǎn)品發(fā)酵時間的延長，感官評價先增加后降低，發(fā)酵時間過短，乳酸菌生長繁殖不充分[21]，長時間的發(fā)酵使乳飲料的酸度增高[22]，其影響乳飲料的口感，當(dāng)乳飲料的發(fā)酵時間到達(dá)6 h時，感官評價達(dá)到最高值，發(fā)酵時間5 h、6 h、7 h時，蛋白質(zhì)含量變化較小。綜合選擇，最佳發(fā)酵時間為6 h。

圖1 工藝條件優(yōu)化單因素試驗結(jié)果Fig .1 Results of single factor tests for technology conditions optimization

2.2 工藝條件優(yōu)化響應(yīng)面優(yōu)化試驗

根據(jù)1.3.4進(jìn)行響應(yīng)面試驗，感官評價人員對各因素投票數(shù)見表4，響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表5。

表4 感官評價票數(shù)結(jié)果分布Table 4 Distribution of vote results of sensory evaluation

續(xù)表

將表4中的數(shù)據(jù)建立模糊評價矩陣，以1號產(chǎn)品為例，其模糊矩陣為：

將1號樣品各因素的得票數(shù)除以10，比如滋味優(yōu)、良、中、差得票數(shù)分別為5、3、1、1，即可得矩陣中第一行滋味為（0.5，0.3，0.1，0.1），同理，第二、三、四行氣味、色澤和狀態(tài)分別為（0.4，0.3，0.2，0.1）、（0.4，0.5，0.1，0）、（0.6，0.2，0.1，0.1），由此可得到上矩陣F1。同理，可以依次得到F2-F29。根據(jù)模糊數(shù)學(xué)計算原理，按照前1.3.5中模糊數(shù)學(xué)評價方法，1號樣品感官評分結(jié)果根據(jù)矩陣乘法計算M1=W×F1=（0.478，0.317，0.125，0.08），將優(yōu)、良、中、差四個等級分別賦值為9分、8分、7分、6分，M1中計算出來的各個數(shù)值分別乘以相應(yīng)賦值，再相加，即1號樣品感官評分為0.478×9+0.317×8+0.125×7+0.08×6=8.193，同理可以計算出2～29號樣品的感官得分。

利用響應(yīng)面軟件Design-Expert 10.0.7對試驗數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行了多元回歸擬合，結(jié)果見表5。所獲得的響應(yīng)值R1感官評價和R2蛋白質(zhì)含量的回歸模型方程分別是：

表5 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 5 Design and results of response surface experiments

對以感官評分為評價指標(biāo)的回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表6。

表6 以感官評分為評價指標(biāo)的回歸模型方差分析結(jié)果Table 6 Variance analysis results of regression model with sensory score as evaluation index

由表6可知，模型的P＜0.000 1且其失逆項P=0.155 9＞0.05，說明此模型是極顯著且數(shù)據(jù)具有較高的可靠性[19-20]；R2=0.999 7，說明此模型的可信度極高，擬合度較好，且R2Adj=0.999 4，說明有99.94%的試驗符合該模型[23-24]，CV%=0.15，遠(yuǎn)小于5%，說明此模型的重現(xiàn)性極好[24]，綜合以上說明，此模型完全可以用來評價此次試驗結(jié)果且較合理。根據(jù)P值大小，同時由表中F值的大小可知，A、B、C、D對試驗結(jié)果影響大小順序為D＞A＞B＞C。一次項A、B、C、D和二次項AB、AC、AD、BC、BD、A2、C2、D2均影響極顯著，二次項B2影響顯著，響應(yīng)面圖如圖2所示。

響應(yīng)面越陡峭，表明該因素對實驗結(jié)果影響越顯著[25]。由圖2可知，CD、AD響應(yīng)面最陡峭，影響最顯著，同時在任意二者的交互響應(yīng)面圖上也可以看出，響應(yīng)值均存在一個極大值，說明此模型數(shù)據(jù)合理。等高線呈現(xiàn)橢圓形，二者存在交互作用。從等高線以看出，任意二者之間均存在一定的交互作用，且交互作用顯著（P＜0.05）。該結(jié)果與方差分析結(jié)果一致。

圖2 各因素交互作用對感官評分影響的響應(yīng)面及等高線Fig.2 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on sensory evaluation

經(jīng)過Design-Expert 10.0.7綜合優(yōu)化，黑枸杞百香果乳飲料的最佳工藝條件為：百香果汁添加量4.70%，蔗糖添加量6.90%，菌種接種量0.002 8%，發(fā)酵時間6.52 h。在此優(yōu)化條件下，感官評分理論值為8.999分，蛋白質(zhì)含量理論值為3.09 g/100 g?？紤]到實際操作可行性，將優(yōu)化工藝條件調(diào)整為：百香果汁添加量5%，蔗糖添加量7%，菌種接種量0.003%，發(fā)酵時間6.5 h。在此優(yōu)化條件下進(jìn)行3次平行驗證試驗，感官評分實際值為8.96；蛋白質(zhì)含量實際為3.08 g/100 g，與預(yù)測值接近，說明該模型可以用于優(yōu)化此乳飲料工藝條件。

2.3 抗氧化性的測定

乳飲料發(fā)酵前后的抗氧化性測定結(jié)果見圖3。由圖3可知，黑枸杞百香果乳飲料在發(fā)酵前和發(fā)酵后對DPPH·清除率均隨著體積分?jǐn)?shù)的增大而增大，呈現(xiàn)正相關(guān)的量效關(guān)系，原紅霞等[26]提煉花青素的抗氧化性與濃度之間亦是線性的量效關(guān)系。由圖3還可以看出，發(fā)酵后對DPPH·清除率比發(fā)酵前有提升，這是因為發(fā)酵過程花青素含量雖然沒有變化[27]，但是發(fā)酵卻引起了異黃酮和酚類物質(zhì)的增加[28]，因此發(fā)酵促使乳飲料對DPPH·清除率提升，發(fā)酵液發(fā)酵前和發(fā)酵后對DPPH·的清除率分別達(dá)到71.5%和73.7%。

圖3 黑枸杞百香果乳飲料對DPPH自由基清除率的清除效果Fig.3 DPPH free radical scavenging effect of black wolfberry passion fruit milk beverage

2.4 黑枸杞百香果乳飲料品質(zhì)

感官品質(zhì)：黑枸杞百香果乳飲料有百香果和黑枸杞的清香，并且有乳飲料特有的風(fēng)味，有均勻的淡黃色，有光澤，酸甜合適，入口有黑枸杞百香果清香，質(zhì)地均勻，良好，無乳清。符合國標(biāo)要求。

理化指標(biāo)：脂肪3.35 g/100 g蛋白質(zhì)3.08 g/100 g，酸度75.5 T°，亞硝酸鹽0.003 86 g/100 g，乳酸菌1.36×109CFU/mL，乳糖4.86 g/100 g，非脂乳固體7.8 g/100 g，灰分0.623 g/100 g，總固形物含量18.23 g/100 g。三聚氰胺未檢出。

微生物指標(biāo)：大腸菌群及致病菌未檢出。

黑枸杞百香果乳飲料的感官、理化及微生物指標(biāo)均符合國標(biāo)GB 19302—2010《飲料》的要求。

3 結(jié)論

以百香果、黑枸杞和純牛奶為原料制備乳飲料，利用單因素、模糊數(shù)學(xué)評價和響應(yīng)面法，優(yōu)化黑枸杞百香果乳飲料的工藝條件，并測定其抗氧化性。黑枸杞百香果風(fēng)味乳飲料的最佳工藝條件為：純牛奶77%，百香果汁5%，黑枸杞汁11%，蔗糖7%，增稠劑0.06%，菌種0.003%，發(fā)酵時間6.5 h。此優(yōu)化條件下，乳飲料感官評分8.96分，蛋白質(zhì)含量3.08 g/100 g。抗氧化性結(jié)果表明，黑枸杞百香果乳飲料發(fā)酵后對DPPH·的清除率為73.7%，具有一定的抗氧化性能。微生物和理化檢測結(jié)果為均符合國標(biāo)相關(guān)要求。此配方得到的乳飲料呈淡黃色，具有良好的組織狀態(tài)，無乳清析出，不分層，具有百香果和黑枸杞的清香，并具有乳飲料特有的風(fēng)味，酸甜比例合適。